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专利名称：：戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及临床体外诊断免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：戊型肝炎病毒(h印atitisEvirus,HEV)是无包膜的单正链RNA病毒，经粪口途径传播，引起的急性戊型肝炎(hepatitisE,HE),多表现为急性黄疽型肝炎，易发展为亚急性重症肝炎或淤胆肝炎。近年来呈逐年上升趋势。患者主要为成年人，病死率较高，尤其孕期最后3个月的妊娠妇女患病后，病死率可达IO%~39%,�：ρ现�。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陆发现，中亚、东南亚、非洲、印度次大陆均有较大流行的报道。多数爆发流行为水源性的。食源性的报道亦见诸文献。我国人群戊型肝炎的感染率约18%。急性散发性肝炎中戊肝约占10%,是我国乙类法定传染病之一。在急性期血清中可测出高滴度的抗HEV-IgM,恢复期抗HEV-IgM滴度下降或消失。但取而代之的是血清中产生抗HEV-IgG。血清中抗-HEVlgM出现，是HEV急性感染和近期感染的血清学证据；具有比HEVIgG抗体更高的诊断价值，因此对戊型肝炎的早期诊断和预防有着重要意义。目前国内常用的戊型肝炎诊断方法有免疫荧光法、免疫电子显微镜、逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)、特异性抗体检测法。免疫焚光法检测肝组织中戊型肝炎病毒抗原，此方法须进行肝穿活检；免疫电子显微镜检测急性期患者的粪便及胆汁中病毒抗原或用已知患者血清中相应的抗体；逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测戊型肝炎病毒核糖核酸(HEV-RNA)。戊型肝炎病毒特异性抗体酶联免疫法检测法是目前医院主要的检测方法，其测定抗HEV-IgM具有临床意义。由于ELISA试剂方法的灵敏度不如化学发光试剂高，对HEV感染窗口期患者不能提早诊断；RT-PCR、免疫焚光法方法、免疫电子显微镜检测法，操作繁瑣，稳定性差、仪器昂贵、有局限性。鉴于此，本发明建立了一种快速、敏感、特异性、稳定性强的化学发光酶促免疫分析方法来检测戊型肝炎病毒抗体。现在，化学发光免疫分析试剂盒多为进口封闭式全自动化学发光测量系统，设备昂贵，使用成本高，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更能适合在大、中、小医院推广应用。
发明内容本发明的目的是:提供一种化学发光免疫分析测定戊型肝炎病毒IgG抗体的试剂盒。该发明试剂盒能够简便、快速、灵敏、设备简单、重复性较好、无污染能稳定地检测戊型肝炎病毒IgM抗体，并适于在产业上有效地推广应用。根据本发明的试剂盒包括戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对照品；包被固相载体；酶标记结合物；酶所作用的化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。根据本发明的试剂盒，其中，所述包被固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物液为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。本发明采用捕获夹心法原理，利用化学发光免疫分析法测定戊型肝炎IgM抗体水平的变化。包被高纯度抗人-(j链包被微孔板，酶标记特异性重组戊型肝炎病毒抗原。在包被板微孔中加入稀释的待测样本、酶标记物，温育后形成固抗体-抗体-酶标抗原的复合物，充分洗涤后加入化学发光底物液，测定其发光强度(RLU)。根据样本的RLU值随抗-IgM抗体浓度的增加而升高，从而判定戊型肝炎病毒IgM抗体在人体里的变化情况。本发明的另一目提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤l)以戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性血清制配对照品戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对血清为经HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体测定均为阴性的多份混合血清，6(TC灭活1小时，适度稀释配制(抗-HEVIgM抗体阳性效价〉1:500)2)以抗人-JLl链抗体(单抗或多抗)直接包被固相载体(微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒)用0.1MpH值为8.0的硼酸緩冲液配制成所需浓度的戊型肝炎病毒抗原包被液，并将包被液负载于固相载体上；用含O.1%酪蛋白，1°/。蔗糖，0.01%明胶，0.1%Proclin300,pH值为7.0~7.5，浓度为0.01M的磷酸盐緩冲液作为封闭液封闭上述的固相载体3)以酶标记重组戊型肝炎病毒抗原用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶偶联重组戊型肝炎病毒抗原；4)配制酶所作用的化学发光底物液；用1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺配制酶所作用的化学发光底物液。5)配制浓缩洗涤液为PBST浓缩稀液。分装上述戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对照品、酶标记的戊型肝炎病毒重组抗原、该酶所作用的化学发光底物及浓缩洗涤液；并组装为成品。本发明"戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒"可以非常专一地检测出早期感染戊型肝炎病毒后人体中的戊型肝炎病毒IgM抗体，可以根据检测戊型肝炎病毒IgM抗体变化，判断治疗效果及早期病情的变化根据本发明的试剂盒，载体上包被的抗人-ia链抗体先捕获被测样品中特异性抗体(IgM抗体)，和加入的酶标记的重组戊型肝炎病毒特异性抗原结合，形成抗原抗体复合物，因此本发明采用的"捕获夹心法"反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种反应模式还便于操作。本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而具有比酶免疫分析特异性好，灵敏度高的特点；可为戊型肝炎病毒IgM抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。具体实施例方式实施例1制备本发明的戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括抗原标记物与包被抗体的活性、栽体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使抗原标记物长期保持活性稳定的稀释液。一、辣根过氧化物酶偶联重组戊型肝炎病毒抗原制备重组戊型肝炎病毒抗原用二马来酰亚胺(Dimaleimide)偶联辣根过氧化物酶。具体操作如下将抗lgG抗体溶于0.1Mol/LPH5.0醋酸钠緩冲液并对同一緩沖液透析平衡过夜，离心除去不溶性物质，抗IgG(14mg/2ml)与10mloc-巯基乙胺在37。C温育90min。过Sephadex后浓缩使每ml含3.Omg左右的还原抗IgG。在O'C中，按1:1滴加饱和N,、N'-O-苯二马来酰亚胺溶液，混合，于3(TC温育20min,过S印hadexG25柱，除去未反应的二马来酰亚胺。收集二马来酰亚胺"活化"的抗IgG,浓缩使浓度为OD28。nm=l.0(光径lcm),取lml溶液加20ju1(5mg/ml)辣根过氧化物酶，置30。C20min,用0.10Mol/LNaOH中和后，于4'C置24h-72h，再过Sepharose-6B柱(1.5x40cm),以pH7.OPBS洗脱，收集酶结合物，加叠氮钠(NaN3)防腐，4'C保存备用。酶标记重组戊型肝炎病毒抗原浓度选定基于1000ml酶标抗原稀释液组份含量为2.9gNa2HP0412H20、0.3gNaH2P04.2H20、9gNaCl、25gBSA、lmlProclin300、lmlTween—20。将酶标记抗原结合物稀释不同的稀释度，采用方阵滴定法确定酶标抗原的工作浓度为1:6000二、戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对照的制备混合6份以上经ELISA试剂盒检测戊型肝炎病毒IgM抗体阳性血清或阴性血清，经抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体阴性血清，60。C灭活1小时，适度稀释配制(抗-HEVIgM抗体阳性效价〉l:500)，过滤除菌、分装，低温冻存。三、固相包被板的制备包被基于1000ml包被液组份含量为2.86g硼砂、4.33g硼酸，称取所需组份量放入洁净容器中双蒸水溶解混匀后，调整至PH8.0,定溶1000ml。加入适量抗人-p链抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔100uL,4'C过夜。包被微孔板为48或96孔的微孔板条。封闭每孔分别加入封闭液150j^L，4'C放置24小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2-8。C保存。基于1000ml封闭液组份含量为0.2gNaH2P04'2H20、2.9gNa2HP04.12H20、lg酪蛋白、10g蔗糖、0.lg明胶，lmlProclin300。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为7.0~7.5,定容1000ml。四、化学发光底物A液基于1000mlA液组份含量为10mM鲁米诺1.7716g、0.3mM4-羟基联苯0.051g、0.05mM4-石典苯硼酸0.012g、硼酸11.4g、硼砂4.9g。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为8.0~10.0,定容1000ml。五、化学发光底物B液基于1000mlA液组份含量为:3.5raM过氧化脲0.329g、lml0.l%Tween20、51.58gNa肌.12H20、8.74gNaH2P04.2H20、称量好各组份量力丈入洁净容器中,加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为7.0-7,6,定容1000ml。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为8.0~10.0,定容1000ml。使用时A液与B液等比例混合。六、20倍洗涤液基于1000ml20倍洗涤液各组份含量为58gNa2HP04.12H20、2gNaH2P04.2H20、160gNaCl、lmLTween-20、lmLProclin300。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为7.2~7.4，定容1000ml。七、半成品及成品纟且成上述步骤所得产品分装即为半成品。半成品经特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成戊型肝炎病毒IgM抗体测定试剂盒(化学发光法)成品。组装成成品试剂盒再经特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格后方能应用。本发明的发明人通过对试剂盒的反应模式和反应条件进行的实验研究，最终确定了捕获法夹心反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实-睑表明在加入化学发光底物液后5-25分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。实施例2~3制备本发明的戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以碱性磷酸酶标记戊型肝炎病毒重组抗原、以AMPPD作为化学发光底物、以塑料珠、塑料管作为栽体、包被液的pH值为4.5、封闭液的pH值为7.5夕卜，其余均以与实施例1相同的方法制备戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例4制备本发明的戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以磁性颗粒作为载体，用戊二醛偶联法制备磁颗�？谷�-m链抗体固相载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例5本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下1)自4'C冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。血清样本用生理盐水l:1000稀释备用。2)取出包被板条，插入板架上。3)除空白孔外，反应孔中分别加阴、阳对照品各两孔，每孔50ul,各孔加稀释后的待检样本50ul，然后每孔加酶结合物50)aL，用微量震荡器充分振荡混匀，37。C温育1小时。4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涂液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。5)各孔加化学发光底物液A、B各50pL,用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20~25。C)避光反应5分钟。6)必须于加化学发光底物液后的第5~25分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。9)CO值=2.1^，RLU值>CO值则样本判定为阳性样本；RLU值<CO值则样本判定为阴性样本。实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，见下表l:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>说明"戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒"的灵敏度、特异性、精密性以及稳定性完全符合检定要求。本发明试剂盒各项指标均达到或高于ELISA试剂的检测指标。实施例7本发明的戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒的临床应用与ELISA试剂盒比较临床医院使用实施例1的戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒和ELISA试剂盒检测临床样本662份，以对比两种试剂盒检测的符合率。一、临床血清标本的来源医院临床收集戊型肝炎病毒患者、非戊型肝炎病毒患者样本及正常人血清标本。二、使用戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒与ELISA试剂盒比较一1、方法临床分别使用本发明实施例1制备的"戊型肝炎病毒IgM抗体(抗_HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒"(按其说明书操作)和ELISA试剂盒(按其说明书操作)检测临床样本662份(急性戊肝55例、戊肝IgG抗体阳性38例、健康人421例、类风湿因子阳性血样42例、乙型肝炎阳性62例、曱型肝炎IgM抗体阳性43例)，以对比两种试剂盒检测的符合率。2、结果临床医院使用实施例1的"戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒"和ELISA试剂盒对比检测结果(见表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>备注发明试剂检出1例抗-HEVIgG血清样，抗-HEVIgM阳性；确认为抗-HEVIgM阳性对比试剂检出1例抗-HAVIgM血清样，抗-HEVIgM阳性；确认为假阳性对比试剂检出1例急性戊肝血清样，抗-HEVIgM阴性；确认为假阴性临床医院使用"戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光法免疫分析测定试剂盒"与ELISA试剂盒对比检测结果表明本发明试剂盒的各项指标均达到或超过了ELISA法，且该试剂盒的特异性100%,敏感性100°/。；临床试验中的1例抗-HEVIgG阳性血清样本，本发明试剂检出抗-HEVIgM阳性；1例急性HEV样本血清ELISA试剂检测抗—HEVIgM阴性、l例抗—HAVIgM血清标本ELISA试剂检出阳性。3份血清样经临床试验确认，l例抗-HEVIgG阳性血清样本结果为阳性，是属于急性感染后期患者；1例急性HEV样本血清临床结果是阳性，ELISA试剂结果是灰区标本；1例抗-HAVIgM血清标本临床结果是阴性。本试剂盒与类风湿因子阳性血清、乙肝阳性血清、曱肝IgM阳性血清无交叉反应。发明的戊型肝炎病毒IgM抗体(抗-HAVIgM)化学发光免疫分析测定试剂盒特异性、灵敏性、稳定性均高于ELISA试剂盒，可以推广应用于临床戊型肝炎疾病诊断。权利要求1、一种戊型肝炎病毒IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，本发明试剂盒包括戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对照品；包被固相载体；酶标记结合物；所述酶所作用的化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。2、如权利要求1所述本发明试剂盒，其特征在于，所述包被固相载体为抗人-u链抗体(单抗或多抗)包被的微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3、如权利要求1所述本发明试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的戊型肝炎病毒重组抗原。4、如权利要求1所述本发明试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、如权利要求1所述本发明试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，所述化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-硪代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0~10.0;所述化学发光底物B液，包括3.5mM过氧化脲、0.l%Tween20、0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，其pH值为7.0-7.6。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤以戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性血清制备对照品；以抗人-jj链抗体(单抗或多抗)直接包被固相载体；以酶标记重组戊型肝炎病毒抗原；配制酶所作用的化学发光底物液；配制浓缩洗涤液；分装上述戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性对照品、酶标记的戊型肝炎病毒重组抗原、该酶所作用的化学发光底物液及浓缩洗涤液；以及组装为成品。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相载体的步骤2)采用以下方法制备用0.1MpH值为8.0的硼酸緩冲液配制成所需浓度的抗人-p链抗体，并将包被液负载于固相载体上；用含0.1%酪蛋白，1%蔗糖，0.01%明胶，0.1%Proclin300,pH值为7.0-7.5,浓度为0.01M的磷酸盐緩冲液作为封闭液封闭上述的固相载体。8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被抗人-n链抗体(单抗或多抗)的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述标记酶为辣根过氧化物酶或石咸性》舞酸酶。10、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺；所述l,2-二氧乙烷类衍生物，为(金刚烷)-1,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-1,.2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明属于临床体外诊断免疫分析
技术领域：
，涉及一种化学发光法免疫分析测定戊型肝炎病毒IgM抗体的剂盒及其制备方法，本发明试剂盒制备方法包括以下步骤以戊型肝炎病毒IgM抗体阴、阳性血清制备对照品；以抗人-μ链抗体(单抗或多抗)包被固相载体；以酶标记戊型肝炎病毒重组抗原；配制酶所作用的化学发光底物液；配制浓缩洗涤液；分装上述戊型肝炎病毒IgM抗体的阴、阳性对照品、标记结合物、化学发光底物及浓缩洗涤液；及组装为成品。本发明制备试剂盒的性能指标(特异性、灵敏度、稳定性)稳定，可应用于戊型肝炎早期诊断。文档编号G01N33/543GK101551395SQ20081010326公开日2009年10月7日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者于尚永,宋胜利,应希堂,杨俊峰,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司