专利名称：用于检测磺胺类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能识别磺胺类药物的单克隆抗体和一种用于检测磺胺类药物的酶联免疫分析方法(ELISA)与试剂盒。
背景技术：
磺胺类药物是一类化学合成抗菌药，为畜禽抗感染治疗中的重要药物之一。由于不遵守休药期，造成了磺胺类在可食性动物组织中残留，这对人类健康造成严重威胁。研究表明体内残留过多的磺胺药可能引起过敏反应，容易引起耐药菌的产生等。因此，如何控制磺胺类残留仍然是当前亟待解决的问题，有关部门规定了动物源性食品中磺胺类药物的最大残留限量为ΙΟΟμ g/kg。磺胺类药物残留的检测方法主要有微生物法、仪器法、免疫法。微生物法敏感性差，耗时较长，且易受到其他抗生素的干扰；仪器法灵敏度高，特异性强，已逐渐成为残留分析主流方法，但是主要用于药物的确证，而且仪器昂贵，要求有技术的检测人员，不适用广泛推广；免疫分析法是以抗原抗体结合反应为原理，在简化前处理和分析过程、降低检测成本方面具有特殊意义，特别是酶联免疫测定法的出现和使用，大大提高了残留分析的效率， 已经迅速发展成为大量样品的快速筛选方法。酶联免疫方法是基于对药物有识别能力的抗体。磺胺类药物抗体的制备主要是针对单个的磺胺类药物，通过N4端芳香氨基与载体蛋白连接，暴露出NI端不同的R基团， 例如制备磺胺喃唳、磺胺喹恶啉等药物的抗体。当保留磺胺类药物的共同结构对氨基苯磺酰胺不变，在NI端通过R基团连接载体蛋白，免疫后却没有得到对常用磺胺类药物敏感的抗体。Sheth和Sporns(1991)合成了具有磺胺噻唑衍生物结构的半抗原,得到的多克隆抗体对9种磺胺药物的IC5tl值低于5mg/L。Assi (1992)又合成了具有偶氮基团的磺胺吡啶衍生物，得到的多克隆抗体对7种磺胺的IC5tl值低于10mg/L。Muldoon (1999)采用N-磺胺-4-氨基苯甲酸-载体蛋白复合物免疫小鼠，得到的单克隆抗体对磺胺硝苯，磺胺吡啶和磺胺噻唑的IC5tl分别为I. 41,22. 8、322μ g/L。Cliquet (2003)采用了氨苯磺胺直接和蛋白相连，获得的抗体效价较低，只能识别合成的半抗原，对原型药物没有结合。Franek(2006) 为了得到族特异性的抗体，合成了几种单环和双环半抗原分子，由双环抗原得到的抗体建立的直接ELISA方法对15种磺胺药物的IC5tl低于100 μ g/L。Zhang (2006)使用两种磺胺母核结构的半抗原连接蛋白，得到的多克隆抗体，在直接竞争ELISA方法中，11种磺胺药在 ΙΟΟμ g/L以下有50%抑制率。Adrian (2009)获得的多克隆抗体，能够在MRL水平以下，同时检测牛奶中10种磺胺类药物。可见，现有酶联免疫法在磺胺类药物残留检测的应用主要是针对单个磺胺类药物，商品化试剂盒较多，而磺胺类药物种类多，如果能够建立一种同时检测多个磺胺类药物残留的酶联免疫方法，将大大减少工作量，更有应用价值。目前，国内外对磺胺类药物多残留免疫方法的研究大多处于实验室阶段，建立的ELSIA方法大多数基于多克隆抗体，变异性较大，不够稳定，制备的单克隆抗体亲和力较差，对大多数磺胺类药物识别能力不够。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能识别多种磺胺类药物的单克隆抗体。本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能用于磺胺类药物检测的酶联免疫方法。本发明的第三个目的是提供适用于磺胺类药物检测的试剂盒。本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测磺胺类药物的酶联免疫试剂盒中的应用。本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在检测动物组织磺胺类药物残留中的应用。本发明通过以下技术方案实现一种能识别磺胺类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO C201148的杂交瘤细胞4E5所分泌的。上述杂交瘤细胞4E5，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO C201148o所用的免疫原是由半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备的。进一步，本发明提供了一种适用于磺胺类药物检测的酶联免疫方法，该方法包括免疫原、包被原和抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤，具体如下(I)将半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原；(2)将半抗原磺胺嘧啶(H3)与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201148的杂交瘤细胞4E5 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201148的杂交瘤细胞4E5制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)将待测样品用磷酸盐缓冲液(PBS，pH8-9)提�。胄暮笕∩锨澹玫酱馕铮�(7)对步骤￠)的待测物进行酶联免疫检测，步骤(6)磷酸盐缓冲液(pH8_9)的配制方法为准确称取KH2PO4 O. 41g, K2HPO4 5. 59g加双蒸水至1000mL。本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测多种磺胺类药物的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对多种磺胺类药物的酶联免疫检测。本发明的有益效果是(I)本发明制备的单克隆抗体能够识别16种磺胺类药物，现有技术中还没有抗体能识别相同种类的药物；(2)本发明建立的酶联免疫方法可以同时检测16种磺胺类药物的残留，提高了磺胺类药物的检测效率，方法适用范围广；(3)本发明涉及的样品处理方法简便，易操作，而且回收率高，准确度和精密度好。
图I为本发明的技术路线图。图2为本发明的以磺胺二甲嘧啶为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线，X轴为磺胺二甲嘧啶(SM2)标准溶液浓度对数值，Y轴为磺胺二甲嘧啶标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I免疫原和包被原的制备免疫原的制备准确称取半抗原磺胺二甲嘧啶(Hl)60mg，N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 34mg，I，3-二环己基碳二亚胺(DCC) 45mg，加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)l. 5mL溶解， 磁力搅拌下，于4°C反应18小时，过滤除去沉淀，滤液用于连接蛋白。取牛血清白蛋白IOOmg溶解于IOmL的PBS缓冲液，在磁力搅拌下，将上述滤液ImL 逐滴加入到蛋白溶液中，4°C反应21小时。将反应液装入透析袋中，于PBS缓冲液中透析3 天，每6h更换一次透析液，即得偶联物H1-BSA，作为免疫原用。包被原的制备依据上述免疫原制备步骤，将Hl换成磺胺嘧啶(H3)，BSA换成 0VA,即得偶联物H3-0VA，作为包被原用。实施例2单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的制备参照薛庆善《体外培养的原理与技术》(科学出版社2001年版)中的方法以实施例I制备的偶联物Hl-BSA为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含 IOOyg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含ΙΟΟμ g免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。在融合前3天(最好与上次免疫相隔3周以上)给免疫合格的小鼠腹腔注射含 IOOyg免疫原的蛋白溶液(不加佐剂)，强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3 5 X IO7个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合(比例为I : 10 5 : 10)。1500r/分钟离心5 分钟，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37°C水浴中，将吸有O. 8mL预温至37°C的50% PEG(购自Amersco)的ImL 刻度吸管插入到管底，60秒内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90 秒，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取IOmL预温至37°C的RPMI 1640基础培养液(购自Hyclone)沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第I分钟逐滴加入ImL (3秒/滴)，第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL (5分钟内加完)。加完第一个IOmL后，接着沿管壁补加RPMI 1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/分钟离心5分钟，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种 5块96孔细胞培养板，置于37°C 5% C02培养箱中培养。从融合当天算起为0d，前面3天尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3天每孔补加I滴HAT完全培养基(购自Amersco)并观察集落生长情况；第5天每孔吸出 1/2培养上清(100 μ L)，再加入I滴HT完全培养基(购自Amersco)；以后每隔3天同上法吸去1/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积 1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的H3-0VA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌磺胺类抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化,最终建立一株稳定分泌抗磺胺类抗体的杂交瘤细胞。对该杂交瘤细胞进行染色体计数，平均值为103. 3条，高于亲本细胞的染色体数目(SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为 58条，脾细胞染色体为40条)，说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞命名为4E5，并于2011年6月29日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO :C201148。腹水单抗制备与鉴定在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射
O.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI 1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO: C201148的杂交瘤细胞4E5扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种O. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法(朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。 采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgGl亚型。实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立3. I试剂配制碳酸盐缓冲液(pH9. 6):准确称取Na2CO3 I. 59g、NaHCO3 2. 93g，少量超纯水溶解， 定容至1000mL。洗涤液(pH7.4):准确称取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · Iffi2O 2. 90g, KC10. 20g，少量超纯水溶解，加入Tween 20 0. 50mL，定容至1000mL。磷酸盐缓冲液(ρΗ7·4):准确称取 NaCl 8. 00g, KH2PO4 0. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KCl 0. 20g,少量超纯水溶解，定容至IOOOmL0封闭液准确称取卵清蛋白10. 00g，加入磷酸盐缓冲液IOOOmL,搅拌混匀直至蛋
白完全溶解。底物混合液准确吸取底物B液(购自武汉市飞远科技有限公司)10mL，加入 100 μ L底物A液(购自武汉市飞远科技有限公司)，混匀，现配现用。终止液准确量取浓硫酸IOOmL,缓慢滴加到800mL超纯水中。3. 2方阵滴定法采用方阵滴定法初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将H3-0VA 包被原倍比稀释成32、16、8、4、2、1、0. 5,0. 25 μ g/mL,从第一至第八行依次横向加入96 孔酶标板，4°C过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μ L，37°C封闭2小时；洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成I : 1000、1 2000,1 4000,1 8000、 I 16000、I 32000、I 64000、I 128000、I 256000，从第一至第八列依次纵向加入96孔酶标板加入酶标板，37°C孵育30分钟；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液 I 5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司)100yL，37°C孵育30分钟；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100 μ L，避光显色15分钟；加入终止液 50 μ L ;用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(0D值)。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2. 0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。 结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合(8，64000)和(4，32000)。表I单克隆抗体方阵滴定
权利要求
1.一种能识别磺胺类药物的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO: C201148的杂交瘤细胞4E5所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞4E5，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO C201148o
3.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是检测磺胺类药物的酶联免疫试剂盒。
5.一种检测磺胺类药物的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下(1)将半抗原磺胺二甲嘧啶与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；(2)将半抗原磺胺嘧啶与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCCNO C201148的杂交瘤细胞4E5 ；(4)用保藏号为CCTCCNO C201148的杂交瘤细胞4E5制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将待测样品用PH8-9的磷酸盐缓冲液提�。胄暮笕∩锨澹玫酱馕铮�(7)对步骤￠)的待测物进行酶联免疫检测。
6.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测磺胺类药物的酶联免疫试剂盒中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在检测动物组织磺胺类药物残留中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别磺胺类的特异性单克隆抗体，本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞4E5所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOC201148。本发明还公开了特异性单克隆抗体、包被原、免疫原的制备方法和酶联免疫检测方法及酶联免疫分析检测试剂盒。与现有技术相比，本发明制备得到的单克隆抗体可识别多种磺胺类药物，本发明的酶联免疫检测方法及试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。
文档编号G01N33/543GK102608318SQ20121004519
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者刘振利, 周琪, 彭大鹏, 戴梦红, 潘源虎, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞, 黄玲利 申请人:华中农业大学
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