专利名称：一种基于脂质聚类分析的可可粉掺假检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于指纹图谱的可可粉掺假检测方法，特别是一种通过构建甘油酯指纹图谱以判定可可粉是否掺假的方法。
背景技术：
天然可可脂(cocoa butter或cacao butter, CB)是可可豆经压榨法制得的具有特殊功能的油脂，盛产于热带(主要在非洲)，常温下为乳黄色固体，外观类似白蜡，具有芳香气味。可可粉具有浓烈芬芳的独特香味，含有丰富的多酚、蛋白质、碳水化合物、可可脂等多种营养元素和活性成分，是制造巧克力的重要原料，也用于生产当今世界三大嗜好性饮料之一。上个世纪90年代中期以来，随着可可制品应用范围的日趋扩大，对外贸易的拓展，我国可可加工行业发展迅猛，与此同时，国内市场上大量劣质或假冒可可粉充斥市�。唤鲅现匚：α耸称钒踩灿跋炝宋夜墓拭骋仔庞驼婵煽杉庸こЪ业睦�。金永生等对可可粉中掺入大豆柏、芝麻柏、花生壳和板栗壳等几种外源植物源性成分的PCR检测方法进行了探索研究，建立的方法准确性易受杂质影响，不能鉴别可可壳粉这种主要的内源性掺假物；另外，可能添加的外源植物源性成分种类繁多，难以预料，实际操作中不可能对所有可能添加的外源植物源性成分逐个进行PCR检测，因此该方法有很大局限性，难以推广。为此，本文尝试从脂质指纹分析角度建立可可粉掺假检测方法，即用索氏提取法提取11批不同来源的可可粉样品中的可可脂，通过反相高效液相色谱(HPLC)分离-蒸发光散射检测器(ELSD)检测得到可可粉的脂质色谱指纹图谱，根据其共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析(HCA)法，对模拟分别掺入板栗壳粉与桂圆壳粉且分别掺入代可可脂和棕榈油的可可粉掺假样品进行脂质指纹分析。本发明可为我国可可粉的质量检测方法和质量标准的提升及完善提供科学依据与参考，从而促进我国可可粉产品的质量提高和稳定，更好地规范可可粉市�。は颜呷ㄒ�。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种准确可靠且较简便，可推广应用于可可粉的掺假检测方法。本发明的技术方案为首先，构建可可粉甘油酯标准指纹图谱，包括可可粉脂质的提取、高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；然后，根据可可粉甘油酯组成的测定方法，测定模拟掺假样品的脂质甘油酯组成；最后，根据可可粉样品和模拟掺假样品脂质甘油酯组分的相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析。本发明的具体步骤为
I、可可粉脂质甘油酯指纹图谱的建立方法包括下列步骤(I)可可粉脂质的提取称取2. 50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h。取出提取瓶，用旋转蒸发仪，浓缩至干。然后将提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此操作至恒重。准确称取一定量提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右。(2)高效液相色谱分析色谱柱symmetry C18 (250_X 4. 6mm, 5 μ m)。流动相Α为乙腈/氯仿(70 :30), B为乙腈/氯仿(30:70)。二元梯度洗脱程序0min, 100%A ;5min,70%A ;25min，0%A ;25. I 30min，100%A。柱温40°C。流速0. 8mL/min。ELSD 漂移管温度:85°C，N2流速2. 5L/min。在此条件下分别进样分析，得 到可可粉甘油酯的色谱指纹图谱。以11号峰为参照，计算样品中各峰的相对保留时间。(3)标准指纹图谱的建立通过对11个不同产地的可可粉样品中甘油酯高效液相色谱图进行比较，确定共有特征峰，并将色谱数据导入指纹图谱专用软件得到由其共有特征峰构成的可可粉甘油酯的标准色谱指纹图谱。待测样品可与标准指纹图谱对比，区别其异同。共有特征峰有14个，它们的相对保留时间RT (以11号峰POS为参照)的相对标准偏差RSD均小于1% ;即I 号峰平均 RT 为 O. 411，RSD 为 O. 18%;2 号峰平均 RT 为 O. 465，RSD 为 0%;3 号峰平均 RT 为 O. 703，RSD 为 O. 15%;4 号峰平均 RT 为 O. 743，RSD 为 O. 22%;5 号峰平均 RT 为 O. 786，RSD 为 O. 07%;6 号峰平均 RT 为 O. 848，RSD 为 O. 12%;7 号峰平均 RT 为 O. 878，RSD 为 O. 02%;8 号峰平均 RT 为 O. 899，RSD 为 0%;9 号峰平均 RT 为 O. 944，RSD 为 O. 03%;10 号峰平均 RT 为 O. 977，RSD 为 O. 06%;11 号峰平均 RT 为 I. 000，RSD 为 0%;12 号峰平均 RT 为 I. 107，RSD 为 0%;13 号峰平均 RT 为 I. 183，RSD 为 O. 34%;14 号峰平均 RT 为 I. 215，RSD 为 O. 34%;其中超过总峰面积3%的指纹峰有3个，分别为8号峰，相对峰面积
10.8489Γ12. 403%; 11号峰，相对峰面积51. 518% 53. 078%; 12号峰，相对峰面积30 . 46 39Γ32. 677%。2、聚类分析本发明选择Ward法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为I作为标准化处理，进行聚类分析。11号共有指纹峰较稳定，峰面积百分比约50%，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此设定11号峰为参照峰。然后，应用14个共有特征峰的相对峰面积(以11号峰作为参照峰)组成的矩阵进行聚类分析。本发明建立了可可粉的脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱，其相似度均在O. 995以上。应用可可粉脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱的14个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵，以系统类聚法对掺假可可粉进行分析，掺入I. 2% (占样品质量的百分含量)及以上代可可脂或棕榈油的掺假可可粉样品可以予以鉴别。本方法稳定可靠，重复性好，可应用于可可粉的掺假检测。
图I :11个产地可可粉脂质甘油酯组成的HPLC指纹图谱；各峰保留时间(min)分别为1号峰一7. 291 ；2 号峰一8. 245 ；3号峰一12. 469 ；4号峰一 13. 184 ；5 号峰一 13. 943 ；6 号峰一 15. 038 ；7 号峰一 15. 571 ；8 号峰一 15. 947 ；9 号峰一 16. 745 ；10 号峰一 17. 331 ；11 号峰一 17. 739 ；12 号峰一 19. 635 ；13 号峰一20. 978 ；14号峰一21. 561。图2 :模拟掺假可可粉样品脂质色谱图；图3:模拟掺入板栗壳及代可可脂的掺假可可粉样品聚类分析树状图；图4:模拟掺入桂圆壳及棕榈油的掺假可可粉样品聚类分析树状图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。实施例I :掺入板栗壳及代可可脂的可可粉的掺假检测方法研究I、仪器、样品及试剂I. I 样品11批不同来源的可可粉样品和掺假脂质代可可脂(BS2000):均由无锡市产品质量监督检验所局采集；模拟掺假材料板栗壳粉由购自无锡市大润发超市的板栗制得；I. 2 试剂石油醚、三氯甲烷分析纯，(国药集团化学试剂有限公司)；乙腈色谱纯，(国药集团化学试剂有限公司)；I. 3 仪器高效液相色谱仪(包括G1311A四元泵，G1313A自动进样器，G1379A在线脱气机，G1316A 柱温箱，AgilentllOO 化学工作站):Agilentll00,美国 Agilent 公司；蒸发光散射检测器Alltech2000,美国Agilent公司；BUCHI 索氏抽提器B-811，瑞士 BUCHI Labortechnik AG 有限公司；DLSB_ 低温冷却液循环泵DLSB-5/20，郑州长城科工贸有限公司；旋转蒸发器RE52_2，上海沪西分析仪器厂有限公司；循环水多用真空泵SHZ_3，上海沪西分析仪器厂有限公司。腈、甲醇均为色谱纯。2、可可粉脂质的提取称取2. 50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h。取出提取瓶，用旋转蒸发仪，浓缩至干。然后将提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此操作至恒重。准确称取一定量提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右。3、高效液相色谱分析色谱柱symmetryC18 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)。流动相Α 为乙腈 / 氯仿(70 :30)，B 为乙腈 / 氯仿(30 :70)。二元梯度洗脱程序0min，100%A ；5min,70%A ；25min,0%A ；25. I 30min，100%A。柱温40°C。流速:0. 8mL/min。ELSD 漂移管温度85°C，N2 流速:2. 5L/min。在此条件下分别进样分析，得到可可粉样品脂质甘油酯组成的指纹谱图，见附图I。以11号峰为参照，计算样品中各峰的相对保留时间。4、标准指纹图谱的建立及共有指纹峰特征通过11个不同产地的可可粉样品中的脂质甘油酯组成的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰14个，共有峰的相对保留时间RT(以11号峰为参照)的相 对标准偏差RSD均小于1% ;其中超过总峰面积3%的指纹峰有3个，分别为8号峰，相对峰面积10. 848% 12· 403% ；11号峰，相对峰面积51. 518% 53. 078% 12号峰，相对峰面积30 . 46 39Γ32. 677%。5、聚类分析系统聚类分析源自分类学，是以样本的相似性为基础的。它的基本思想是将待聚类样本集的各样本各自看成一类，然后规定或定义样本与样本间的距离或相似性量度以及类与类之间的距离后进行聚类。聚类开始时，每个样本各自形成一类，类与类之间和样本与样本之间的距离是相同的，选择距离最小的一对即相似性最大的一对样本合并成一个新类；再计算该新类和其他所有类间的距离；比较各个距离之后，将距离最小的两类又合并成另一个新类。直到所有样本集中的样本归为一类为止。整个聚类过程，进行了 n(样本数目)-I次的合并新类的操作，得到η-l个并类距离。这η-l个合并过程也可以用树状图来表示。根据给出的树状图便可得出样本类别的相关信息。按照2和3的方法测定掺入板栗壳和代可可脂的可可粉的甘油三酯的组成，并选择Ward法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为I作为标准化处理,进行聚类分析。11号共有指纹峰较稳定，峰面积较大，且与邻近峰分离较好，保留时间较居中，因此设定11号峰为参照峰。然后，以共有特征峰和非共有峰的相对峰面积(以11号峰POS作为参照峰)组成的矩阵进行聚类分析。因板栗壳中基本上不含脂质，故当向Sll号可可粉中掺入板栗壳时，则可可粉中的可可脂含量会降低，为使可可脂含量达标，不法厂家通常同时掺入一定量的代可可脂。因此本实验模拟制备8个掺加不同量代可可脂的样品(掺加代可可脂后总脂含量均达到10%)，见表I (经测定Sll号可可粉中原有总脂含量为9. 96%，即近似为10%。)。按照步骤2的方法提取这些样品中的脂质，并按照步骤3进行HPLC指纹分析(图2a)。根据色谱峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类分析，由所得的聚类分析树状图(图3)可见样品Al不能从纯正的可可粉样品(SI Sll)中区别出来，而A2 A8则均可区分于SI S11，即掺入
I.2%及以上代可可脂的样品可以予以鉴别。表I :模拟掺入板栗壳及代可可脂的掺假可可粉组成
权利要求
1.一种基于脂质聚类分析的可可粉掺假检测方法，其特征在于，包括如下步骤 1)构建可可粉甘油酯标准指纹图谱，提取若干批不同来源的正宗可可粉样品的脂质后进行甘油酯组成的高效液相色谱指纹分析，并确定共有特征峰； 2)采用步骤I)的中可可粉甘油酯标准指纹图谱的测定方法，测定可可粉未知样品的甘油酯组成； 3)将步骤2)获得的未知样品的色谱图与步骤I)得到的标准指纹图谱进行比较，根据它们相对峰面积组成的矩阵，进行聚类分析，判定可可粉是否掺假。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于构建可可粉标准品甘油酯标准指纹图谱的具体步骤为 1)可可粉脂质的提取称取2.50g左右可可粉，置于滤纸筒中，放入索氏抽提器的提取管中，并在提取瓶中加入2/3左右的石油醚，水浴47°C，6h ;取出提取瓶，用旋转蒸发仪，浓缩至干；然后将提取瓶在105°C干燥2h，取出放置于干燥器内冷却，称重，重复此操作至恒重；准确称取提取得到的脂质，溶解于三氯甲烷，使其浓度为5mg/mL左右； 2)高效液相色谱分析色谱柱symmetryC18, 250mmX4. 6mm, 5 μ m ;流动相A为乙腈/氯仿(70 :30)，B为乙腈/氯仿(30 70) ;二元梯度洗脱程序0min, 100%A ；5min,70%A ；25min，0%A ；25. I 30min，100%A ;柱温40°C ;流速:0. 8mL/min ；ELSD 漂移管温度85°C, N2流速2. 5L/min ;在此条件下进样分析步骤(I)过滤后的样品，得到可可粉甘油酯的高效液相色谱指纹图谱； 3)标准指纹图谱的确定通过11个不同产地的可可粉样品中提取得到的脂质甘油酯组成的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定了标准指纹图谱共有14个特征峰，所述共有特征峰以11号峰POS为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于1%。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中聚类分析选择Ward法作为聚类方法、Chebychev距离作为测量距离方法，均值为I作为标准化处理，进行聚类分析，以14个共有特征峰的相对峰面积组成的矩阵进行聚类分析，其中11号峰作为参照峰。
全文摘要
本发明公开了一种基于脂质聚类分析的可可粉掺假检测方法，用索氏提取法提取可可粉中的可可脂，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离-蒸发光散射检测器(ELSD)检测，构建可可粉的脂质色谱指纹图谱，根据其共有特征峰的相对峰面积，应用系统聚类分析(HCA)法，对模拟分别掺入板栗壳粉与桂圆壳粉且分别掺入代可可脂和棕榈油的可可粉掺假样品进行脂质指纹分析和掺假鉴别试验。结果表明该方法对掺入1.2%(占样品质量的百分含量)及以上代可可脂或棕榈油的掺假可可粉样品可以予以鉴别。该方法较简便、灵敏且重复性好，可用于掺入不含脂质或低脂质类杂质的伪劣样品(为使脂质含量达标，通常人为掺入代可可脂或棕榈油等)的检测。
文档编号G01N30/06GK102778517SQ20121024670
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月16日 优先权日2012年7月16日
发明者姚凤花, 戴军, 朱松, 王琴, 胡明华, 詹晟, 陈尚卫 申请人:无锡市产品质量监督检验中心
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