亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：：一种定型内胚层细胞的制备和分离方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种定型内胚层细胞(DefinitiveEndoderm，DE)的制备和分离方法。
背景技术：
：源于胚泡期内细胞团的胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ES)具有多全能性，在合适的培养条件下，可以使其维持近似均一且理论上无限的自我更新能力；而在特定的诱导条件下，它们能够向几乎所有体细胞分化。胚胎干细胞为现代生命科学和药物科学研究提供了良好条件，是研究哺乳动物早期胚胎发育的理想模型，也在基于细胞的生物治疗(Cell-BasedTherapy)和药物筛选、毒理测试等研究中起到重要作用。近年来，对胚胎干细胞自我更新及哺乳动物胚胎发育的分子机制的进一步了解使得干细胞向体细胞定向分化已成为干细胞生物学研究的热点，也在再生医学领域越发受到重视。之前的研究工作表明，小鼠ES细胞向包括神经元、心肌细胞、肝脏细胞、内分泌胰腺细胞等在内的体细胞的定向分化已取得了一定迸展；人类胚胎干细胞向神经元、激素分泌胰腺细胞分化已取得一定进步，但关于人类胚胎干细胞向肝脏细胞的分化研究少有报道。中国肝脏疾病的发病率高，影响面广，对国人健康和社会经济的影响巨大。特别是乙肝病毒等嗜肝性病毒感染在临床上可以引起肝炎、肝硬化和肝癌的发生，而目前又缺乏真正有效的治疗方法。所以，发展全新的肝脏疾病的治疗方法不仅具有重要的医学意义，而且更加具有特殊的社会影响和潜在的经济效益。特别令人鼓舞的是，在体外实验中已有可能使胚胎干细胞和来源于肝组织的肝干细胞分化为肝前体细胞、成熟的肝细胞及胆管细胞，并在活体动物的移植实验中也观察到外源的干细胞对损伤肝脏的再殖(Rep叩ulate)，使损伤肝脏在结构上和功能上得到有效的恢复。这些进展的取得，充分显示了利用干细胞对人类肝脏疾病进行临床治疗的可能性。5小鼠和人ES细胞体外分化的研究表明，ES细胞的肝向分化能在一定程度模拟在体发育过程，使得体外分化具有较好的理论依据。因此，对哺乳动物肝脏发育的分子机制的了解，有助于指导胚胎干细胞肝向分化。然而，哺乳动物肝脏发育是一个在时间和空间上受到精确调控的生物学事件，这就决定了肝向分化的复杂性。干细胞肝向分化尚有许多问题待于解决，如诱导效率低、重复性差、细胞成分混杂(各个胚层基因表达具有相似性，难于区分特定的细胞群)、分化细胞的真实性等。因此，探索高效可重复的胚胎干细胞肝向诱导的方法势在必行。胚胎干细胞肝向分化的第一步是获得高比例且较纯的内胚层细胞。综合本
技术领域：
以往的研究，胚胎干细胞向定型内胚层分化有三个技术问题还需要解决首先需要解决的问题是如何提高诱导效率。研究已经发现，通过单层培养诱导(Monolayerculture),ActivinA(激动素)能够模拟Tgf-b信号通路的作用，促进ES细胞分化成Gsc+中内胚层(Mesoendoderm)，进而分化成内胚层样细胞；而通过形成拟胚体(EmbryonicBody,EB)，ActivinA也能促使ES细胞分化成Brachury+原条样细胞，进一步形成内胚层细胞；同时ActivinA的诱导作用也在人胚胎干细胞向内胚层分化中被证明。然而，尽管如此，这些诱导方法的效率都不高，低于50%。其次需要解决的问题是如何区分定型内胚层和内脏内胚层(Vecialendoderm,VE)。在哺乳动物发育过程中，VE来自原始内胚层(Primitiveendoderm,PE)，不参与器官发育，但VE和DE共同表达很多相同的基因，而且VE很容易被诱导出来，之前的诱导方法因无法较好地区分VE和DE，得到的往往是一个混合的细胞群。再次需要解决的问题是如何将DE从分化的细胞群中挑选出来。利用荧光激活的细胞分选技术(FluorescenceActivatedCellSorting,FACS)，只要选定合适的表面抗原，就可以将特定细胞群标记并分离。现在所知的DE特异表达的表面抗原还很少，因此有必要选定能够正确区分胚内和胚外细胞，以及中胚层(Mesoderm;)和定型内胚层的表面标记。
发明内容本发明的目的在于提供一种定型内胚层细胞(DE)的制备和分离方法。本发明的另一目的在于提供一种用于促进定型内胚层细胞向分化的分化培养基。本发明的另一目的在于提供一种可用于分选内胚层细胞的表面标记。在本发明的第一方面，提供一种制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括(1)培养胚胎干细胞(EmbryonicStemcells,ES)，形成拟胚体；(2)用含活化素A(ActivinA)和Wnt信号通路激动剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60%以上；较佳的70%以上；更佳的80%以上。在另---优选例中，所述的胚胎干细胞是非人哺乳动物胚胎干细胞，如兔、鼠、羊、猪、猴。较佳的，所述的胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞。在另一优选例中，在步骤(2)中，在用Wnt信号通路激动剂处理的同时，还包括用BMP4信号通路抑制剂处理拟胚体。在另一优选例中，所述的Wnt信号通路激动剂选自(2'Z,3，E)-6-Bromoindirubin陽3'-月亏(BIO)或LiCl;或所述的BMP4信号通路抑制剂是Noggin。在另一优选例中，活化素A的用量是20-100ng/ml培养基；较佳的是30-80ng/ml培养基；更佳的是50-80ng/ml培养基。在另一优选例中，LiCl的用量是0.5-10mM;较佳的是l-8mM;更佳的是2扁6mM。在另一优选例中，(2'Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-肟的用量是0.5-5uM;较佳的是0.8-4uM;更佳的是2uM。在另-优选例中，Noggin的用量是100-600ng/m;较佳的是150-500ng/ml;更佳的是200-400ng/ml。在另--优选例中，所述方法还包括(3)从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。在另一优选例中，采用流式细胞分选方法分离出定型内胚层细胞群。在另一优选例中，所述的从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群的方法是分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群；或7分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140ci分子阴性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群；或分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。在本发明的第二方面，提供一种含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60%以上，所述的细胞群采用以下方法获得(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；(2)用含活化素A和Wnt信号通路激动剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群。在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140ci分子阴性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群。在本发明的第三方面，提供一种用于制备定型内胚层细胞的分化培养基，所述的分化培养基含有(较佳地由以下组分组成)无血清胚胎干细胞分化培养基，以及20-100ng/ml活化素A;和0.5-10mMLiCl，或0.5-5uM(2'Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-肟。在另一优选例中，含有30-80ng/ml活化素A;较佳的含有50-80ng/ml活化素A。在另一优选例中，含有l-8mMLiCl;较佳的含有2-6mMLiCl。在另一优选例中，含有0.8-4uM(2'Z，3，E)-6-Bromoindimbin-3'-肟；较佳的含有M(2，Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-月亏。在另一优选例中，所述的分化培养基还含有100-600ng/ml的Noggin;较佳地含有150-500ng/ml的Noggin;更佳地含有200-400ng/ml的Noggin。在另一优选例中，所述的无血清胚胎干细胞培养基含有70-80°/。体积比的IMDM;20-30%体积比的F12培养基；其中还添加按照体积0.2-2%(较佳地0.3-1.5%)N2添加物；按照体积0.5-2%(较佳地0.7-1.5%)B27添加物；0.2-1(较佳地0,4-0.8)mg/ml的BSA;0.2-1(较佳地0.4-0.8)mM的维生素C;禾口0.2-0.8(较佳地0.3-0.6)mM的3-巯基硫代甘油(MTG)。在本发明的第四方面，提供所述的分化培养基的用途，用于制备含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60%以上；较佳的70%以上；更佳的80%以上。在本发明的第五方面，提供一种CD140ci分子的特异性抗体的用途，用于鉴定Cxcr4分子阳性的细胞或细胞群是否属于定型内胚层细胞或细胞群。在本发明的第六方面，提供一种EpCam分子的特异性抗体的用途，用于鉴定Cxcr4分子阳性的细胞或细胞群是否属于定型内胚层细胞或细胞群，或用于分离定型内胚层细胞或细胞群。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了以Cxcr4+/c-Kit+作为分选的标记，利用FACS技术分析定型内胚层细胞的分化情况。图2A显示了以Cxcr4+Zc-Kit+作为分选的标记，利用FACS技术分析定型内胚层细胞的分化情况。图2B显示了以Cxcr4+/Cdl40a-作为分选的标记，利用FACS技术分析定型内胚层细胞的分化情况。图3显示了RealtimePCR比较4种条件下DE相关基因的表达。其中，1.采用分化培养基6进行诱导的基因表达情况；2.采用分化培养基8进行诱导的基因表达情况；3.采用分化培养基7进行诱导的基因表达情况；4.采用分化培养基2进行诱导的基因表达情况。图4显示了RT-PCR对分选的细胞进行基因表达分析，其中，ES表示胚胎干细胞中相关基因RT-PCR产物的电泳结果；EB表示拟胚体中相关基因RT-PCR产物的电泳结果；"-"表示分选出的Cxcr4+/EpCam-细胞中相关基因RT-PCR产物电泳结果；"+"表示分选出的。乂(^4+/￡03111+细胞中相关基因RT-PCR产物的电泳结果；H20为阴性对照的电泳结果。具体实施例方式本发明人经过长期而广泛的研究，首次揭示一种可显著提高胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化的效率的方法，所述方法包括采用Wnt信号通路激动剂诱导拟胚体使之分化为定型内胚层细胞，更佳地还采用BMP4信号通路抑制剂来诱导。本发明的方法简单高效，可显著地将哺乳动物胚胎干细胞向定型内胚层分化的效率提高。本发明人还找到了可与Cxcr4相结合用于分选或富集定型内胚层细胞群的新的表面标志物Cdl40a或EpCam，发现并验证了Cxcr4+/Cdl40a-细胞群或00^4+/￡(^111+细胞群是富含定型内胚层细胞的细胞群。胚胎干细胞的定向分化的难点在于①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③分化的细胞的真实性。本发明人针对这三个难题，对哺乳动物胚胎干细胞向定型内胚层细胞的分化进行了深入探索和优化，使分化效率大大提高，通过活细胞分析/分选技术富集目的细胞群，并通过基因表达分析验证了富集到的细胞群的真实性。制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法
技术领域：
：本发明提供一种制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；和(2)用含ActivinA和Wnt信号通路激动剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群。在制备过程中，首先需要使未分化的胚胎干细胞形成拟胚体，拟胚体的培养是本领域人员已知的技术。作为本发明的优选方式，采用悬浮培养的方式制备拟胚体。以往，已经采用ActivinA来诱导拟胚体定向分化为内胚层细胞，但是诱导效率低下，无法获得令人满意的分化细胞群。本发明人在深入研究中意外地发现，Wnt信号通路激动剂可与ActivinA协同发挥作用，非常有效地诱导胚胎干细胞定向分化为定型内胚层细胞，获得定型内胚层细胞占优势；更佳地，还同时用BMP4信号通路抑制剂进行诱导，这将使得细胞群中含有更多的定型内胚层细胞。多种对于Wnt信号通路具有促进作用的Wnt信号通路激动剂均可用于本发明。作为本发明的优选方式，所述的Wnt信号通路激动剂选自BIO或LiCl。作为本发明的优选方式，LiCl的用量是0.5-10mM;较佳的是l-8mM;更佳的是2-6mM。作为本发明的优选方式，BIO的用量是0.5-5uM;较佳的是0.8-4UM;更佳的是l-3uM，如2uM。本发明人在研究中发现，过高含量的LiCl或BIO可导致细胞发生明显的死亡。多种对于BMP4信号通路具有抑制作用的BMP4信号通路抑制剂均可用于本发明。作为本发明的优选方式，所述的BMP4信号通路抑制剂是Noggin。作为本发明的优选方式，Noggin的用量是100-600ng/ml;较佳的是150_500ng/ml;更佳的200-400ng/mI。Noggin是一种本领域已知的蛋白，其基因序列例如可以与GenelD:18121所示的序列基本上相同。ActivinA的用量可以根据本领域人员已知的适合用量。作为本发明的优选方式，ActivinA的用量是20-100ng/ml培养基；较佳的30-80ng/ml培养基；更佳的是50-80ng/ml培养基。步骤(l)和步骤(2)的培养或诱导时间可以根据本领域人员的经验来确定。作为本发明的优选方式，步骤(1)诱导拟胚体的时间在36-60小时，如48小时左右；步骤(2)诱导分化为定型内胚层细胞的时间在36-150小时或更长。本领域人员也可以通过在诱导过程中分析细胞群中多个细胞的性质来确定合适的时间。本发明还包括采用前述的制备方法获得的含定型内胚层细胞的细胞的细胞群。所述的细胞群中，定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的60%以上，较佳地占细胞整体数量的70%以上；更佳地占细胞整体数量的80%以上。利用FACS和表面标记技术，能够将定型内胚层细胞富集至�\"4+化(1140a-细胞群或Cxcr4+ZEpCam+细胞群中；利用RT-PCR以及其它基因表达分析技术，证明富集到的内胚层细胞纯度较高，很少有其它胚层细胞的污染。因此，本发明还包括经过分选技术分离出来的定型内胚层细胞含量更高的细胞群。优选地，所述的细胞群是细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群；或所述的细胞群是细胞表面Cxcr4分子阳性且Cdl40ci阴性的细胞群；或所述的细胞群是细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit阳性的细胞群。利用本发明的方法，可建立哺乳动物胚胎干细胞向定型内胚层分化的系统，为研究哺乳动物胚胎发育分子机制提供了研究模型。胚胎干细胞向内胚层的分化为细胞进一步向肝脏细胞或胰脏细胞分化奠定基�。�最终可实现胚胎干细胞向功能性肝脏细胞和/或胰脏细胞的高效分化，从而为细胞移植的临床研究和基础研究提供良好途径。本发明涉及的胚胎干细胞是非人哺乳动物的胚胎干细胞，或是通过商业途径购买的，而并非通过破坏胚胎的方式获得的胚胎干细胞。所述的胚胎干细胞优选的是非人哺乳动物胚胎干细胞，如兔、鼠、羊、猪、猴。较佳的，所述的胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞。早在1998年人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞就已经建系成功，例如1998年Thomson领导的小组从14个囊胚中最终建立起5个人类ES细胞系H1、H13、H14、H7禾口H19;Gearhart领导的小组从5-9周龄的流产胎儿的性腺嵴及肠系膜中分离原始的干细胞，以期避免因直接利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦。见晁岚等，"人胚胎干细胞的研究进展"，《现代妇产科进展》，2003年7月第12巻第4期。基于上述工作，在2000年的2月份，WisconsinAlumniResearchFoundation(WARF)建立了WiCell，WiCell是一家非官方的、非盈利性的附属机构，它以低费用向合格的科学家分配人胚胎干细胞。此外，提供这种现成的人胚胎干细胞的机构还包括NSCB(NationalStemCellBank)、ESCELLINTERNATIONAL、隨cell、TECHNION-HOMETOISRAEL'SNOBELSCIENTISTS、UCSF(UniversityofCaliforniaSanFransisco)等机构。12表面标志物作为本发明的优选方式，在获得了定型内胚层细胞占优势的细胞群后，还包括步骤从获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。本领域人员已知的多种定型内胚层细胞特定表面分子均可用于本发明，作为鉴定或分离定型内胚层细胞有用的分子。所述的细胞表面分子较佳的是Cxcr4分子和c-Kit分子，当待测细胞表面Cxcr4分子和c-Kit分子均是阳性(+)时，表示该待测细胞是定型内胚层细胞。Cxcr4是表达于胚胎发育早其中胚层和内胚层的膜蛋白，是趋化因子cxcl2的受体。该基因不表达于为分化的ES细胞和胚外组织，因此可以区分定型内胚层(DE)和内脏内胚层(VE)。已知该基因参与调节胚胎发育合成体细胞的迁移。Cxcr4的基因序列是本领域已知的，例如与GenelD:12767所示的序列基本上相同。c-kit，艮Pkitoncogene,表达于很多proginator细胞表面的膜受体，作为SCF(stemcdlfactor)受体，c-Kit主要介导scf信号通路，调节细胞的增值等。内胚层细胞表达c-kit。c-kit的基因序列是本领域已知的，例如与GeneID:16590所示的序列基本上相同。本发明人在研究中还着重于开发新的定型内胚层细胞特定的表面分子，找到了新的可用于鉴定或分离定型内胚层细胞的表面分子。因此，作为本发明的一种优选方式，采用Cxcr4分子和CD140a分子作为判断定型内胚层细胞的表面分子，分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140a分子阴性(-)的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。CD140a,艮卩pdgfra(plateletderivedgrowthfactorreceptoralpha),是表达于早期中胚层以及中胚层衍生细胞表面的膜受体，介导pdgf信号通路。本发明人发现内胚层细胞不表达CD140a。CD140a的基因序列是本领域已知的，例如与GenelD:18595所示的序列基本上相同。作为本发明的另一种优选方式，采用Cxcr4分子和EpCam分子作为判断定型内胚层细胞的表面分子，分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。EpCam，又名tumor-associatedcalciumsignaltransducerl(tacstdl)，是特异表达于上皮细胞表面的粘连分子，主要介导细胞与细胞之间的连接。中胚层细胞不表达epcam，而内胚层和ES细胞表达epcam。c-kit的基因序列是本领域已知的，例如与GenelD:17075所示的序列基本上相同。可以采用本领域技术人员已知的方法来鉴定或分离定型内胚层细胞群。较为经典的方法如荧光激活的细胞分选技术(FACS)或磁性细胞分选法，也即利用抗定型内胚层细胞特定表面分子的抗体从总的细胞群中分离表达内胚层细胞特定表面分子的细胞群。优选的方法例如是FACS法。各种细胞都有相应的表面分子表达方式，通过免疫荧光标记技术将细胞表面分子同标记有特异染料或荧光的一种或以上特异性抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下可产生一种或集中特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，从而可分析得到细胞群体的多种表面分子的表达情况，或分选出特定细胞。FACS法是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的细胞分析或分选技术，利用合适的细胞表面分子，通过FACS法来分析或分选细胞是本领域人员熟知的技术。培养基本发明还提供了一种用于制备定型内胚层细胞的分化培养基，所述的分化培养基含有无血清胚胎干细胞分化培养基，ActivinA，以及LiCl或BIO(或LiCl与BIO的组合)。所述的无血清胚胎干细胞分化培养基是本领域人员已知的培养基，其可以是多种配方的，任何可诱导胚胎干细胞形成拟胚体的胚胎干细胞分化培养基均可用于本发明，作为普通的胚胎干细胞分化培养基。例如，在NatBiotechnol，2006，24(11):1402-1411中，记载了无血清胚胎千细胞分化培养基。应理解，本领域人员均熟悉如何利用无血清胚胎干细胞分化培养基将胚胎干细胞诱导分化为拟胚体。作为本发明的优选方式，所述的无血清胚胎干细胞分化培养基含有70-80%体积比的IMDM;20-30%体积比的F12培养基；其中还添加按照体积0.2-2%的N2添加物；按照体积0.5-2%的B27添加物；0.2-1mg/ml的BSA;0.2-1mM的维生素C;和0.2-0.8mM的MTG。作为本发明的优选方式，所述的培养基中含有20-100ng/ml(较佳的30-80ng/mlActivinA;更佳的40-70ng/ml)ActivinA，和0.5-10mM(较佳的l-8mM;更佳的2-6ng/ml)LiCl，或0.5-5uM(较佳的0.8-4uM;更佳的l-3uM)BIO。作为本发明的更优选方式，所述的分化培养基还含有100-600ng/ml的14Noggin;较佳地，所述的分化培养基含有150-500ng/ml的Noggin;更佳的含有200陽400ng/ml的Noggin。本发明所述的分化培养基中，各组分均可以通过商购的途径获得。因此，根据本发明人提供的配方，可以方便地配制出所述的分化培养基。本发明的主要优点在于(1)本发明首次揭示一种无血清悬浮培养诱导胚胎干细胞高效分化为定型内胚层细胞并通过流式细胞术富集的新方法，该方法具有诱导条件简单，重复性高；诱导效率高的优点。(2)本发明的方法富集到的内胚层细胞纯度较高，很少有其它胚层细胞的污染。(3)本发明提供了新的表面标记，可良好地用于富集目的细胞群。(4)采用本发明的方法，不仅可为早期尤其是内胚层发育体外研究提供有用的模型，而且为定向分化研究创造性地建立了一套方法学，使得胚胎干细胞向定型内胚层分化简单易行，为进一步向内胚层衍生的器官，如肝脏细胞，胰腺内分泌细胞的定向分化奠定了重要基础。本发明所涉及的分化方案以动物内胚层发育的分子机制为理论依据，通过优化几条关键信号通路的协同作用，最终达到高效分化的目的；这充分说明，体外分化必须依赖合理的理论依据，而这一理论依据源于早期胚胎发育的体内机制。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1.培养基的配制1.无血清培养基的配制将IMDM与F12混合物按照如表1用量配制^_表1__IMDM75%(体积比)15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.低血清培养的培养基在GMEM培养基(购自Invitrogen)中，加入表3配方的成分。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3.本发明的分化培养基的配制在无血清培养基中加入ActivinA、LiCl/BIO或Noggin,得到分化培养基，如表4。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例2.诱导小鼠胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化及采用Cxcr4+Zc-Kit+标记的筛选利用上述配制的培养基诱导小鼠胚胎干细胞向定型内胚层细胞(DE)分化的方法，包括1)低血清培养小鼠ES细胞(购自ATCC，CRL-1821),保持未分化状态；2)将小鼠ES细胞用0.25。/。Trypin-EDTA(Gibco)消化，计数，按2乂104个/ml、总体积15ml种于10cm低贴壁细菌培养皿中，采用前述配制的无血清培养基于正常条件下培养48小时，使拟胚体形成；3)将拟胚体收集，用分化培养基6继续诱导48小时。4)将诱导的拟胚体消化成单细胞，用特异抗体标记，在不同的时间点(分别是采用分化培养基诱导后的第3天，第4天，第5天和第6天)采用FACS法进行分选和分析。FACS分析或分选方法具体如下-将细胞调整至1Xl(^个/ml，取100lil细胞，按lyg/lXl(^个细胞分别加入荧光素标记的抗Cxcr4抗体和抗c-Kit抗体(均购自R&D)，室温放置30分钟后用PBS离心洗涤2次，重悬细胞于PBS中，在流式细胞仪上检测Cxcr4和c-Kit标志的阳性率。结果发现，在诱导后第4天，获得Cxcr4+/c-Kit+(己知Cxcr4和c-Kit阳性的细胞为定型内胚层细胞)的细胞占整体细胞数的30%左右；随着诱导时间的增加，Cxcr4+Zc-Kit+的细胞比例发生下降，如图1所示。实施例3.诱导小鼠胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化1.采用Cxcr4+Zc-Kit+标记的筛选利用上述配制的培养基诱导小鼠胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化的方法，包括1)低血清培养小鼠ES细胞，保持未分化状态；2)将小鼠ES细胞用0.25%Trypin-EDTA(Gibco)消化，计数，按2X104个/ml、总体积15ml种于10cm低贴壁细菌培养皿中，采用前述配制的无血清培养基于正常条件下培养48小时，使拟胚体形成；3)将拟胚体收集，用50ng/mlActivinA和不同浓度(分别是0，1，2，5，10mM)LiCl的分化培养基继续诱导48小时；4)将诱导的拟胚体消化成单细胞，用抗Cxcr4抗体和抗c-Kit抗体标记，采用FACS法进行分选和分析。结果发现，在诱导后的4天内，获得Cxcr4+/c-Kit+的细胞占整体细胞数的比例随LiCl的浓度逐渐上升，由23.3%增加到80.8%;随着LiCl浓度的继续增加，(:^1"4+/(>^1+的细胞占整体细胞的比例基本不变，如图2所示。因此可见，加入LiCl活化经典Wnt信号通路，对AcitivinA有明显的促进作用；如图2A所示，LiCl以浓度依赖的形式，协同ActivinA诱导DE的分化，最高比例可达80%以上。2.采用Cxcr4+/CD140a1-标记的筛选基本方法同前述I，不同点在于采用Cxcr4+/CD140a1-作为细胞筛选的标记。即进行FACS时，采用荧光标记的抗Cxcr4抗体和抗CD140al抗体(购自eBioscience)标记细胞。结果发现，以Cxcr4+/Cdl40a-作为表面标记，Cxcr4+/Cdl40a-的细胞群占整体细胞群的比例达到约70%，也即筛选结果基本上接近于采用〔乂(^4+/^^1+筛选的结果，见图2B。3.采用Cxcr4+ZEpCam+标记的筛选基本方法同前述1，不同点在于(1)在步骤3)中，采用分化培养基l诱导。(2)采用。乂"4+化？�3111+作为细胞筛选的标记。即进行FACS时，釆用荧光标记的抗Cxcr4抗体和抗EpCam抗体(购自BDPharmingen)标记细胞。结果发现，以Cxcr4+ZEpCam+作为表面标记，Cxcr4+ZEpCam+的细胞群占整体细胞群的比例也达到约70%，也即筛选结果基本上接近于采用0乂(^4+/0^1+筛选的结果。4.诱导小鼠胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化并以Cxcr4+Zc-Kit+标记筛选基本方法同前述1，不同点在于在步骤3)中，采用分化培养基3或4或5进行诱导。结果发现，在诱导后的0-5天内，获得0乂"4+/(>1<^+的细胞占整体细胞数的比例逐渐上升，在第5天Cxcr4+Zc-Kit+的细胞约75%。实施例4.对诱导分化后的细胞群进行基因表达分析1.RealtimePCR通过RealtimePCR，对采用不同的诱导分化培养基所制备的细胞群进行基因表达分析。用于分析的基因是经典用于指示和区分定型内胚层细胞的基因标志，包括Soxl7、FoxA2、Cxcr4、Gsc、Cerl和Sox7，这些基因的高表达可表明所分析的细胞群是定型内胚层细胞群(或细胞群中定型内胚层细胞占据优势)。当进行PCR分析时，用于PCR扩增的引物分别如表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>采用RealtimePCR，检测加入ActivinA，加入或不加入LiCl、Noggin条件下DE相关各基因的表达情况；设置如下1.如实施例2的方法2.如实施例2的方法3.如实施例2的方法4.如实施例2的方法结果发现，在加入ActivinA和UC1条件下，可显著地提高分化为内胚层细胞的数量。进一步加入Noggin抑制BMP4信号，能够促使内胚层细胞的数20，采用分化培养基6进行诱导;，采用分化培养基8进行诱导;，采用分化培养基7进行诱导;，采用分化培养基2进行诱导。量进一步提高。但是，单独加入Noggin并没有明显上调DE相关基因的表达，需要在ActivinA，LiCl同时存在的条件下才可实现。见图3。因此，基因表达分析表明，分选出的该细胞群表达定型内胚层特异的基因，很少有其它胚层细胞的污染。2.RT-PCR为了进一步证实分选得到的0^4+/￡〔3111+目的细胞群能够代表定型内胚层，本发明人进一步采用RT-PCR对分选的细胞群进行基因表达分析。表达分析的部分基因及其对于的引物如表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>RT-PCR分析的结果见图4，表明定型内胚层的标志基因，如Soxl7，FoxA2，Cxcr4，Hhex等，在0^4+/丑？。301+细胞("+")中高表达；而其它胚层的基因虽有表达，但相比分选前细胞("EB")以及Cxcr4+ZEpCam-("-")细胞群，明显变弱。说明，定型内胚层细胞群通过？八05富集于"(^4+疋0&111+细胞群中，定型内胚层特异的标志基因也在该细胞群中高表达，验证了这一细胞群代表定型内胚层的真实性。结果表明，无论是Cxcr4+ZEpCam+还是Cxcr4+/Cdl40a-代表的定型内层，都高表达内胚层相关的标志性基因，如Soxl7，Cxcr4，FoxA2，Hhex等。而其它胚层的基因，如中胚层基因，Flkl，Pdgfra等，虽有表达，但与分选前细胞相比，表达明显降低。这说明，分选得到的细胞能够在很大程度上代表定型内胚层。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表aio〉中国科学院上海生命科学研究院〈120〉一种定型内胚层细胞的制备和分离方法<130>085114<160〉28<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉19<212〉醒<213〉人工序列<221>misc—feature<223〉引物<400>1gatgcgggatacgccagtg19<210〉2<211>19<212>DNA<213>人工序列<221>misc—feature〈223〉引物<柳>2ccaccacctcgcctttcac19〈210〉3<211>18<212〉謹<213〉人工序列<221〉raisc_feature〈223〉引物<400〉3actccatccgccactctc18<210〉4<211>18<212〉DNA<213〉人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400>4aggtagcagccgttctcg1823<210〉5<211〉20<212〉麵<213〉人工序列<221〉misc_feature<223〉引物<400〉5cgggatgaaaacgtccattt<210〉6<211>21<212>DNA<213〉人T.序列<22L>raise—feature<223〉引物<400〉6atgaccaggatcaccaatcca<210〉7<211〉18<212>DNA<213>人.T.序列<221〉misc—feature<223〉引物<■〉7gcaccgcaccatcttcac<210〉8<211〉20<212>DNA<213>人T:序列<221>misc—feature<223〉引物<400〉8gcttctgtcgtctccacttg<210〉9<211〉21<212>DNA<213>人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉9ctctggggaaggcagaccta'24<210〉10<211〉19<212〉腿<213〉人.T.序列<221〉misc一feature<223〉引物<400〉10ccacaaacagatccggctt<210>11<211>20<212,隱<213〉人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<■〉11agaacccggaccagcacaac<210〉12<211〉20<212>舰<213〉人丁.序列<221>misc一feature<223〉引物〈400〉12tgtcagcgccttccatgact<210〉13<211〉25<212〉廳<213〉人丁.序列<22〉misc_feature〈223〉引物<400〉13cattggccccttgtgaggccagaga<210〉14<211〉25<212〉醒<213〉人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉14acctgatggagcttgaaatagaggc25<210〉15<211>20<212>DNA<213〉人.T.序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉15aaggaactagaatgcgggct〈210〉16<211〉20<212〉DNA<213〉人T.序列<22>misc—feature<223>引物<400>16actccctgcttttactgggc<210〉17<211〉20<212>画<213>人工序列<221〉misc一feature<223>引物<400>17aatcctgcagacgagagcac<210〉18<211〉20<212〉DNA<213〉人工序列〈221〉misc—feature<223〉引物<400〉18gccaccaagggaa肪g3ttt<210>19<211〉23<212〉画<213>人工序列<221>misc—feature<223〉引物<400>1926actttccagctctttcaagagcc<210〉20<211〉23<212〉醒<213〉人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉20attgtgtactccccaactttccc<210〉21<211〉23<212>DNA<213〉人工序列<221>misc一feature<223〉引物<400〉21aaacttggggacagcaacatcag<210>22<211〉23<212>DNA<213>人工序列<221〉misc—feature<223〉引物<400〉22tcttttggtttgcagagacaggg<210〉23<211〉24<212〉腿<213〉人工序列<221〉misc_feature<223〉引.物<400〉23agtggcttcggaggccctctgtac<210〉24<211>29<212〉DNA<213〉人工序列<221〉misc_feature<223〉引物<400〉24说明书第23/24页2323232327gccggatcctgactgtcatccagcattaa29<210〉25《211〉21<212〉廳<213>人T.序列<221〉mjsc—feature<223〉引物<400〉25gaagcacatgcttgtccacgg21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<221〉misc一feature<223>引物〈400〉26gcctttgcgtgggttaggatg21<210〉27<211〉20<212>DNA<213>人丁序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉27ggtgggaatgggtcagaagg2C<210〉28〈211〉20<212〉麵<213〉人工序列<221〉misc一feature<223〉引物<■〉28aggaagaggatgcggcagtg2(权利要求1.一种制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法，其特征在于，所述方法包括(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；和(2)用含活化素A和Wnt信号通路激动剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60％以上。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在用Wnt信号通路激动剂处理的同时，还包括用BMP4信号通路抑制剂处理拟胚体。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Wnt信号通路激动剂选自(2'Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-肟或LiCl;或所述的BMP4信号通路抑制剂是Noggin。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，活化素A的用量是20-100ng/ml培养基；或LiCl的用量是0.5-10mM;或(2，Z,3，E)-6-Bromoindirubin-3'-肟的用量是0.5-5yM。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(3)从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群的方法是--分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群；或分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CDM0a分子阴性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群；或分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。7.—种含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60%以上，所述的细胞群采用以下方法获得(1)培养胚胎干细胞，形成拟胚体；和(2)用含活化素A和Wnt信号通路激动剂的分化培养基处理拟胚体，诱导拟胚体分化，从而获得含有定型内胚层细胞的细胞群。8.如权利要求7所述的细胞群，其特征在于，在步骤(2)之后，还包括从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且c-Kit分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且CD140ci分子阴性的细胞群，得到定型内胚层细胞群；或从所述含有定型内胚层细胞的细胞群中分选细胞表面Cxcr4分子阳性且EpCam分子阳性的细胞群，得到定型内胚层细胞群。9.一种用于制备定型内胚层细胞的分化培养基，其特征在于，所述的分化培养基含有无血清胚胎干细胞分化培养基，以及20-100ng/ml活化素A;和0.5-10mMLiCl或0.5-5uM(2'Z，3，E)-6-Bromoindirubin-3'-肟。10.如权利要求9所述的分化培养基，其特征在于，所述的分化培养基还含有100-600ng/ml的Noggin。11.如权利要求9所述的分化培养基，其特征在于，所述的无血清胚胎干细胞培养基含有70-80%体积比的IMDM;20-30%体积比的F12培养基；其中还添加按照体积0.2-2%N2添加物；按照体积0.5-2%B27添加物；U0.2-lmg/ml的BSA;0.2-lmM的维生素C;和0.2-0.8mM的3-巯基硫代甘油。12.权利要求9-11任一所述的分化培养基的用途，其特征在于，用于制备含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞占60%以上。13.—种CD140a分子的特异性抗体的用途，其特征在于，用于鉴定Cxcr4分子阳性的细胞或细胞群是否属于定型内胚层细胞或细胞群。14.一种EpCam分子的特异性抗体的用途，其特征在于，用于鉴定Cxcr4分子阳性的细胞或细胞群是否属于定型内胚层细胞或细胞群，或用于分离定型内胚层细胞或细胞群。全文摘要本发明公开了一种定型内胚层细胞(DE)的制备和分离方法；本发明还公开了用于促进定型内胚层细胞向分化的分化培养基，所述分化培养基含有活化素A和Wnt信号通路激动剂；本发明还公开了可用于分选内胚层细胞的表面标记。文档编号G01N33/53GK101684454SQ20081020048公开日2010年3月31日申请日期2008年9月25日优先权日2008年9月25日发明者丁小燕,李福明,欣王申请人:中国科学院上海生命科学研究院