亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：雌二醇酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒。
背景技术：
雌ニ醇(estradiol，E2)是由卵巢成熟滤泡分泌的ー种天然雌激素，能促进和调节女性器官及副性征的正常发育。它主要促使子宮内膜增生；增强子宫平滑肌的收缩；促使乳腺导管发育增生，但较大剂量能抑制垂体前叶催乳素的释放，从而減少乳汁分泌；抗雄激素作用；降低血中胆固醇，井能增加钙在骨中的沉着。男性正常范围50 200pmol/L ；女性正常范围卵泡期94 433pmol/L，黄体期499 1580pmol/L，绝经期40 IOOpmol/し其含量增高主要见于儿童女性化、产生雌激素的肿瘤、男子乳房发育症、肝硬化失代偿期、肾上腺皮质增生；降低则见于Turner综合征、原发性和继发性功能減退症。最近，环境雌激素影响人们生活的事件频发。雌ニ醇(eStradi0l，E2)是雌激素中生物活性最強的ー种，掺在预混料及饲料添加剂中喂养畜、禽，或埋入耳根及家禽翼下，可以大大加快禽类的繁殖和生长。但雌ニ醇及其衍生物却可滞留在畜禽体内，通过食物链�：θ死嘟】担�使女性儿童提前发育，男性儿童乳腺发育呈女性化；男性生殖系统发育异常或引起病变；并导致女性乳腺癌和子宮内膜异位症发生率上升。因此，在食品安全方面，加强对农产品和食品中的雌ニ醇残留监测不容忽视。用于检测雌ニ醇的方法主要有两大类化学測定法和免疫測定法。化学測定法包括光谱法、气相色谱法(GC)和高效相色谱(HPLC)等。其中HPLC是化学法中应用最广泛的。高效液相色谱(highperformance liquid chromatography, HPLC)是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.9' 107Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万)；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检測。它的优点是分离效能高，选择性高，灵敏度高(紫外检测器可达10~9 ;荧光检测器可达10~12)以及分析速度快。但是虽然HPLC灵敏度高，但需要复杂的仪器设备，精密的提取和净化过程，难以进行样本的大規模筛�。�不利于生产实践中的推广。目前用于检测雌ニ醇的检测多采用免疫測定法，尤其是酶联免疫測定法(ELISA)，因其既能用于快速筛选，又能进行定量測定，是当前进行雌ニ醇检测最实用的分析方法。酶联免疫吸附测定(ELISA)以免疫学反应为基�。�将抗原、抗体的特异性反应和底物对酶的高效催化作用结合起来的ー种敏感性很高的检测技木。由于抗原、抗体的反应是在ー种固相载体——聚苯こ烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤去除多余的游离反应物，从而保证实验结果的特异性和稳定性。ELISA检测中的关键原料是抗原和抗体，抗原可以经过 提取、重组、合成等不同的方法获得，而高特异性、高亲和力的抗体却不容易获取。特别是针对雌ニ醇这样的小分子，它的分子量仅为272. 38，直接免疫动物很难产生抗体，目前普遍采用的方法是将雌ニ醇进行改造，然后偶联到卵清蛋白(0VA)、牛血清白蛋白(BSA)等载体蛋白上，最后免疫动物收获抗体，这样就増加了操作的复杂性。而且还存在偶联效率不稳定的情況，很难获得高质量的抗体。因此，需要提供一种雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒以解决上述问题。

实用新型内容为了解决该问题，本实用新型公开了ー种雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭
层。 较佳地，所述固相载体采用96孔聚苯こ烯试剂板形成。较佳地，所述包被层由抗雌ニ醇抗体组成。较佳地，所述固相载体采用48孔聚苯こ烯试剂板形成。本实用新型的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，具有高品质，在试剂盒的特异性、灵敏度等方面有很大的改善。在实用新型内容部分中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式
部分中进ー步详细说明。本实用新型内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。
以下结合附图，详细说明本实用新型的优点和特征。

图I是根据本实用新型一个实施例的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本实用新型更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本实用新型可以无需ー个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本实用新型发生混淆，对于本领域公知的ー些技术特征未进行描述。为了彻底了解本实用新型，将在下列的描述中提出详细的结构。显然，本实用新型的施行并不限定于本领域的技术人员所熟习的特殊细节。本实用新型的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本实用新型还可以具有其他实施方式。以下參考附图对本实用新型的实施例做出详细描述。參看图1，是根据本实用新型一个实施例的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。本实用新型的试剂盒包括固相载体，该固相载体上设置有微孔条，微孔条包括微孔1，包被层2和封闭层3。其中使用96孔聚苯こ烯试剂板(PS)作为固相载体。当然也可采用48孔聚苯こ烯试剂板(PS)或其他材料的试剂板。包被层2由抗雌ニ醇抗体組成。上述试剂盒的主要制备方法如下。抗雌ニ醇特异性抗体的筛选可以购买商业化构建好的噬菌体抗体库，并进行菌液培养进行噬菌体表面呈现。将雌ニ醇固化，抗体库与固相上的雌ニ醇分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后用酸洗脱下与雌ニ醇结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下ー轮洗脱，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与雌ニ醇特异结合的噬菌体抗体得到高度富集。抗雌ニ醇抗体scFv的改造P53基因的表达产物主要以四聚体的形式存在，由第319-360位氨基酸组成的结构域能将其自身组装成四聚体，故该结构域被称为四聚功能域。筛选获得的scFv只有ー个抗原结合区，抗原结合力较完整的mAb低，因此，我们选择p53四聚功能域基因与抗雌ニ醇scFv基因融合，利用p53四聚功能域基因表达产物会自动组装成四聚体这一特性，使抗雌ニ醇基因表达产物形成四聚体，该抗体具有四个功能区，可明显增加对抗原的结合力。将含融合基因的质粒转染至中国仓鼠卵巣(CHO)细胞中，扩增培养后采用亲和层析法纯化目的抗体，并通过Western-Blot和ELISA等方法对其亲和性和特异性进行鉴定。 酶联免疫吸附测定试剂盒的制备本实用新型试剂盒的制备过程如下使用96孔聚苯こ烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗雌ニ醇抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。然后进行检测，依次加入待测标本(标准品)及生物素化的雌ニ醇，形成酶标板微孔中待测样本(标准品)和生物素化的雌ニ醇竞争结合包被在微孔中抗雌ニ醇抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，然后在ELISA检测仪上于450nm处读取O. D值，完成雌ニ醇酶联免疫吸附測定试剂盒的制备。最后分析数据，在试剂盒的检测范围内，根据标准曲线来计算待测物浓度，待测物浓度越高，样本O. D值则越低。本实用新型的技术效果描述如下噬菌体抗体展示技术相较传统的单克隆或多克隆抗体技术有许多优点，可以快速闻效的获得闻质量的抗体(见表I)。
权利要求1.一种雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭层。
2.根据权利要求I所述的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用96孔聚苯こ烯试剂板形成。
3.根据权利要求2所述的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在干，所述包被层由抗雌ニ醇抗体組成。
4.根据权利要求I所述的雌ニ醇酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体采用48孔聚苯こ烯试剂板形成。
专利摘要本实用新型公开了一种雌二醇酶联免疫吸附测定试剂盒，所述试剂盒包括固相载体，所述固相载体上设置有微孔条，所述微孔条包括微孔、包被层和封闭层。本实用新型的雌二醇酶联免疫吸附测定试剂盒，具有高品质，在试剂盒的特异性、灵敏度等方面有很大的改善。
文档编号G01N33/544GK202372504SQ201120483149
公开日2012年8月8日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者万定一, 丛旭霞, 何峰容, 姚雯, 李庆, 杨娟, 童晓玲 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司