亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：甲状腺癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体甲状腺癌遗传易感性的试剂 盒，通过同时检测与甲状腺癌密切相关的X射线交错互补修复基因(XRCC1)、 X射线交错互补修复基因3 (XRCC3)、血管内皮生长因子A基因(VEGFA)、错配修复基因(hMSH2)上的单核苷酸多态性位点基因型 来评估个体甲状腺癌遗传易感性。
背景技术：
甲状腺内的异常新生物称甲状腺肿瘤或结节，是临床常见病、多发�。�以良性居多。其中4.8 16.5 %为恶性，即甲状腺癌。其发病因为地区及性别的不同，有较大的区别。 一般而言，高原缺碘地区，本病 的发病率高，并且女性发病较多。虽然甲状腺癌从儿童到老年人均可发生，但和一般癌瘤好发于老年人的 特点不同，甲状腺癌好发于青壮年。
甲状腺癌是最常见的内分泌系统肿瘤，分乳头状癌(约占60%,多见于年青女性，低度恶性)、滤泡 状癌(约占20%,多见于中年人，中度恶性)、未分化癌(约占15%，多见于老年人，高度恶性)和髓样 癌(少见，中度恶性)四种，多数发展较慢、转移较晚、预后较好。甲状腺癌的发病初期多无明显自觉症， 状，只是在甲状腺组织内出现质硬而高低不平的结节，晚期常压迫喉返神经、气管、食管而产生声音嘶哑， 呼吸困难或吞咽困难；如果压迫颈交感神经，可产生Homer综合征(表现为同侧瞳孔縮小、上眼睑下垂、 眼球内陷、同侧头面部无汗等)；颈丛浅支受损时，病人可有耳、枕、肩等部位疼痛。局部转移常在颈部， 出现硬而固定的淋巴结。远处转移多见于扁骨(如颅骨、椎骨和骨盆)和肺。
人类X射线交错互补修复基因1 (XRCC1)是第一个分离到的能够影响细胞对,电离辐射敏感性的哺乳 动物基因，广泛参与DNA损伤的修复。XRCC1蛋白自身不具有催化功能，它是作为脚手架蛋白，通过直 接与聚合酶e、 DNA连接酶ni和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)形成复合物，共同参与碱基切除修复(BER) 和单链断裂修复(Single strand break repair, SSBR)。 Arg399Gln位点是XRCC1基因第10号外显子上的一 个G/A多态位点，引起XRCC1基因编码蛋白的第399个氨基酸由Arg变为Gln，该氨基酸处于BRCT I 区域。G、 A是该位点的两个等位基因，两两组合形成三种基因型，分别为GG(Arg/Arg)、 GA(Arg/Gln)、 AA(Gln/Gln)，其中AA被确定为风险基因型，与甲状腺癌患病风险增加有关。当个体携带AA基因型时， XRCC1蛋白BRCT I功能域的空间构象发生改变，导致XRCC1蛋白不能正常结合于DNA受损处，而影 响PARP1发挥作用，最终使得碱基切除修复能力被削弱，DNA损伤增多，体细胞癌变增多，甲状腺癌的 患病风险上升。
由于甲状腺癌的一个重要诱发因素是强电离福射，因此当XRCC3基因损伤时，机体对于由强电离辐 射产生的DNA双链断裂无法进行有效修补，使得甲状腺细胞易发生癌变，最终引起甲状腺癌的发生风险 升高。A4541G位点是XRCC3基因第2号外显子上的A/G多态，处在5'端非编码区部分(5' UTR),因 此该突变可能会影响基因的表达调控。该位点的基因型有AA、 AG、 GG三种，其中AA为甲状腺癌的风 险基因型。当携带风险基因型(AA)时，XRCC3基因的表达受到影响，同源重组途径受阻，DNA双链断裂 修复不能正常进行，甲状腺癌的发生风险升高。
VEGFA是具有高度内皮细胞特异性的有丝分裂原，在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用。 VEGFA基因C-2578A位点是该基因靠近5'端的一个C/A多态位点。C、 A是该位点的两个等位基因，两 两组合形成三种基因型，分别为CC、 CA和AA，其中CA、 AA被确定为风险基因型，与甲状腺癌患病风 险增加有关。
C-2578A多态位点位于VEGFA基因的启动子区，因此具有调节基因表达水平的作用。该位点突变对 VEGFA基因表达水平产生影响，C等位基因引起该基因高表达，A等位基因则为低表达。按照"Folkman 理论假说"，VEGFA的高表达应该更容易导致癌症的发展，然而更多的研究事实证明，低表达等位基因A 与癌症的发生存在更密切的关系，其原因目前研究的还不够透彻，可能是由于癌症的发生和发展是两个不. 同的过程。虽然癌细胞的快速生长需要新血管的生成，但是在癌症发生的最初阶段，由于血管生成障碍使 得机体的部分细胞长期处于缺氧状态，从而导致癌症的发生。因此，当携带风险基因型(CA/AA)时，VEGFA基因的表达水平下降，对血管生成带来影响，而机体细胞需要由红细胞携带氧来进行正常的生理活动。在 血管不能正常生成的情况下，部分细胞得不到氧气，处于缺氧状态。缺氧在造成细胞转化为癌细胞过程中 发挥明显的作用，甲状腺癌的发生风险反而升高了。
hMSH2基因是错配修复(MMR)基因中的一种，参与DNA复制过程中碱基错配修复通路，具有错 配识别的作用。hMSH2基因第12号内含子第6位核苷酸上存在一个T/C多态， 一般表示为gIVS12-6T>C。 该多态位点有T和C两种等位基因，两两组合成为3种基因型，分别是TT、 TC和CC基因型。其中，TC 和CC是甲状腺癌的风险基因型。由于glVS12-6TX:位点位于内含子与外显子的交界处，邻近剪接接受部 位，该位点的突变很可能影响mRNA前体加工过程中mRNA的剪接，从而改变hMSH2蛋白质的功能。 因此，当携带风险基因型(TC/CC)时，对转录产物的剪接过程产生影响，导致其蛋白功能变化，错配修 复通路不能正常进行，甲状腺癌发生风险升高。

发明内容
基于X射线交错互补修复基因(XRCC1)、 X射线交错互补修复基因3 (XRCC3)、血管内皮生长因子A 基因(VEGFA)、错配修复基因(hMSH2)上的4个SNP位点多态性可用来评估个体甲状腺癌遗传易感性的 基础上，本发明提供一种检测个体甲状腺癌遗传易感性的试剂盒。
该试剂盒包括
检测XRCC1基因上Arg399Gln SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测XRCC3 S因上A4541G SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测VEGFA基因上C-2578A SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测hMSH2基因上glVS12-6T〉C SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，:特异性荧光探针对可用 常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
10 X荧光定量PCR反应缓冲液4^1，
25mM dNTP混合液0.4^1,
25mM MgC12溶液2. 4nl，
5units/nl Taq DNA聚合酶0.01^1，
20MM特异性引物对每条引物各0.225^1,
IO刚特异性荧光探针对每条探针各0.25pl，
去离子水2L3nl。 '本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。
步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积10nl，包,浓度为20ng/nl的DNA模板2fxl、 1^1 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1^1 25mM dNTP 混合液、0.6jil 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20-的有义引物和反义引物
4各0.225^1、 10—的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25^1，去离子水5. 325^1。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95°C 、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体甲状腺癌遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，釆用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的XRCC1基因上Arg399Gln SNP位点、XRCC3基因 上A4541G SNP位点、VEGFA基因上C-2578A SNP位点和hMSH2基因上glVS12-6T〉C SNP位点进行荧光定量 PCR检测，确定这4个SNP位点的基因型。
步骤3:个体甲状腺癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体甲状腺癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了 被检测者甲状腺癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体甲状腺癌遗传易感性分析报告 单。
权利要求
1.一种检测个体甲状腺癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测X射线交错互补修复基因(XRCC1)上Arg399Gln SNP位点、X射线交错互补修复基因3(XRCC3)上A4541G SNP位点、血管内皮生长因子A基因(VEGFA)上C-2578A SNP位点、错配修复基因(hMSH2)上gIVS12-6T＞C SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应 缓冲液4W, 25mMdNTP混合液0.4W， 25mMMgC12溶液2.4W， 5units/W Taq DNA聚合酶20刚 特异性引物对每条引物各0.225W, IO幽特异性荧光探针对每条探针各0.25W,去离子水21.3W。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测甲状腺癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测X射线交错互补修复基因(XRCC1)、X射线交错互补修复基因3(XRCC3)、血管内皮生长因子A基因(VEGFA)、错配修复基因(hMSH2)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与甲状腺癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体甲状腺癌遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608227SQ200810039269
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司