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专利名称：乳腺癌相关风险基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体明涉及检测乳腺癌相关风险基因位点是否发生突变的试剂盒，通过同时检测与乳腺癌密切相关的成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)基因和T0X3基因(T0X3)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体患乳腺癌的风险。
背景技术：
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一。在欧美发达国家，乳腺癌的发病率居女性恶性肿瘤之首；在我国，乳腺癌发病率也呈逐渐上升趋势，并出现低龄化。FGFR2 (fibroblastgrowth factor receptor2)基因位于10q26,这一区带在移动细胞癌中常常存在结构异常且表达下降。大量研究表明FGFR2基因的突变也可诱发肿瘤的发生。肿瘤中该基因的表 达缺失很可能是突变失活的结果，其具体机制尚不明了。国外研究表明，FGFR2的单核苷酸多态性与乳腺癌有相关性。FGFR2基因的rs2912778、rs3135718、rsll020014位点多态性均増加了乳腺癌的患病风险。由于乳腺癌的发生可能与雌激素有关，且肿瘤大小、细胞学分级、淋巴结转移情況、ER/PR表达情况均影响乳腺癌术后复发危险度分组，Stacey和Garcia-Closas等研究结果也表明FGFR2与雌激素阳性、低分化以及多结节乳腺癌患者有強烈的相关性。FGFR2基因的突变可诱发肿瘤的发生。研究表明，FGFR2突变与胃癌、肺癌、子宮内膜癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤均有夫。Jang等发现在胃、结肠、直肠癌中也发现了与赝缝骨结合综合症相同的FGFR2/FGFR3突变，说明FGFR2/FGFR3的突变在胃、结肠、直肠癌中也起着十分重要的作用。Udler等人研究结果也表明FGFR2基因突变可增加女性患乳腺癌的风险。乳腺癌的发生涉及细胞凋亡与増殖失衡、细胞的分化紊乱、癌基因与抑癌基因的功能失调，以及相关信号传导系统等多种生命活动的异常。Meyer等对FGFR2基因遗传变异与乳腺癌易感性的研究表明，风险等位基因在乳腺癌中的表达有所増加。Gold等们对德系犹太人种进行基因组的相关性研究，得出FGFR2的SNP位点(rsl078806)与乳腺癌存在相关性。Hunter等通过基因分型对欧洲绝经后妇女湿润型乳腺癌患者和对照组进行了研究后发现FGFR2第2内含子的rs2981579、rs2420946与乳腺癌发生有较强的关联性。Udler等人发现FGFR2第2内含子的rs2981578与乳腺癌发生有较强的关联性。Liangy等研究表明，FGFR2基因第二内含子的变异可能是中国乳腺癌发生的重要病因。浙江大学医学院病理科Peng等报告的一项综述表明，31. 7%的基因突变与乳腺癌发病相关性是显著相关的，其中又有21. 7%值得进一步关注；而对于GWASs，有80%的显著相关性值得进ー步关注。随着对乳腺癌发病相关基因、全基因组关联研究(genome-wide associationstudies,GffASs)的深入，越来越多的证据显示基因突变与乳腺癌发病率之间有密切的相关性。[0007]研究检索了包括PubMecUMedline在内的科学文献，其中87篇Meta分析或汇总分析的文章中共指出145个与乳腺癌相关的基因突变。其中包括FGFR2 (rs2981579)和T0X3(rs4784227)哈尔滨医科大学肿瘤防治研究所进ー步证实了 T0X3基因相关位点多态性与乳腺癌的关系。经过病例组和对照组的研究分析之后，得出结论T0X3基因上rs4784227位点的基因多态性和rs9302556位点基因多态性增加乳腺危险性。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个乳腺癌相关风险基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。 其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GAGGAAATACATAACCT -3’下游引物序列5’- TTGCTTGTTTTGGATAC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GATGTCTaCAGAGG - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- GATGTCTgCAGAGG - TAMRA -3’T0X3上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- AAAAGTCCCAATTTGTA -3’下游引物序列5’- TGGGAGTATTTACATCA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - TGTTTGCcGATTATT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGTTTGCtGATTATT -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积10 iil，其中Siil PCR反应液，2 检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95 V、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读�。�根据得到的ニ维荧光图和实时扩增曲线读取被检测样品的SNP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测乳腺癌相关风险基因SNP位点，从而告知被检者患病风险数值，提前预防和控制，指导医师选择正确的临床治疗方案，有利于患者进行针对性治疗。本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个乳腺癌相关风险基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患乳腺癌风险性的评估也更便捷。

图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于 说明目的，而不用于限制本实用新型范围。实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GAGGAAATACATAACCT -3’下游引物序列5’- TTGCTTGTTTTGGATAC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - GATGTCTaCAGAGG - TAMRA _3’基因型ニ荧光探针序列5，-VIC-GATGTCTgCAGAGG - TAMRA -3’T0X3上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- AAAAGTCCCAATTTGTA -3’下游引物序列5’- TGGGAGTATTTACATCA -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - TGTTTGCcGATTATT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - TGTTTGCtGATTATT -TAMRA -3’3.样本检测选取30例血液样本，其中已确定患乳腺癌的为18例。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进 行终点荧光读取。
权利要求1. ー种乳腺癌相关风险基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I )、衬垫(2 )、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性 对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测乳腺癌相关风险基因位点是否发生突变从而评估个体患乳腺癌风险性的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个乳腺癌相关风险基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体患乳腺癌风险性的评估也更便捷。
文档编号G01N21/64GK202401072SQ20112056948
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司