专利名称：维甲酸诱导蛋白rai16用作肝细胞癌标志物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种维甲酸诱导蛋白RAI16作为肝细胞癌标志物，在制备检测肝细胞癌的试剂或试剂盒中的应用。
背景技术：
原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是严重威胁人类生命健康的疾病。肝细胞癌恶性程度高，容易复发和转移，预后差，而且早期诊断较困难，往往延误了最佳治疗时期。我国是肝癌高发国家，每年约11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌严重�：ξ夜嗣裆撇踩⑶沂怯跋焐缁峋梅⒄沟囊桓鲋匾蛩�。肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血清中甲胎蛋白(Alpha fetoprotein, AFP)来确诊HCC,其敏感性、特异性及准确性均不理想，尤其对肿瘤直径小于3cm的小肝癌患者，其敏感性及阳性率更低，仅分别为33% 65%和9.1% 26% (AFP>20ug / L)。近年来已有20余种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因、尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。因此，研究和开发在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义，寻找新的在肝细胞癌中高表达的基因和/或蛋白质也具有迫切需要性。而且，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，分离和鉴定新的肝癌相关基因是肝癌基础研究中的前沿课题。维甲酸诱导蛋白RAI16 (Retinoic acid induced protein 16)的 NCBI 登录号为 NP_073586. 5，Swissprot 登录号为 Q86V87，IPI 号为 IPI00654780. 2。维甲酸诱导蛋白RAI16是维甲酸诱导产生的蛋白分子，其结构与功能目前尚未清楚。维甲酸诱导蛋白RAI16最初是在维甲酸诱导细胞分化时分离出来的，而维甲酸具有抑制细胞增殖、促进细胞调亡和促进细胞分化的作用，已被应用于急性淋巴细胞白血病、肺癌及肝癌等多种癌症的治疗(Okuno M, Kojima S，Matsushima-Nishiwaki R, Tsurumi H，Muto Y，FriedmanSLj Moriwaki H. Retinoids in cancer chemoprevention. Curr Cancer Drug Targets.2004; 4:285-98)。因此，维甲酸诱导蛋白RAI16很可能也参与一系列生理过程，在细胞增殖、分化、以及细胞凋亡等方面发挥重要作用。现有研究中，仅由Wang等发现RAI16在肝细胞再生中发挥重要作用(Wang G,Deng Jj Yang J, Zheng JJj Wang HZ, Hu Q, Zhang ZMj Chen C，Wang Dj Li ZP.Analysis on the protein structure and function of retinoic acid induced 16.World J Gastroenterol. 2007; 15:1342-1346)。此外，未发现其他关于维甲酸诱导蛋白、RAI16参与细胞功能，特别是癌症、肝细胞癌的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于维甲酸诱导蛋白RAI16的新用途。本发明通过免疫印迹实验，发现维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)。本发明通过免疫组织化学实验，验证了维甲酸诱导蛋白RAI16的确在肝细胞癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。本发明通过肝细胞癌组织芯片，对62对人肝细胞癌的癌组织与癌旁组织进行的免疫组织化学实验，进一步证实了维甲酸诱导蛋白RAI16在人类肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达(在癌组织中上调表达)。基于维甲酸诱导蛋白RAI16与肝细胞癌的这种相关性，本发明人认为RAI16可以 作为一种检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物，通过对它的表达量进行定性或定量检测，用于检测肝细胞癌。本发明的第一方面，提供了维甲酸诱导蛋白RAI16作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物的用途。本发明第二方面，还提供了维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其中的肿瘤具体指肝细胞癌。所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，是以常规方法制备抗维甲酸诱导蛋白RAI16的抗体，建立检测维甲酸诱导蛋白RAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。所述的以常规方法制备抗维甲酸诱导蛋白RAI16的抗体，常规方法可以是指用外源表达的维甲酸诱导蛋白RAI16或化学合成的维甲酸诱导蛋白RAI16多肽作为抗原免疫实验动物制备的抗体(参见《抗体制备与使用实验指南》，科学出版社，2010年)。所述的抗维甲酸诱导蛋白RAI16的抗体，包括单克隆抗体或多克隆抗体。所述的检测维甲酸诱导蛋白RAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒，具体是体外检测肝组织中维甲酸诱导蛋白RAI16的表达是否异常。体外检测肝组织中维甲酸诱导蛋白RAI16的表达是否异常，首先是检测待测肝组织中维甲酸诱导蛋白RAI16的表达量，其次是与正常肝组织中的维甲酸诱导蛋白RAI16的表达量进行比较，最后判断这种蛋白质分子标记物在待测肝细胞组织中是否均存在上调表达。所述的试剂或试剂盒，可以是酶联免疫ELISA试剂盒、化学发光法试剂盒、固态或液态芯片试剂盒，或者根据抗体包被检测抗原的方法制备的其他试剂盒。本发明第三方面，还提供了维甲酸诱导蛋白RAI16在筛选抗肿瘤药物中的应用。所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在筛选抗肿瘤药物中的应用，具体是指将待选药物用于肝癌细胞，检测维甲酸诱导蛋白RAI16的表达量是否下降。鉴于到目前为止，尚无有关维甲酸诱导蛋白RAI16与肝细胞癌的任何相关性报道。因此，本发明的这一发现将为肝细胞癌的诊断和/或治疗提供一条全新的途径。
图I为肝细胞癌患者肝组织样本中维甲酸诱导蛋白RAI16的免疫印迹检测结果，其中，P1-P18为肝细胞癌患者编号，T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织。图2为肝细胞癌患者肝组织样本中维甲酸诱导蛋白RAI16的免疫组织化学实验结果，其中，T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织，物镜放大倍数为20倍。图3为肝细胞癌组织芯片中维甲酸诱导蛋白RAI16的免疫组织化学实验结果，其中，A为高分化肝细胞癌，B为中分化肝细胞癌，C为低分化肝细胞癌；T为肝细胞癌组织，N为对应的癌旁组织，物镜放大倍数为10倍。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。在本发明的下述实施例中，使用的溶液配方如下1、裂解液50禮1^8-盐酸，150mM氯化钠，1% NP-40，ImM正矾酸钠，ImM氟化钠，2. 5mM 焦磷酸钠，ImM EDTA, pH 7. 4。2, PBS: 150mM氯化钠，IOmM氯化钾，8mM磷酸氢二钠，2mM磷酸二氢钾，pH 7. 4。3, TBST: 50mM Tris-盐酸，150mM 氯化钠，IOmM 氯化钾，0. 5% Tween-20, pH7. 4。实施例I、肝细胞癌的癌组织和癌旁组织蛋白样品的制备从东方肝胆外科医院获取18例肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织。该18例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肝细胞癌，未经化学药物和放射性治疗。18例患者的病理资料如表I所示。手术切除的新鲜组织块立即置于冰上，用预冷的PBS冲洗3次，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，而后置于细胞裂解液中，4° C裂解30分钟；在冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪间歇超声破碎2分钟后，4° C 13000g离心15分钟，取上清采用改良Bredford法进行总蛋白定量。表I、18例肝细胞癌患者的病理资料
权利要求
1.维甲酸诱导蛋白RAI16作为检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物的用途。
2.维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其中的肿瘤具体指肝细胞癌。
4.根据权利要求3所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，是以常规方法制备抗维甲酸诱导蛋白RAI16的抗体，建立检测维甲酸诱导蛋白RAI16的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒。
5.根据权利要求4所述的维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的抗维甲酸诱导蛋白RAI16的抗体，是单克隆抗体或多克隆抗体。
6.维甲酸诱导蛋白RAI16在筛选抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，肝癌的及早发现和确诊对于提高患者的生存率至关重要，而目前广泛采用检测血清中甲胎蛋白来确诊HCC，其敏感性、特异性及准确性均不理想。本发明拟在寻找在肝细胞癌中高表达的基因和／或蛋白质。本发明提供了维甲酸诱导蛋白RAI16可用作检测肝细胞癌的蛋白质分子标记物，本发明还提供了维甲酸诱导蛋白RAI16在制备肿瘤临床诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明寻找到了新的在肝细胞癌中高表达的蛋白质，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的途径。
文档编号G01N33/68GK102749453SQ20121014256
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者丁翠玲, 任浩, 戚中田, 王文, 赵兰娟 申请人:中国人民解放军第二军医大学
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