专利名称：一种海洋贝类d形幼虫的石蜡切片方法
技术领域：
本发明属幼虫的石蜡切片领域，特别是涉及一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法。
背景技术：
石蜡切片技术是组织胚胎学的重要研究手段之一，其技术手段成熟稳定，且具有 组织胚胎结构完整、所获得的图像清晰，反差强烈等特点，可在普通光学显微镜下清晰地看 到组织胚胎外部形态和内部结构，具有不同于压片、冰冻切片和电镜的独特优势。石蜡切片 技术已被广泛应用于鱼类及哺乳动物胚胎及幼体的组织胚胎学及细胞学研究中。由于多数海洋贝类从D形幼虫起，幼虫表面开始覆盖一层钙质的幼体壳，手工无 法剥离，并且多数贝类的胚胎及幼虫个体微�。浅ひ话阋话俣辔⒚祝玷慰咨缺碊形幼虫 壳长为90 130 μ m，青蛤D形幼虫壳长为140 190 μ m，幼虫体积�。庋鄄蝗菀追直妫� 些都给脱水、透明、浸蜡、包埋等过程带来很大不便。海洋贝类幼虫的壳长、壳宽和壳高并不一致，包埋时应对幼虫进行定位，以方便切 片时能对幼虫进行纵切和横切，以便更好的观察研究海洋贝类幼虫的内部细胞、组织及器 官结构，系统地研究海洋贝类幼虫各个发育阶段内部细胞、组织及器官的发生、发育，为海 洋贝类早期胚胎及幼虫发育机理的深入研究和贝类遗传育种提供基础资料。但是，传统的 石蜡切片技术尚未解决上述诸多困难，所以，目前尚未有用石蜡切片技术来研究双壳贝类 幼虫发育过程的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋贝类D形幼虫(壳顶期幼虫、稚贝) 的石蜡切片方法，该方法简单易行，毋需增加仪器设备，可对直径> 60 μ m的大多数海洋贝 类的幼虫进行石蜡切片，处理时间短，完好地保存幼虫组织的原有形态及结构，为贝类早期 胚胎及幼虫发育研究提供了切实有效的技术手段。本发明的一种海洋贝类D形幼虫(壳顶期幼虫、稚贝)的石蜡切片方法，包括(1)将Bouin氏液加入存有海洋贝类D形幼虫样品的容器中，充分摇勻，待样品沉 降后，更换Bouin氏液，1-2小时更换一次，直至气泡消失，Bouin氏液固定12小时后，移入 质量百分比浓度70%酒精中，更换酒精直至完全洗去样品中的黄色，得到固定后的海洋贝 类D形幼虫；其中Bouin氏液与样品的体积比为10 1 50 1 ；酒精与样品的体积比为 10 1 50 1 ；(2)用500目或300目筛绢将上述固定后的海洋贝类D形幼虫包裹，放置于包埋盒 中，包埋盒经过脱水步骤，透明步骤和浸蜡步骤；(3)将经过步骤( 处理后的筛绢打开，放置在温度为50-60°C的铁质台上，将操 作区周围的环境温度调至40-45°C，用吸管吸取融化后温度为65 70°C的石蜡，将样品冲 散后吸入管内，将吸管内的样品注入盛满融化石蜡的铁质包埋盒底部，待样品沉降后在体式显微镜下用解剖针将样品调整到最佳位置，室温冷却包埋块；(4)将上述包埋块切片，切片厚度5 7μπι，蜡带用40°C _50°C恒温水浴展片，贴 于事先涂有粘片剂的载玻片上，然后烘烤；(5)染色采用苏木精-伊红复染方法，步骤如下二甲苯脱蜡5分钟3次、体积比 1 1的无水乙醇/ 二甲苯3分钟、95%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟、50% 乙醇3分钟、30%乙醇3分钟、蒸馏水3分钟、苏木精染液2 3分钟、自来水冲洗10 15 分钟、30%酸性乙醇分色(显微镜下控制至合适的颜色)、自来水冲洗10 15分钟复蓝， 至细胞核呈蓝色(或者在碱性自来水中浸洗3分钟后流水浸洗3分钟)、30%乙醇3分钟、 50%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、95%乙醇3分钟、伊红染液45秒 1 分钟、95%乙醇分色(显微镜下控制至合适的颜色)、无水乙醇3分钟2次、体积比1 1的 无水乙醇/ 二甲苯3分钟、二甲苯5分钟2次；之后用中性树胶封片，烘烤即得；上述溶液的 浓度均为质量百分比浓度。所述步骤(1)中的海洋贝类D形幼虫样品采用目数为500目或300目的筛绢网对 幼虫进行收集，充分排出多余的海水后将幼虫放置于容器的底部；其中500目聚乙烯筛绢 的孔径为25 μ m, 300目聚乙烯筛绢的孔径为48 μ m。所述步骤(1)中的Bouin氏液配方为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，三 者的体积比为15 5 1，其中苦味酸饱和液用盐度为30%。消毒海水配制。所述步骤O)中的脱水步骤具体为70%乙醇脱水1小时、80%乙醇脱水30分钟 2次、95%乙醇脱水15分钟2次和无水乙醇脱水15分钟2次，其中所述溶液的浓度均为质
量百分比浓度。所述步骤O)中的透明步骤具体为用体积比1 1的无水乙醇/ 二甲苯过渡处 理30分钟，再用二甲苯透明15分钟2次。所述步骤⑵中的浸蜡步骤具体为用体积比1 1的二甲苯/石蜡处理1小时， 52 56 °C熔点的石蜡浸蜡1小时30分钟。所述的步骤(5)中的苏木精染液的配方为苏木精4g，乙醇200ml，冰醋酸20ml， 甘油200ml，，蒸馏水200ml，钾矾(KAl (S04) 2 · 12H20)约10g，碘酸钠0. 4g ；先将苏木精4g 溶于200mL乙醇中，再加冰醋酸20mL，混合后加蒸馏水200mL和200mL甘油，然后加硫酸铝 钾(约IOg)至饱和，搅拌均勻，倒入瓶中，再加入0.4g碘酸钠，搅拌均勻，待溶液颜色变为 深红色即得到苏木精染液。所述步骤(5)中的30%酸性乙醇的配方为质量百分比浓度30%乙醇与IM盐酸 的混合液，在500ml质量百分比浓度30%乙醇中加入5滴约250 μ 1的IM的盐酸。所述步骤(5)中的碱性自来水的配方为自来水与IM氨水的混合液，500ml的自 来水中加入2滴约100 μ 1的IM氨水。所述步骤(5)中的伊红染液为0. 1 %的伊红染液，其配方为伊红Ig溶于IOOOml 95%酒精溶液。本发明改进了取样方法，改良了固定液的配方，解决了贝类幼虫包裹一层幼体壳， 难以进行剥离和切片的问题，克服了贝类幼虫体积小难以脱水透明浸蜡，包埋时幼体难以 定位的问题，改进了苏木精-伊红染色方法及操作时间，获得了良好的切片和染色效果。有益效果
与现有技术相比较，本发明的优点在于(1)通过500目或300目的筛绢收集样品，使样品相对纯化，避免水体中其它水生 生物及有机杂质对后续操作步骤的干扰；充分过滤去除海水，避免海水将固定液稀释，对固 定造成影响；(2)通过Bouin氏液对样品进行固定，Bouin氏液中的醋酸可以溶解幼体的钙质 壳，多次更换固定液对样品进行固定，克服了幼体壳对后续操作带来的不便；且Bouin氏液 中的苦味酸用海水配制，与海洋贝类幼体所生活的水体渗透压相近，使海洋贝类的幼虫内 部细胞、组织和器官不会因为渗透压不一致而扭曲变形甚至破裂。(3)通过500目或300目筛绢包裹样品进行脱水、透明、浸蜡，方法简单方便，易操作。(4)海洋贝类幼虫的脱水、透明和浸蜡时间较成体组织短且多为两步处理，保证了 试剂逐渐完全地进入细胞、组织和器官，完整地保存细胞、组织和器官的原有结构。(5)通过简单的操作，将样品吸入盛满融化石蜡的铁质包埋盒底部，待样品沉降后 在体式显微镜下用解剖针将样品调整，对样品进行定位，克服了幼虫个体小对定位带来的 操作不便。(6)采用改进的苏木精-伊红染色，获得的切片完整、清晰、反差强烈、色彩鲜艳， 便于观察。
图1栉孔扇贝早期D形幼虫期，壳长约60 μ m,其背部开始形成直的铰链，面盘周围 上生长许多纤毛，面盘一侧生有口，口和胃之间由消化道连接，Bar = lOym；图2D形幼虫期，壳长约为120 μ m,呈“D”字形，幼虫已经开始具有分化清晰的外套 膜、面盘、口、消化道、胃等组织器官，Bar = lOym；图3幼虫贝壳的背部和两侧中部开始突起膨大，进入壳顶期，幼虫壳长约为 150 μ m，壳顶期幼虫各个组织器官比D形幼虫期更加完善，组织器官的细胞数增多，各个组 织器官间的界限变得更加明显，Bar = 50 μ m ；图4稚贝期，稚贝的面盘退化，外套膜内出现鳃，消化腺周围形成膨大的闭壳肌， 闭壳肌和胃之间出现肾脏，除性腺还未发育外，稚贝的各个组织器官的发育已和成贝相差 无几，Bar = 50 μ m ；其中图1、图2、图3或图4中的C 纤毛；FL 鞭毛；V 面盘；S 胃；Ma 外套膜；Mo 口 ；E 食道；DG 消化腺；G 鳃；AM 闭壳肌。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1首先配制Bouin氏液、苏木精染液和伊红染液。
Bouin氏固定液取苦味酸饱和液375ml (用30%。消毒海水配制)、甲醛125ml和 冰醋酸25ml，混合液，混合均勻得到Bouin氏固定液。苏木精染液苏木精4g，乙醇200ml，冰醋酸20ml，甘油200ml，，蒸馏水200ml，钾 矾(KAl (S04) 2 · 12H20)约20g，碘酸钠0. 8g;先将苏木精4g溶于200mL乙醇中，再加冰醋 酸20mL，混合后加蒸馏水200mL和200mL甘油，然后加硫酸铝钾(约20g)至饱和，搅拌均 勻，倒入瓶中，再加入0. 8g碘酸钠，搅拌均勻，待溶液颜色变为深红色即得到苏木精染液。0. 的伊红染液伊红Ig溶于1OOOml 95%酒精溶液。海洋贝类D形幼虫(壳顶期幼虫、稚贝)的石蜡切片方法，包括1、样品收集取山东文登育苗场采集了栉孔扇贝早期D形幼虫、D形幼虫期、壳顶 期幼虫及稚贝，采用目数为500目或300目的筛绢网对幼虫进行收集，充分排出多余的海水 后将幼虫放置于采样管的底部；2、样品固定立即将Bouin氏液加入存有样品的采样管中，Bouin氏液与样品的体 积比为10 1 50 1，此时，采样管中会有气泡出现，充分摇勻，使样品与Bouin氏液混 勻，待样品沉降后，更换Bouin氏液，一小时更换一次，直至气泡消失，Bouin氏液固定12小 时后，移入70%酒精中，70%酒精与样品的体积比为10 1 50 1，每隔6小时更换一 次酒精，直至完全洗去样品中的黄色，置于70%酒精4°C冰箱中保存；3、脱水、透明和浸蜡程序用500目或300目筛绢将固定好的样品包裹，放置于样 品包埋盒中，包埋盒置于脱水机或染色缸中；脱水步骤70%乙醇脱水1小时、80%乙醇脱 水30分钟2次、95%乙醇脱水15分钟2次、无水乙醇脱水15分钟2次；透明步骤然后用 体积比1 1的无水乙醇/ 二甲苯过渡处理30分钟，再用二甲苯透明15分钟2次；浸蜡步 骤用体积比1 1的二甲苯/石蜡处理1小时，52 56°C熔点的石蜡浸蜡1小时30分 钟；4、包埋和样品定位将筛绢打开，放置在温度为60°C的铁质台上，将操作区周围 的环境温度调至45°C，用玻璃吸管吸取融化后温度为65 70°C的石蜡，将样品冲散后吸入 管内，将吸管内的样品注入盛满融化石蜡的铁质包埋盒底部，待样品沉降后在体式显微镜 下用解剖针将样品调整到最佳位置，室温冷却包埋块；5、切片和烘片用生物石蜡切片机切片，切片厚度5 7 μ m，蜡带用40°C恒温水浴 展片，贴于事先涂有粘片剂的载玻片上，然后在40°C烘箱中烘烤12小时；6、染色与封片染色采用苏木精-伊红复染方法，步骤如下二甲苯脱蜡5分钟3 次、体积比1 1的无水乙醇/ 二甲苯3分钟、95%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇 3分钟、50%乙醇3分钟、30%乙醇3分钟、蒸馏水3分钟、苏木精2 3分钟、自来水冲洗 10 15分钟、30%酸性乙醇分色(显微镜下控制分色至细胞核结构清晰，颜色呈蓝色，停 止分色)、自来水冲洗10 15分钟复蓝，至细胞核呈蓝色(或者在碱性自来水中浸洗3分 钟后流水浸洗3分钟)、30%乙醇3分钟、50%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟、80%乙醇3分 钟、95%乙醇3分钟、伊红45秒 1分钟、95%乙醇分色(显微镜下控制分色至切片上的曙 红不再脱落，细胞质呈粉红色，停止分色)、无水乙醇3分钟2次、体积比1 1的无水乙醇 / 二甲苯3分钟、二甲苯5分钟2次；之后用中性树胶封片；37°C烘箱中烘烤12小时；7、观察拍照与组织胚胎学研究使用Olympus BX51显微镜观察拍照，观察结果表 明，栉孔扇贝早期D形幼虫期，壳长约60 μ m,其背部开始形成直的铰链，面盘周围上生长许多纤毛，面盘一侧生有口，口和胃之间由消化道连接；D形幼虫期，壳长约为120 μ m，呈“D” 字形，幼虫已经开始具有分化清晰的外套膜、面盘、口、消化道、胃等组织器官；幼虫贝壳的 背部和两侧中部开始突起膨大，进入壳顶期，幼虫壳长约为150 μ m，壳顶期幼虫各个组织器 官比D形幼虫期更加完善，组织器官的细胞数增多，各个组织器官间的界限变得更加明显； 稚贝的面盘退化，外套膜内出现鳃，消化腺周围形成膨大的闭壳�。湛羌『臀钢涑鱿稚� 脏，除性腺还未发育外，稚贝的各个组织器官的发育已和成贝相差无几。
权利要求
1.一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，包括(1)将Bouin氏液加入存有海洋贝类D形幼虫样品的容器中，充分摇勻，待样品沉降 后，更换Bouin氏液，1-2小时更换一次，直至气泡消失，Bouin氏液固定12小时后，移入质 量百分比浓度70%酒精中，更换酒精直至完全洗去样品中的黄色，得到固定后的海洋贝类 D形幼虫；其中Bouin氏液与样品的体积比为10 1 50 1;酒精与样品的体积比为 10 1 50 1 ；(2)用500目或300目筛绢将上述固定后的海洋贝类D形幼虫包裹，放置于包埋盒中， 包埋盒经过脱水步骤，透明步骤和浸蜡步骤；(3)将经过步骤( 处理后的筛绢打开，放置在温度为50-60°C的铁质台上，将操作区 周围的环境温度调至40-45°C，用吸管吸取融化后温度为65 70°C的石蜡，将样品冲散后 吸入管内，将吸管内的样品注入盛满融化石蜡的铁质包埋盒底部，待样品沉降后在体式显 微镜下用解剖针将样品调整到最佳位置，室温冷却包埋块；(4)将上述包埋块切片，切片厚度5 7μπι，蜡带用40°C-50°C恒温水浴展片，贴于事 先涂有粘片剂的载玻片上，然后烘烤；(5)染色采用苏木精-伊红复染方法，步骤如下二甲苯脱蜡5分钟3次、体积比1 1 的无水乙醇/ 二甲苯3分钟、95 %乙醇3分钟、80 %乙醇3分钟、70 %乙醇3分钟、50 %乙醇 3分钟、30%乙醇3分钟、蒸馏水3分钟、苏木精染液2 3分钟、自来水冲洗10 15分钟、 30%酸性乙醇分色、自来水冲洗10 15分钟复蓝，至细胞核呈蓝色或者在碱性自来水中浸 洗3分钟后流水浸洗3分钟、30 %乙醇3分钟、50 %乙醇3分钟、70 %乙醇3分钟、80 %乙醇 3分钟、95%乙醇3分钟、伊红染液45秒 1分钟、95%乙醇分色、无水乙醇3分钟2次、体 积比1 1的无水乙醇/ 二甲苯3分钟和二甲苯5分钟2次；之后用中性树胶封片，烘烤即 得；其中溶液的浓度均为质量百分比浓度。
2.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤(1)中的海洋贝类D形幼虫样品采用目数为500目或300目的筛绢网对幼虫进行收集， 充分排出多余的海水后将幼虫放置于容器的底部；其中500目聚乙烯筛绢的孔径为25 μ m， 300目聚乙烯筛绢的孔径为48 μ m。
3.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤(1)中的Bouin氏液配方为苦味酸饱和液、甲醛和冰醋酸的混合液，三者的体积比为 15 5 1，其中苦味酸饱和液用盐度为30%。消毒海水配制。
4.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤( 中的脱水步骤具体为70%乙醇脱水1小时、80%乙醇脱水30分钟2次、95%乙醇 脱水15分钟2次和无水乙醇脱水15分钟2次，其中所述溶液的浓度均为质量百分比浓度。
5.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤O)中的透明步骤具体为用体积比1 1的无水乙醇/ 二甲苯过渡处理30分钟，再 用二甲苯透明15分钟2次。
6.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤O)中的浸蜡步骤具体为用体积比1 1的二甲苯/石蜡处理1小时，52 56°C熔 点的石蜡浸蜡1小时30分钟。
7.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述的步骤(5)中的苏木精染液的配方为苏木精4g，乙醇200ml，冰醋酸20ml，甘油200ml，，蒸 馏水200ml，钾矾10g，碘酸钠0. 4g ；先将苏木精4g溶于200mL乙醇中，再加冰醋酸20mL， 混合后加蒸馏水200mL和200mL甘油，然后加硫酸铝钾至饱和，搅拌均勻，倒入瓶中，再加入 0. 4g碘酸钠，搅拌均勻，待溶液颜色变为深红色即得。
8.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤(5)中的30%酸性乙醇的配方为质量百分比浓度30%乙醇与IM盐酸的混合液，在 500ml质量百分比浓度30%乙醇中加入5滴IM的盐酸。
9.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤( 中的碱性自来水的配方为自来水与IM氨水的混合液，500ml的自来水中加入2滴 约100 μ 1的IM氨水。
10.根据权利要求1所述的一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，其特征在于所述 步骤(5)中的伊红染液为0. 的伊红染液，其配方为伊红Ig溶于IOOOml 95%酒精溶 液。
全文摘要
本发明涉及一种海洋贝类D形幼虫的石蜡切片方法，包括(1)将Bouin氏液加入存有海洋贝类D形幼虫样品的容器中，移入质量百分比浓度70％酒精中，得到固定后的海洋贝类D形幼虫；(2)将固定后的海洋贝类D形幼虫包裹，放置于样品包埋盒中，包埋盒置于脱水机或染色缸中；经过脱水步骤，透明步骤和浸蜡步骤；(3)包埋和样品定位；(4)切片和烘干；(5)采用苏木精-伊红复染方法染色。本方法方法简单易行，处理时间短，并有过渡步骤，使幼虫的各组织逐渐完全地被试剂浸入，完好地保存幼虫组织的原有形态及结构，为贝类早期胚胎及幼虫发育研究提供了切实有效的技术手段。
文档编号G01N1/30GK102147337SQ201110006378
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者么宗利, 周凯, 应成琦, 李子牛, 来琦芳 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所
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