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专利名称：：评价或筛选毛生长调节剂的方法
技术领域：
：本发明涉及利用猪的毛囊评价或筛选毛生长调节剂的方法。技术背景一般地，关于毛，人们往往根据部位而希望促进毛生长或抑制毛生长。例如，不少人为因精神压力和遗传等而造成的毛发稀疏和毛发脱落感到苦恼。另外，还有人对所谓无用毛处理感到麻烦。关于毛，已知存在依赖于雄性激素的毛和不依赖于雄性激素的毛。例如，认为从前额部至头顶部的脱发或该部分向后退的男性型脱发症、以及胡须和腿毛、腋毛等的毛与雄性激素密切相关，而颞颥部毛、头后部毛、眉毛、睫毛则受雄性激素影响小(非专利文献1、非专利文献2)。因此，从各个方面开发了用于调节毛的伸长的毛生长促进剂和毛生长抑制剂(专利文献1和2)。基于能够迅速且简便地进行评价或筛选的观点，近年来，在毛生长促进剂和毛生长抑制剂的探索中，采用人和小鼠"大鼠的毛囊的细胞培养和毛囊的器官培养法(非专利文献35、专利文献3和4)。采用人的毛囊的器官培养进行的筛�。�虽然数据的可靠性高，可是人的毛囊本身不易得到，所以不适于进行大量的筛选。另外，采用小鼠，大鼠的毛囊的器官培养进行的筛�。�虽然能够经常得到，可是由于使用实验动物，基于爱护动物的观点，也不适于进行大量筛选。专利文献1日本特开2005—206536号公报专利文献2日本特开2006—8657号公报专利文献3日本特开平11—49647号公报专利文献4日本特开2002—62289号公报非专利文献1EblingFJ等人，临床内分泌代谢(ClinEndocrinolMetab.)，15巻，319—339(1986)非专利文献2StennKS等人，生理学综述(PhysiolRev.)，81巻，449—494(1993)非专利文献3T.Jindo.等人，皮肤病学杂志(TheJournalofDermatology),Vol.20，756—762,1993.非专利文献4宇塚诚和A奏T泽千加，日皮志，104(8),979—987,1994.非专利文献5M.P.Philpott等人，细胞科学杂志(JournalofCellScience),97，463—471，1990.
发明内容本发明涉及提供利用容易得到的动物的毛囊评价或筛选毛生长调节剂的方法。本发明的发明人研究了新的评价或筛选毛生长调节物质的体系后发现，当将猪的各部位的毛囊进行器官培养时，存在其生长受5ct-二氢睾丸酮(以下，简写为DHT)影响的毛囊和不受DHT影响的毛囊，通过使用这些毛囊，可以评价或筛选雄性激素依赖性或非依赖性毛的生长调节剂。艮口，本发明提供一种评价或筛选毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。本发明还提供一种评价或筛选雄性激素依赖性毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的腹部或背部的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。本发明还提供一种评价或筛选男性型脱毛症用毛生长促进剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的腹部的毛囊进行器官培养，对促进该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。本发明还提供一种评价或筛选雄性激素依赖性毛生长抑制剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的背部的毛囊进行器官培养，对抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。本发明还提供一种评价或筛选雄性激素非依赖性毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的侧腹、腹股沟部、肩或臀部的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。根据本发明，因为能够使用容易大量得到的肉用猪的毛囊，所以可以简便且有效地评价或选择具有毛生长促进效果或毛生长抑制效果的物质。具体实施方式本发明的评价或筛选毛生长调节剂的方法是将猪的特定部位的毛囊进行器官培养并对促进或抑制其生长的物质进行评价或者选择的方法。如下述实施例所示，在作为雄性激素之一的DHT的存在下，将猪的各部位的毛囊进行器官培养，当用不添加DHT的相同部位的毛的伸长量比较该毛囊的生长时，发现腹部的毛的伸长量大幅度地减少，背部的毛的伸长量大幅度地增加，侧腹、腹股沟部、肩或臀部的各毛的伸长量大致相等(实施例1)。即，在猪的毛囊的生长中发现根据猪的毛囊的来源部位，存在其生长受DHT影响的毛囊和不受DHT影响的毛囊。另一方面，关于人的毛发，很早以前就己知道从前额部至头顶部的脱发或该部分向后退的男性型脱毛症，其症状随雄性激素而发展，已知抗雄性激素剂对此是有效的。另外，据报告，胡须和腿毛的生长受雄性激素促进(EblingFJ等人，ClinEndocrinolMetab.，15巻，319—339(1986))，并认为颞颥部毛、头后部毛、眉毛、睫毛受雄性激素影响小(StennKS等人，PhysiolRev.，81巻，449—494(2001))。因此认为，猪的腹部的毛囊的生长，是雄性激素依赖性的且类似于被雄性激素抑制的毛的生长，例如人的从前额部至头顶部的毛发等的生长；猪的背部的毛囊的生长，是雄性激素依赖性的且类似于被雄性激素促进的毛的生长，例如人的胡须、腿毛、胸毛、阴毛等的生长;猪的侧腹的毛囊、腹股沟部的毛囊、肩的毛囊和臀部的毛囊的生长，类似于不受雄性激素影响的毛，例如人的颞颥部的毛、头后部的毛、眉毛、睫毛等的生长。因而，认为可以以猪的特定部位的毛囊的生长为指标来评价或筛选雄性激素依赖性毛生长调节剂、男性型脱毛症用毛生长促进剂、雄性激素依赖性毛生长抑制剂以及雄性激素非依赖性毛生长调节剂等的毛生长调节剂。具体地，可以通过例如以下的工序(1)(3)来进行本发明的评价或筛选。(1)使猪的特定部位的毛囊接触被检物质的工序；(2)将该毛囊进行器官培养并测定其生长并且将该生长与未接触被检物质的毛囊的生长进行比较的工序；(3)基于(2)的结果将促进或抑制毛囊的生长的被检物质作为毛生长调节剂进行评价或选择的工序。所谓猪的毛囊，是指取自猪的皮肤的围绕毛根全体的组织，具体地指包含毛干、毛乳头、毛母细胞、毛根等的与毛的伸长相关的器官的全体组织。本发明中，在这种毛囊中，使用处于生长期的毛囊(生长期毛囊)。这里，对于成为毛囊采取对象的猪，只要是有毛的猪，可以使用任何品种。然而，一般地，可以使用为达肉用目的而杂交得到的猪的品种。作为肉用而被改良的猪，例如，可以列举将英国的约克夏州地区使用本地品种与中国品种、那不勒斯品种(Neapolitanbreed)和莱斯特品种(Lesterbreed)等交配得到的有白色毛的约克夏品种(有大中小的3种类型)；将英国的伯克郡(Berkshire)和威尔夏郡(Wilshire)地区的本地品种与暹罗品种(Siamesebreed)、中国品种和那不勒斯品种等杂交得到的有黑色毛的巴克夏品种；将丹麦的本地品种与大约克夏品种交配得到的有白色毛的兰德瑞斯(landrace)品种；原产美国的马萨诸塞州和肯塔基州的有黑色毛的汉普夏品种；在美国由原产欧洲的红色系的猪与在新泽西州经改良后的红色系的猪交配得到的杜罗克(D腦c)品种等。作为在日本被血统维持的注册品种，有中约克夏品种co、巴克夏品种(B)、兰德瑞斯品种(L)、大约克夏品种(W)、汉普夏品种(H)、杜罗克品种(D)这6个品种。作为一般的肉用猪，除了纯种的巴克夏品种的黑猪之外，还有很多为将这些品种彼此组合而得到的杂种。例如，可举出将兰德瑞斯品种(L)的血统的猪"栃木L"与大约克夏品种(W)交配得到的"LW雌猪"再与杜罗克品种(D)交配而产下的"栃木LaLa猪";将北京黑猪品种与巴克夏品种与杜罗克品种杂交得到的"TokyoX"等。其中，优选使用易判断生长期毛的约克夏品种、兰德瑞斯品种等的有白色毛的品种及其杂种。使用肉用猪时，可以从取得了肉后的猪的皮肤上取得毛囊，不会仅为取得毛囊而伤害动物，因此是优选的。作为使用部位，可以列举腹部、背部、侧腹、腹股沟部、肩或臀部等，可以根据评价目的进行选择。即对于男性型脱毛症用毛生长促进剂的评价或筛�。�优选使用腹部的毛囊；对于胡须和臂毛，腿毛等的雄性激素依赖性毛的生长调节(毛生长促进或毛生长抑制)剂的评价或筛�。�优选使用背部的毛囊;对于雄性激素非依赖性毛的生长调节(毛生长促进或毛生长抑制)剂的评价或筛�。�优选使用侧腹的毛囊、腹股沟部的毛囊、肩的毛囊或臀部的毛囊。可以采用下述方法进行毛囊的采�。�即切取对应于评价目的的部位的猪皮，在无菌的条件下，切除脂肪组织后，分离毛囊。可以采用例如预先添加被检物质于培养液中使其达到规定的浓度之后在培养液内载置毛囊的方法，或者，添加被检物质于载置有毛囊的培养液中使其达到规定的浓度的方法，来进行毛囊与被检物质的接触。可以采用小鼠的胡须的毛囊的器官培养(非专利文献4)等的公知的毛囊的器官培养方法，来进行毛囊的器官培养。例如可以通过在渗透有培养液的灭菌网等的盘上，载置所采取的毛囊，在37。C的温度下，在含有C02的空气气相下，进行通常为256日、优选为421曰的培养。作为培养液，例如，可以列举RPMI1640培养基、William'sMediumE培养基、DMEM/HamF12(1:l)培养基等。可以适当添加琼脂和明胶。另外，根据需要，还可添加抗生素、氨基酸、血清、生长因子、活体提取物等。毛囊的生长的测定，例如，可以列举利用图像解析或在显微镜下用测微计测定毛的伸长量和粗细的增减的方法，测定器官培养后的毛囊中的细胞增殖活性或增殖细胞数量的方法，测定与毛囊的生长的强度成反比地多见于毛囊中的凋亡细胞的方法等。在毛囊的生长的测定中，采用图像解析或在显微镜下用测微计测定毛的伸长量和粗细的增减的方法时，例如，可以列举测定由毛球部基底部至毛干顶端的长度，然后测量从培养开始时起的毛的伸长量；或者通过比较毛尖和毛根附近的伸长的毛干的粗细而测定粗细的增减的方法等。上述情况下，促进或抑制毛囊的生长的物质的评价可以如下所述，即使毛囊接触被检物质，进行器官培养，将测定得到的毛的伸长量或粗细与未接触被检物质的毛的伸长量或粗细(对照标准)进行比较，求得当规定对照标准为100时的伸长率(％)或粗细的变化率(％)，基于该结果进行评价。而且，值越高，评价被检物质越促进毛的生长；或者值越低，评价被检物质越抑制毛的生长。另外，测定毛囊中的细胞的增殖活性、呼吸活性或增殖细胞数量时，例如，可以列举在器官培养的培养基内添加溴脱氧尿苷并根据导入DNA中的溴脱氧尿苷的量测定DNA合成能从而测定细胞增殖活性的方法；或者，使用AlamarBlue检测和MTT检观U(用线粒体的NADH还原作为基质添加的四唑盐并测定其生成物的吸光度和趋势的方法)等测定细胞的呼吸活性的方法；或者，通过作为增殖细胞标记的Ki67和PCNA(增殖细胞核抗原，ProliferationCellNuclearAntigen)的抗体进行的染色来测定增殖细胞数量的方法等。上述情况中，促进或抑制毛囊的生长的物质的评价可以是，使毛囊接触被检物质，进行器官培养，将如上所述测定的增殖活性或增殖细胞数量与未接触被检物质的毛囊的增殖活性或增殖细胞数量(对照标准)进行比较，求得当规定对照标准为100时的增殖活性比率(％)或增殖细胞数量比率(％)，基于该结果进行评价。而且，计算所得的值越高，评价被检物质越促进毛的生长；或者，计算所得的值越低，评价被检物质越抑制毛的生长。另外，测定毛囊中的凋亡细胞时，例如，可以列举测定细胞凋亡进行时的片段DNA量的方法；或者，根据TUNEL法等测定凋亡细胞数量的方法等。上述情况中，促进或抑制毛囊的生长的物质的评价可以是使毛囊接触被检物质，进行器官培养，将如上所述测定的片段DNA量或凋亡细胞数量与未接触被检物质的毛囊的片段DNA量或凋亡细胞数量(对照标准)进行比较，求得当规定对照标准为IOO时的片段DNA量比率(％)或凋亡细胞数量比率(％)，基于该结果进行评价。而且，所得的值越低，评价被检物质越促进毛的生长；或者，所得的值越高，评价被检物质越抑制毛的生长。实施例实施例1(1)毛囊的分离作为猪皮，使用从在日本作为肉用猪饲养的有白色毛的杂种的猪得到的皮肤，按适当尺寸分切，切除多余的脂肪，在无菌的环境下，在双氯苯双胍乙烷液(将5%双氯苯双胍乙垸液(住友制药公司制造)用水稀释成520倍)中，浸泡5分10分，进行消毒，接着，用D—PBS进行数次清洗。接着，在实体显微镜下，用小镊子和手术刀(FEATHERNo10)，从已处理了的猪皮上分离毛囊，将其集中于培养基中。作为培养基，使用RPMI1640培养基(Gibcocat.No.11835—030)、William'sMediumE培养基(Gibcocat.No.12551—032)和DMEM/HamF12(1:l)培养基(Gibcocat.No.11039—021)。(2)DHT对猪的毛囊器官培养的影响按照(l)的方法，从猪的背部、侧腹、腹部、腹股沟部、臀部、肩得到猪的毛囊。将分离得到的毛囊放入24孔培养板中，每孔放入1根。在每孔内加入培养基William'sMediumE培养基(Gibcocat.No.12551—032)400jiL。使用按1。/。的比例添加有青霉素/链霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培养基。使用上述William'sMediumE培养基，调制成使DHT(SigmacatNo.A—8380)在培养基中的最终浓度为10ng/mL。在37'C、5%002的环境下，在恒温箱中，进行6日培养。每隔1日、或2日置换1次培养基。将培养6日后的毛的伸长量与对照标准比较。作为对照标准，使用不添加DHT的William'sMediumE培养基，规定器官培养后的毛的伸长量为100%。再者，毛的伸长量的测定为规定培养开始日为第0日，在第0日和第6日，利用CCD摄像机(pixeramodel.No.PVC100C),拍摄实际状态的显微镜图像，根据该图像，测定由毛球部基底部至毛干顶端的长度变化。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*器官培养第6日，规定对照标准为100%。通过表1显示，即使是猪的毛囊，其生长也受DHT的影响；还显示根据部位，DHT的影响程度不同。腹部的毛囊，其生长受DHT抑制。因此，该毛囊的伸长促进剂，可以成为对男性型脱毛症有效的毛生长促进剂。另外，背部的毛囊，其生长被DHT促进。因此，该毛囊的伸长抑制剂，可以成为雄性激素依赖性且被雄性激素促进生长的毛的毛生长抑制剂。其它部位的毛囊，受DHT的影响小。因此，该毛囊的伸长促进剂或伸长抑制剂，可以成为不经由雄性激素作用而起作用的毛的毛生长促进剂或毛生长抑制剂。实施例2毛生长调节剂的评价(1)t-黄烷酮和TGF-卩2按照与实施例1同样的操作，得到猪的臀部的毛囊。作为培养基，使用RPMI1640(Gibcocat.No.11835—030)培养基。使用在RPMI1640培养基内按1。/。的比例添加有青霉素/链霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培养基。使用上述RPMI1640培养基，调制作为不属于医药品的毛生长促进剂的有效成分即在大鼠的胡须的毛囊的器官培养中被确认具有毛生长促进作用的t-黄烷酮(反式-3,4'-二甲基-3-羟基黄垸酮(堀田等人，香味杂志(FragranceJournal),第31巻第2期，33—40(2003)))，使培养基中的最终浓度为liaM(关于合成方法，参考日本特开2000—198779)。而且，关于在人的毛囊的器官培养中被确认具有毛生长抑制作用的TGF-卩2(R&DSystem,Inc.,型号102—B2—001/CF)(Philpott等人，JCellSci，97巻，463—47(19卯)；Soma等人，JInvestDermatol，118巻，993—997(2002))，也调制成10ng/mL。在37。C、5。/。C02的恒温箱中，进行8日培养。每隔1日、或2日置换1次培养基，测定培养8日后的毛的伸长量与对照标准比较。采用与实施例1同样的方法评价毛囊的生长量。作为对照标准，使用不添加被检物质的RPMI1640培养基，规定器官培养后的毛的伸长量为100%。[表2]被检物质规定对照标准为100时的毛伸长率(％)t-黄烷酮(lpM)145TGF-卩2(10ng/mL)59器官培养第8日，RPMI1640培养基与对照标准相比，看到了t-黄垸酮具有毛伸长率达145%的毛伸长促进效果，而在TGF-(32方面看到具有毛伸长率为59%的毛伸长抑制效果。(2)环孢子素A按照与实施例1同样的操作，得到猪的臀部的毛囊。作为培养基，使用William'sE培养基(Sigmacat.No.W1878)培养基。使用在William'sE培养基内按1。/。的比例添加有青霉素/链霉素(Gibcocat.No.15140—122)溶液的培养基。使用上述William'sE培养基，调制在人毛囊的器官培养中被确认具有毛生长促进作用的环孢子素A(CsA)(Sigmacat.No.C-1832)(Taylor等人，JInvestDermatol,100巻，237—239(1993))，使培养基中的最终浓度为100ng/mL、1000ng/mL。在37。C、5%C02的恒温箱中，进行7日培养。每隔1日、或2日置换1次培养基，测定培养7日后的毛的伸长量，并与对照标准比较。采用与实施例1同样的方法评价毛囊的生长量。作为对照标准，使用不添加被检物质的William'sE培养基，规定器官培养后的毛的伸长量为100%。[表3]<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>与对照标准相比，看到了CsA(100ng/mL)具有毛伸长率达到116%的毛伸长促进效果，而在CsA(1000ng/mL)方面看到具有毛伸长率达到120%的毛伸长促进效果。(3)总结因此，显示可以以猪臀部的毛的伸长量为指标来评价毛生长调节剂。权利要求1.一种评价或筛选毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。2.—种评价或筛选雄性激素依赖性毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的腹部或背部的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。3.—种评价或筛选用于男性型脱毛症的毛生长促进剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的腹部的毛囊进行器官培养，对促进该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。4.一种评价或筛选用于雄性激素依赖性毛的毛生长抑制剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的背部的毛囊进行器官培养，对抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。5.—种评价或筛选雄性激素非依赖性毛生长调节剂的方法，其特征在于在被检物质的存在下，将猪的侧腹、腹股沟部、肩或臀部的毛囊进行器官培养，对促进或抑制该毛囊的生长的物质进行评价或者选择。全文摘要本发明提供一种利用了容易得到的动物的评价或筛选毛生长调节剂的方法。该评价或筛选毛生长调节剂的方法的特征在于在被检物质的存在下，对猪的毛囊进行器官培养，评价或者选择促进或抑制该毛囊的生长量的物质。文档编号G01N33/15GK101251528SQ200810080430公开日2008年8月27日申请日期2008年2月18日优先权日2007年2月22日发明者伊藤纪子,布施千绘,森脇繁,笹嶋美知代申请人:花王株式会社