专利名称：逆转或降低食管癌放疗抗性的增敏剂、筛选方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和免疫治疗领域，具体而言涉及逆转或降低食管癌放疗抗性的增敏剂、筛选方法及其用途。进一步地，涉及对食管癌放疗抗性基因的基因沉默剂、沉默方法及其用途。本发明通过对选择的特定抗性基因的沉默，能够有效地实现放疗的增敏效果，进而能够更好地进行个体化治疗，为食管癌的治疗提供更有效的治疗方案。
背景技术：
食管癌是常见的恶性肿瘤，在全世界是第六位癌症相关的死亡原因[EnzingerPC&Mayer RJ. Esophageal cancer. N Engl J Med 2003 ;349 :2241 2252]。已知放射治疗是食管癌的主要治疗手段之一，但局部失败率高达50% -55%，即使增加放疗或化疗剂量仍然不能改善局控率[Cooper J 等人，Radiation Therapy Oncology Group for the Chemoradiotherapy of locally advanced esophageal cancer Long-term follow-upof a prospective randomized trial (RT0G85-01). JAMA 1999 ;281 :16231627 ;MinskyB 等人，INT 0123 (Radiation Therapy Oncology Group 94-05)phase III trial ofcombinedmodality therapy for esophageal cancer :High_dose versus standard-doseradiation therapy. J Clin Oncol 2002 ;20 :11671174]。目前研究发现放疗局部失败除了与肿瘤乏氧、剂量限制性毒性降低照射量等因素有关外，与放射抵抗密切相关。可以说放射抵抗是放疗后局部复发的主要原因。体内食管癌瘤中某些基因的表达状态直接影响着癌细胞的放射抗性[K Fukuda等人，Differentialgene expression profiles of radioresistant oesophageal cancer cell linesestablished by continuous fractionated irradiation. British Journal of cancer，2004 ；91 (8) :1543-1550] o对局部失败率高达50% -55%的这部分患者人群，有必要寻找与食管癌的放疗抗性相关基因，并以之为靶点获得能够增敏放疗抗性基因的增敏剂，借助这种筛选抑制或者消除放疗抗性，进而为这部分食管癌患者提供个体化治疗，提高患者的生存率。
发明内容
为了实现上述发明目的，发明人进行了多方面的研究工作，先在抗性敏感基因搜索方面进行了大量工作。主要包括应用包含48000个探针的Illumine_6_V3人类全基因组芯片，对比调查了经多次照射产生放射抵抗性的食管癌细胞系KYSE-170R及其亲代细胞系KYSE-170的基因表达谱差异。由qRT-PCR和Western blot证实该基因确实存在差异表达。应用慢病毒介导的RNA干扰体系在体内外验证差异基因与放射抵抗的关系，并对该基因在食管癌患者病理组织中的表达情况进行回顾性分析。试验结果表明食管癌细胞系KYSE-170R及其亲代细胞系KYSE-170的基因在未照射、照射后8小时及照射后24小时分别有945，733和1232个表达差异基因。qRT-PCR结果提示相对于亲代细胞系KYSE-170，放射抵抗细胞系KYSE-170R在未照射、照射后8小时及照射后24小时AKR1C3分别有9. 39，5. 94和9. 20倍的表达上调。Western blot结果证实，在未照射的放射抵抗细胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表达量显著高于亲代细胞系KYSE_170(P< O. 05)。应用慢病毒介导的RNA干扰体系沉默AKR1C3后，放射抵抗细胞系KYSE-170R的放射敏感性显著增强，应用AKR1C3过表达质粒转导亲代细胞系KYSE-170发现其放射抵抗性显著增强。机制探讨初步结果提示，AKR1C3沉默引起的放射敏感性增强，很可能与ROS晚聚集和放疗后48小时内G2期细胞阻滞有关。在对食管癌患者病理组织中的表达·情况进行回顾性分析中，发明人发现AKR1C3表达于食管癌细胞，正常食管粘膜细胞，间质细胞及小血管上皮中。正常食管粘膜细胞的表达量明显低于高分化食管鳞癌细胞；高分化食管鳞癌细胞表达量明显高于低分化食管鳞癌细胞。而且后续的研究表明，AKR1C3可能会为食管癌，尤其是食管高分化鳞癌，提供新的放射增敏药物作用靶点。总之，经过上述多方面努力，发明人终于找到了与食管癌抗性相关的基因-AKR1C3 (Homo sapiens aldo-keto reductase family 1，memberC3(3-alphahydroxysteroid dehydrogenase, type II) (AKR1C3)，经检索发现该序列的 Genbank 号为NM—003739，其全序列如下I gcccattgtt tttgtaatct ctgaggagaa gcagcagcaa acatttgcta gtcagacaag61 tgacagggaa tggattccaa acaccagtgt gtaaagctaa atgatggcca cttcatgcct121 gtattgggat ttggcaccta tgcacctcca gaggttccga gaagtaaagc tttggaggtc181 acaaaattag caatagaagc tgggttccgc catatagatt ctgctcattt atacaataat241 gaggagcagg ttggactggc catccgaagc aagattgcag atggcagtgt gaagagagaa301 gacatattct acacttcaaa gctttggtcc acttttcatc gaccagagtt ggtccgacca361 gccttggaaa actcactgaa gaaagctcaa ttggactatg ttgacctcta tcttattcat421 tctccaatgt ctctaaagcc aggtgaggaa ctttcaccaa cagatgaaaa tggaaaagta481 atatttgaca tagtggatct ctgtaccacc tgggaggcca tggagaagtg taaggatgca541 ggattggcca agtccattgg ggtgtcaaac ttcaaccgca ggcagctgga gatgatcctc601 aacaagccag gactcaagta caagcctgtc tgcaaccagg tagaatgtca tccgtatttc661 aaccggagta aattgctaga tttctgcaag tcgaaagata ttgttctggt tgcctatagt721 gctctgggat ctcaacgaga caaacgatgg gtggacccga actccccggt gctcttggag781 gacccagtcc tttgtgcctt ggcaaaaaag cacaagcgaa ccccagccct gattgccctg841 cgctaccagc tgcagcgtgg ggttgtggtc ctggccaaga gctacaatga gcagcgcatc901 agacagaacg tgcaggtttt tgagttccag ttgactgcag aggacatgaa agccatagat961 ggcctagaca gaaatctcca ctattttaac agtgatagtt ttgctagcca ccctaattat1021 ccatattcag atgaatatta acatggaggg ctttgcctga tgtctaccag aagccctgtg1081 tgtggatggt gacgcagagg acgtctctat gccggtgact ggacatatca cctctactta1141 aatccgtcct gtttagcgac ttcagtcaac tacagctgag tccataggcc agaaagacaa1201 taaattttta tcattttgaa ataa(SEQ ID NO :1)该序列可以参见NCBI Genbank 网页 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM—003739. 4)，
在通过多个试验确定AKR1C3蛋白与放射抗性密切相关后，发明人对其进行了多方面检索，发现醛酮还原酶超家族(AKRlC)与肿瘤生物学非常密切。AKRlC家族为37kDa可溶性蛋白，可通过NAD(P) (H)介导的氢离子传递作用，将羰基还原为羟基。AKR1C3属于醛酮还原酶超家族成员。在人类，AKRlC有四个亚型，即AKRlCl，AKR1C2，AKR1C3和AKR1C4。AKR1C3有大于86 %的序列与其余3个AKRs同源。AKR1C3具有3 a -HSD, 17 β -HSD,20 a -HSD，和前列环素(PG)F合成酶活性，能够催化雄激素、雌激素、前列腺素和前列环素及外源性物质的代谢。AKRlC3mRNA首先被发现与表达于乳腺和前列腺，随后在肝脏、肺、小肠、肾上腺、脑、子宫和睾丸陆续报道发现该基因的表达。AKR1C3已被证明在多种类型癌症中表达失调，包括骨髓增生异常综合征(MDS，难治性贫血)，子宫内膜癌，肺癌中表达上调。但是目前，AKR1C3在食管癌中的表达尚无报道。
为了构建药物合适的药物筛选模型，并且进一步确认放射抗性与AKR1C3的关系，发明人构建了系列靶向AKR1C3的载体作为候选药物在细胞水平和动物水平检测该筛选方法的可行性。具体是通过所述构建的载体来沉默AKR1C3的表达，对沉默后的细胞进行放射检验，观察该基因沉默与放射抗性间的关系。此处，实施例中所用的候选药物是反义分子，事实上还可以采用各种已知的化合物库等对所述候选药物进行检测。也可以通过其它能够对AKR1C3的表达进行调节的化合物例如蛋白核酸等进行筛选。具体地，发明人建立了细胞筛选模型和动物筛选模型，选取三种已知对AKR1C3基因有靶向作用的基因作为候选药物，在动物体上对AKR1C3进行沉默筛�。猿聊晒Φ穆闶蟮姆帕瓶剐越屑煅椋环矫嫜橹ち松秆∧Ｐ偷目煽啃裕环矫娑陨秆〉降哪康男蛄械脑雒粜Ч屑煅�。结果从三个候选基因中筛选到一个有效的沉默序列，并且食管癌荷瘤裸鼠试验结果表明，沉默AKR1C3后，放射抵抗细胞系KYSE-170R的放射敏感性显著增强。对放疗后残留的裸鼠肿瘤组织进行HE染色发现，沉默AKR1C3后的放射抵抗细胞系KYSE-170R形成的肿瘤组织内为大量�：圩橹霾辛粜×恐琢鱿赴哉盏姆派涞挚瓜赴礙YSE-170R形成的肿瘤组织内有大量肿瘤细胞残留。沉默AKR1C3将引起食管鳞癌细胞放射敏感性增强。该结果将为AKR1C3成为放疗增敏药物靶点提供生物学依据，尤其是针对食管高分化鳞癌。同时也验证了本发明的增敏剂效果。由此，一方面，本发明提供了用于食管癌放疗抗性的增敏治疗的靶点-AKR1C3基因，还提供了用于食管癌放疗抗性的增敏治疗的基因药物，其为AKR1C3基因表达抑制剂，或者沉默剂，优选地，所述增敏剂是反义核酸。任选地，其中含有药学上可接受的佐剂。另外一方面，本发明提供了用于食管癌放疗抗性的增敏治疗的方法，其包括使AKR1C3基因沉默或者表达抑制的步骤。优选地，在所述步骤之前，对待治疗个体进行食管癌细胞分类检验，优选对食管鳞癌个体实施所述步骤，进一步优选对食管鳞癌高分化个体实施所述步骤。具体地，所述步骤为对有此需要的个体给予有效量的AKR1C3基因沉默剂或者AKR1C3基因抑制剂。一方面，本发明提供了一种非治疗目的用于食管癌放疗抗性细胞的筛�。浒ǘ运鱿赴凳〢KR1C3基因沉默或者表达抑制的步骤。其中所述细胞是离体的，或者所述细胞是来自食管鳞癌个体的，优选来自食管鳞癌高分化个体的。另外一方面，本发明提供了一种非治疗目的用于食管癌放疗抗性动物的筛�。浒ǘ运龆锸凳〢KR1C3基因沉默或者表达抑制的步骤。所述动物可以是荷有食管癌放疗抗性细胞的大鼠，小鼠或者兔子等。本发明中使用AKR1C3基因沉默或者表达抑制的步骤包括施用药物实现这一效果，所述的药物，例如为基因治疗药物。也可以通过基因敲除技术等使之沉默。一方面，本发明提供了 AKR1C3基因表达抑制剂或沉默剂在制备用于食管癌放疗抗性的增敏治疗的基因药物中的用途，其中，所述的抑制剂可以是茉莉酸甲酯(Methyljesmonate, MeJ);茉莉酸(Jesmonate, JA)。在本发明中，所述的沉默剂是指能够在体外或者体内使AKR1C3基因不表达的化合物，其可以是核酸片段，蛋白质，糖类等，也可以是化学小分子。
本发明中，所述的抑制剂是指能够在体外或者体内使AKR1C3基因不表达或者低表达的化合物，其可以是核酸片段，蛋白质，糖类等，也可以是化学小分子。其作用的靶点可以是AKR1C3基因本身，也可以是AKR1C3基因表达的调控元件，例如启动子等。进一步地，一方面，本发明提供了食管癌放射抗性增敏剂的初步筛选方法，其包括(I)提供高表达AKR1C3基因的宿主细胞；(2)提供候选药物；(3)使(I)的宿主细胞和(2)的候选药物在合适的条件下接触；(4)检测(3)中的经过候选药物作用的宿主细胞的AKR1C3基因的表达；能够使AKR1C3基因表达下调或者消失的候选药物，判定为具有食管癌放射抗性增敏剂潜力的药物。任选地，可以进行随后的动物试验等进行验证。其中，高表达AKR1C3基因的宿主细胞是指相对未转染AKR1C3基因的宿主细胞其
表达量高。另外一方面，本发明提供了食管癌放射抗性增敏剂的细胞水平筛选方法，其包括(I)提供高表达AKR1C3基因的食管癌细胞；(2)提供候选药物；(3)使(I)的食管癌细胞和⑵的候选药物在合适的条件下接触；(4)检测(3)中的经过候选药物作用的食管癌细胞的AKR1C3基因的表达；(5)能够使AKR1C3基因表达下调或者消失，同时保持食管癌细胞存活的候选药物可以判定为是食管癌放射抗性增敏剂。其中，高表达AKR1C3基因的食管癌细胞是指相对放射敏感的食管癌细胞其表达量高，例如KYSE-170R细胞系。其中，所述在合适的条件下接触，是指使高表达AKR1C3基因的食管癌细胞的正常生长除了受候选药物影响外，其它生长条件与常规生长条件一致。一方面，本发明还提供了食管癌放射抗性增敏剂的动物水平的筛选方法，其包括(I)提供荷有高表达AKR1C3基因的食管癌肿瘤的动物；(2)提供候选药物；
(3)将足够量的(2)的候选药物给予(I)的动物，连续给药一定时间；(4)检测(3)中的给药后的动物所荷肿瘤的大�。�(5)能够使AKR1C3基因表达下调或者消失，同时使肿瘤变小或者消失的的候选药物可以判定为是食管癌放射抗性增敏药物。其中，高表达AKR1C3基因的食管癌细胞是指相对放射抗性的食管癌细胞其表达量高，例如KYSE-170R细胞系。其中所述动物可以是裸鼠，也可以是其它试验动物。其中的给予方式可以是通过口腔给药，静脉输注，或者瘤内注射等。以下，通过附图对本发明进行说明。
图I :表示的是放射抵抗细胞系KYSE-170R和非放射抗性细胞系KYSE-170间的差异表达基因的比较结果。其中，图I-A :KYSE_170R及KYSE-170细胞系芯片差异比较结果。可以发现，在未照射、照射后8小时及照射后24小时分别有945，733和1232个表达差异基因。其中，AKR1C3在3个时间点的Illumine差异值均彡50。其中Illumine差异值彡20被认为是基因表达上调；Illumine差异值< ~20被认为是基因表达上调。图I-B :应用qRT-PCR在mRNA水平上的验证，由图可发现在mRNA水平AKR1C3表达差异显著。与亲代KYSE-170细胞相比，在照射后0h，8h及24h，抵抗的KYSE-170R细胞中AKR1C3的表达分别上调了 9. 39，5. 94和9. 20倍。图I-C =Western blot结果，该结果证实，在未照射的放射抵抗细胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表达量显著高于亲代细胞系KYSE-170(*P < O. 05)。图2 AKR1C3沉默的KYSE-170R细胞和亲代KYSE-170细胞中过表达AKR1C3后的放射抗性检测结果。其中图2-A :表示qRT-PCR的结果，其表明AKR1C3沉默效率达60%。图2_B、C :表示western blot的结果,其证实在蛋白水平,AKR1C3表达明显下调。图2-D、E AKR1C3沉默的KYSE-170R细胞的放射抗性检测，克隆形成试验结果提示，未照射时，scramble-shRNA-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 细胞克隆形成率无显著性差异，说明AKR1C3沉默并不影响KYSE-170R的增殖。经2，4，8Gy照射后，AKR1C3沉默的KYSE-170R细胞克隆形成数显著减少，放射敏感性明显增强。E中■代表scrambIe-shRNA-KYSE-170R 细胞组； 代表 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 细胞组。图2_F、G :在对放射相对敏感的亲代KYSE-170细胞中过表达AKR1C3后的Westernblot验证结果。其中将AKR1C3过表达质粒瞬时转染亲代细胞株KYSE-170，并瞬时转染scramble质粒作为对照。结果Western blot验证过表达效果显著。图2-H、I :克隆形成试验检测AKR1C3过表达的KYSE-170细胞的放射抗性。结果未照射时scramble-KYSE-170及AKR1C3+KYSE-170细胞克隆形成率无显著性差异，说明AKR1C3过表达并不影响KYSE-170的增殖。经2，4，8Gy照射后，AKR1C3过表达的KYSE-170细胞克隆形成数显著增多，放射抵抗性明显增强。I中■代表AKR1C3+KYSE-170细胞组；·代表 scramble-KYSE-170 细胞组。图3A-I :裸鼠成瘤模型检测靶基因沉默后对瘤体放射抵抗性的影响。其中，
图3-A 当瘤体直径达到6_8mm时,第2组和第4组给予15Gy的照射剂量单次局部照射的状况。图3-B :根据观察结果，绘制裸鼠肿瘤体积变化曲线。曲线提示在接受放疗后，与接种 scramble-shRNA-KYSE-170R 细胞相比，稳定沉默 AKR1C3 的 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R细胞所形成的肿瘤，体积缩小更为显著；而两组在未接受放疗时，肿瘤生长速度无明显差异。 代表 scramble-shRNA-KYSE-170R细胞组；■代表 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R细胞组；▲代表 scramble-shRNA-KYSE-170R 细胞 + 放射治疗组；+AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 细胞 +放射治疗组。图3-C :对未接受放疗的裸鼠肿瘤组织进行免疫组织化学法检测其中的AKR1C3蛋白的结果。其为scramble-shRNA-KYSE-170R组AKR1C3蛋白表达量明显高于AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 组。图3-D :对未接受放疗的裸鼠肿瘤组织进行免疫组织化学法检测其中的AKR1C3蛋 白的结果，其为 AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 组。图3-F :对放疗后残留的裸鼠肿瘤组织进行HE染色结果，其表明AKRlC3-shRNA-KYSE-170R细胞所形成的肿瘤组织内为大量瘢痕组织仅残留小量肿瘤细胞。图3-E:对放疗后残留的裸鼠肿瘤组织进行HE染色结果，其表明作为对照的scramble-KYSE-170R细胞形成的肿瘤组织内有大量肿瘤细胞残留。图3-G :取第 I 组 scramble-KYSE-170R 组及第 3 组 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R组各3只进行qRT-RCR的结果。图3-H，I :取第I组scramble-KYSE_170R组及第3组AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 组各 3 只进行 western blot 的结果。图4 :在应用免疫组织化学法，对食管癌患者病理组织中AKR1C3的表达情况进行回顾性分析结果。其中图4-A :在6例食管低分化鳞癌患者病理标本中的表达，图4-B :在6例食管高分化鳞癌患者病理标本中的表达；图4-C :在癌旁正常食管粘膜细胞病理标本中的表达。图4-D :图4A-C的结果比较图。以下，通过具体实施例对本发明进行说明，此处所述的实施例仅用来阐述本发明，其不用于限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员根据现有技术和本发明的教导得到的本发明的变体或者等价的发明都包含在本发明的保护范围内。
具体实施例方式实施例I :放疗抗性基因的确认I.细胞系和放疗方法人类食管鳞癌细胞系KYSE-170(保藏日2011年6月14日，保藏号CGMCCNo :4937，分类命名为人类食管鳞癌细胞系的KYSE-170)，及经过反复照射后形成的放射抵抗细胞系KYSE170R(保藏日2011年6月14日，保藏号CGMCC No :4936，分类命名为人类食管鳞癌细胞系的KYSE-170R)。以上KYSE-170和KYSE-170R两株均保藏于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(GMCC)。以上两株细胞均由美国MD Anderson Cancer Center胸部肿瘤放射治疗科惠赠。以上细胞系应用高糖1640培养液(购自Invitrogen公司)，HEK293T细胞(由北京大学药学院国家重点实验室提供)培养于高糖DMEM培养液(购自Invitrogen公司)。上述培养液临用时加入10%的灭活胎牛血清(FBS，购自HyClone公司)及青链霉素(各50单位/mL)即可。培养条件37°C温箱,5% CO2。应用Backman Zl细胞计数仪计数细胞个数(购自美国Backman公司)。于北京大学第一临床医院肿瘤放射治疗科，应用6MV-X-射线，对细胞进行照射(直线加速器购自美国瓦里安公司)。2.细胞总RNA的提取和基因芯片结果给予处于对数生长期的KYSE-170及KYSE-170R细胞4Gy剂量照射，应用TotalRNA提取试剂盒(SV Iosolation System购自promega公司)，在照射前(Oh)及照射后不同时间点(8h，24h)提取细胞总RNA。应用Illumine-6_V3人类全基因组芯片，筛选KYSE-170及KYSE-170R在上述时间点基因的表达变化差异(由上海生物芯片有限公司完成)。 结果参见图1，其中Illumine差异值彡20被认为是基因表达上调；Illumine差异值彡-20被认为是基因表达上调。对比分析KYSE-170R及KYSE-170细胞系芯片结果发现，在未照射、照射后8小时及照射后24小时分别有945，733和1232个表达差异基因。其中，AKR1C3在3个时间点的11 Iumine差异值均彡50，所以发明人选取该基因进行下一步实验。3.应用qRT-PCR及Western blot验证芯片结果(I)给处于对数生长期的KYSE-170及KYSE-170R细胞予4Gy剂量照射，应用TotalRNA提取试剂盒(SV Iosolation System购自promega公司)，在照射前(Oh)及照射后不同时间点(8h, 24h)提取细胞总RNA。应用逆转录试剂盒(AMV Reverse Traslation System购自promega公司)将总RNA逆转录成CDNA,应用Go Taq qPCR Master Mix酶(购自promega公司)行qRT-PCR。PCR引物由Primer 3. O软件设计，并经Blast验证其特异性。目标序列AKR1C3 (GenBank 号NM_003739，SEQ ID NO 1)上游引物5，atttggcacctatgcacctc3，(SEQ ID NO 2)；下游引物5’ tgagttttccaaggctggtc 3，(SEQ ID NO:3)；目标序列β-acting上游引物5，agcgagcatcccccaaagtt3，(SEQ ID NO 4)；下游引物5，gggcacgaaggctcatcatt3，(SEQ ID NO:5)。应用Roche 480 PCR仪(美国Roche公司)行PCR反应，具体条件第一个循环(950C -10 分钟);第二个循环(95°C -30 秒，60°C -30 秒，72°C -30 秒)X 40。mRNA 表达差异倍数计算公式如下Δ CT (KYSE170R/KYSE170) = CT (AKR1C3) -CT ( β -acting) ； Δ Δ CT =Δ CT (KYSE-170R) - Δ CT (KYSE-170);表达差异倍数=2_ΔΔετ.应用qRT-PCR验证后发现在mRNA水平AKR1C3表达差异显著。与亲代KYSE-170细胞相比，在照射后0h，8h及24h，抵抗的KYSE-170R细胞中AKR1C3的表达分别上调了 9. 39，
5.94 和 9. 20 倍(见图 1-B)。(2)应用 Western blot 分析 AKR1C3KYSE-170 及 KYSE-170R 细胞中的含量。取对数生长期的KYSE-170及KYSE-170R细胞，用冷的PBS洗2次，根据细胞量的多少，加入适量蛋白裂解液(RPIA购自Applygene公司)，置于冰浴上裂解30min。4°C14000rpm离心30min,弃下层沉淀,收集上清即为细胞全蛋白。应用Bio-Rad蛋白定量试剂盒(Bio-Rad,Hertfordshire,United Kingdom)定量蛋白，分装。应用 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将凝胶上蛋白转移至ECL Chemiluminescent substrate膜(AmershamPharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA上，用含有5%脱脂奶粉和O. I %吐温的封闭液室温封闭I小时。一抗4°C孵育过夜，次日用TBST洗4次，每次5min，然后于二抗中室温孵育2小时。TBST洗4次，每次15min。所用抗体鼠抗人AKR1C3单克隆抗体(I 1000)购自Sigma公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体(I 1000)购自Santa Cruza公司。二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔单克隆抗体(I : 4000)购自Santa Cruza公司。所有Western blot至少重复2次,实验结果应用Quantity One imaging program分析程序进行相对定量分析(Bio-Rad, Hercules, CA)。上述Western blot结果证实，在未照射的放射抵抗细胞系KYSE-170R中AKR1C3蛋白表达量显著高于亲代细胞系KYSE-170(*P < 0. 05)，见图1-C。实施例2 :用放疗抗性细胞建立药物筛选模型I.沉默AKR1C3的shRNA慢病毒质粒载体构建和最佳shRNA载体筛选·为了构建药物合适的药物筛选模型，并且进一步确认放射抗性与AKR1C3的关系，发明人选择放疗抗性KYSE-170R细胞系作为筛选细胞，同时构建了系列靶向AKR1C3的载体作为候选药物。具体是通过所述构建的载体来沉默AKR1C3的表达，对沉默后的细胞进行放射检验，观察该基因沉默与放射抗性间的关系。慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-I (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。发明人应用优化改建的慢病毒载体PSD31 (Zhang J等人，A more efficient RNAi induciblesystem for tight regulation of gene expression in mamma Iian cells and xenograftanimals. RNA. 2007Aug ；13(8) :1375-83.)，携带可以靶向沉默 AKR1C3 的 shRNA 序列，转染细胞，沉默目的基因。发明人查阅Sigma公司网络数据库，选取3组靶向沉默AKR1C3基因的shRNA序列进行载体构建，分别命名为shRNA(O) ；shRNA (I) ；shRNA (2)其引物序列和具体靶点见下。shRNA引物由北京华大基因合成。应用人类U6启动子，启动转录过程。其中，人类U6启动子序列如下5，-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’ (SEQ ID NO 6),作为阴性对照的无功能siRNA(scramble),上，下游引物序列见文献(Zhang J等人，A more efficient RNAi inducible system for tight regulation of geneexpression in mammalian cells and xenograft animals. RNA. 2007Aug ； 13 (8)1375-83)，其中，scramble的下游引物序列如下下游引物5’-CTCTATCATTGATAGAGTGACTCCAGTGGTAATCTACCTCTTCTTTACCTTCTTTA-3’ (SEQ IDNO :7)，3条沉默AKR1C3的序列的下游引物序列如下shRNA(O):其对应于 SEQ ID NO 1 的碱基位置:148-168
5’ -AGGATCCAAAAACCAGAGGTTCCGAGAAGTAAACTCGAGTTTACTTCTCGGAACCTCTGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO :8)；shRNA⑴其对应于SEQ ID NO :1的碱基位置693-983 5，-AGGATCCAAAAACCTAGACAGAAATCTCCACTACTCGAGTAGTGGAGATTTCTGTCTAGGCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO :9)；shRNA⑵其对应于SEQ ID NO 1的碱基位置372-390 5，-AGGATCCAAAAACTCACTGAAGAAAGCTCAATTCTCGAGAATTGAGCTTTCTTCAGTGAGCCCGGTGTTTCGTCCTTTCCACCCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO: 10)。shRNA (O) - (2)这三个沉默载体的沉默序列的上游引物均为
5，-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’ (SEQ ID NO :11)。hU6-shRNA序列通过PCR方法合成，具体步骤参见文献[Y. Chen等人，Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breastcancer cell invasion invitro, Cancer Res. 2003(63)48014804 ;S. Matsukura 等人，Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns,Nucleic AcidsRes. 31 (2003)e77]。应用T4DNA 连接试剂盒(NEB，Beverly, MA, USA)，将上述 PCR 产物与 pGEM T easyvector载体进行连接，送华大基因公司进行DNA测序验证连接正确性。测序正确的TA克隆质粒，根据mega tansl. O (Origen)转染试剂盒步骤,瞬时转染KYSE-170R细胞。然后进行Western blotting 进行选择。结果发现通过Western blotting实验验证,在候选的三个针对AKR1C3的沉默基因中，载体shRNA(2)的效果最好。即反义序列SEQ ID NO :I的碱基位置372-390能够有效沉默AKR1C3的表达。在用pGEM T easy vector载体进行瞬时转染验证成功后,发明人为了建立稳定的筛选模型，又构建了可以稳定转染的载体。具体方法应用BamHI FastDigest内切酶(购自Fermentas公司)酶切前述验证的沉默效果好的AKRlC3-shRNA(2)，并选择了 PSD31慢病毒载体(携带puromycin抗性基因)做为新的载体，将该载体进行酶切，制造连接粘末端，通过Rapid DNA Dephos&LigionKit连接试剂盒(ROCHE)将两者连接，测序验证连接成功。2.构建能够稳定沉默靶基因AKR1C3的载体应用mega tans I. O (Origen)转染试剂盒，将 PSD31-AKRlC3_shRNA 及病毒包装辅助质粒VSVG、PRSV及PMDL质粒(购自Invitrogen公司)共转染HEK 293T细胞(购自Invitrogen公司)，进行病毒包装,应用mega tans I. O (Origen)转染试剂盒。其中，共转染4个质粒就是病毒包装过程。其中，PSD31-AKRlC3_shRNA质粒是形成病毒的核心部分，VSVG、PRSV及PMDL病毒包装辅助质粒是辅助核心质粒，起作用是辅助病毒包膜形成，细胞吐病毒等过程的。收集48小时及72小时上清(病毒液)转导KYSE-170R经Puromycin筛选10天后，应用qRT-PCR和Western blot验证。qRT-PCR结果表明，AKR1C3沉默效率达60% (图2-A), western blot结果证实在蛋白水平，AKR1C3表达明显下调(*P < O. 05)(参见图2-B、C)。
以上结果表明发明人建立了稳定表达PSD31-AKRlC3-shRNA的KYSE-170R细胞系。由此，发明人通过有效的细胞模型筛选得到了有效的AKR1C3表达沉默剂。3.克隆形成实验对比观察靶基因沉默后细胞系与原抵抗细胞系放射敏感性的变化克隆形成实验是评价放射治疗效果的经典实验。发明人将检测在不同照射剂量下，AKR1C3基因稳定沉默细胞系克隆形成数量与未沉默细胞系scramb I e-shRNA-KYSE-170R (该株系是与 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 同时建立的作为阴性对照的细胞株。不同之处是，scramble-KYSE_170R连入的是无功能基因scramble。具体见建立稳定沉默AKR1C3细胞系试验)的区别。克隆形成数量反映了该细胞系对放射治疗的敏感性。克隆形成越多，其敏感性越低，抵抗性越强。给予对数生长期的scramble-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE_170R 细胞照射， 剂量依次为(2，4，8Gy)，然后胰酶消化，细胞计数仪Vi-CELL (购自BECKMAN公司)计数细胞。根据不同照射计量，调整接种细胞数量。在相同剂量下，将等量的scramble-KYSE-170R 及 AKRlC3-shRNA-KYSE-170R 细胞接种于六孔板上，经7-10天培养,取出，固定,结晶紫染色(Sigma Chemical Co.),应用计数克隆数(包含50个及以上细胞的记为一个克隆)。计数相应细胞未照射时的克隆数以纠正接种率，增强可比性。克隆形成试验结果示于表1，该结果提示，未照射时，scramble-shRNA-KYSE_170R及AKRlC3-shRNA-KYSE-170R细胞克隆形成率无显著性差异，说明AKRlC3沉默并不影响KYSE-170R的增殖。经2，4，8Gy照射后，AKR1C3沉默的KYSE-170R细胞克隆形成数显著减少，放射敏感性明显增强(*P < O. 05，**P < O. 01)。(见图2-D、E)表-1AKR1C3沉默的KYSE-170R细胞克隆形成率变化表(均数土标准差)
__soramble-shRNA-KYSE-170R__AKRlC3-shRNA-KYSE-17 OR
OGYII
2GY0. 6646 ± 0. 21780. 3740 ± O. 0873
4GYO. 2267 ± 0. 0236O. 0433 ±0.135
8GY__O. 0190 ± O. 055__O. 0014 ± O. 0005_4.过表达AKR1C3的放疗敏感细胞建立的药物筛选模型既然AKRlC3沉默后，放射抵抗的KYSE-170R细胞放射敏感性增强，发明人将AKR1C3过表达质粒(Origene公司Cat. No SC321532)瞬时转染亲代细胞株KYSE-170，方法同上。瞬时转染scramble质粒作为对照。对放射相对敏感的亲代KYSE-170细胞中过表达AKR1C3，探索其放射敏感性的变化和药物筛选效果。Western blot验证过表达效果显著(*P < O. 05)(图 2-F、G)。克隆形成试验结果示于表2,该结果提示，未照射时scramble-KYSE-170及AKR1C3+KYSE-170细胞克隆形成率无显著性差异，说明AKR1C3过表达并不影响KYSE-170的增殖。经2，4，8Gy照射后，AKR1C3过表达的KYSE-170细胞克隆形成数显著增多，放射抵抗性明显增强(*P < O. 05，**P < O. 01)。(见图 2-H、I)表-2AKR1C3过表达的KYSE-170细胞克隆形成率变化表(均数土标准差)
权利要求
1.逆转或降低食管癌放疗抗性的增敏药物，其为AKR1C3基因表达抑制剂或沉默剂。
2.权利要求I的增敏药物，其中还含有药学上可接受的佐剂。
3.权利要求I的增敏药物，其中的食管癌是食管鳞癌。
4.AKR1C3基因表达抑制剂或沉默剂在制备用于逆转或降低食管癌放疗抗性的增敏治疗的药物中的用途。
5.食管癌放射抗性增敏剂的初步筛选方法，其包括 (1)提供高表达AKR1C3基因的宿主细胞； (2)提供候选药物； (3)使(I)的宿主细胞和(2)的候选药物在合适的条件下接触； (4)检测(3)中的经过候选药物作用的宿主细胞的AKR1C3基因的表达；和 (5)能够使AKR1C3基因表达下调或者消失的候选药物，判定为具有食管癌放射抗性增敏剂潜力的药物。
6.食管癌放射抗性增敏剂的细胞水平筛选方法，其包括 (1)提供高表达AKR1C3基因的食管癌细胞； (2)提供候选药物； (3)使(I)的食管癌细胞和(2)的候选药物在合适的条件下接触； (4)检测(3)中的经过候选药物作用的食管癌细胞的AKR1C3基因的表达； (5)将使AKR1C3基因表达下调或者消失，同时保持食管癌细胞存活的候选药物判定为食管癌放射抗性增敏剂。
7.权利要求6的方法，其中的食管癌细胞是KYSE-170R细胞系或者转化了AKR1C3表达载体的KYSE-170细胞系。
8.食管癌放射抗性增敏剂的动物水平的筛选方法，其包括 (1)提供荷有高表达AKR1C3基因的食管癌的动物； (2)提供候选药物； (3)将足够量的(2)的候选药物给予(I)的动物，连续给药一定时间； (4)检测(3)中的给药后的动物所荷肿瘤的大小或所荷肿瘤中的AKR1C3基因表达水平; (5)使AKR1C3基因表达下调或者消失，同时使肿瘤变小或消失的 候选药物判定为食管癌放射抗性增敏潜在药物。
9.一种非治疗目的体外逆转或降低食管癌细胞放疗抗性的方法，其包括对实施沉默或者表达抑制AKR1C3基因的步骤。
10.AKR1C3基因检测剂在制备用于检测患者食管癌放疗抗性高低、放疗敏感性高低或者区分鳞癌分化程度的药物中用途。
11.权利要求10的用途，其中的AKR1C3基因检测剂是特异性检测AKR1C3基因的DNA探针。
12.权利要求11的用途，其中特异性检测AKR1C3基因的DNA探针固定在载体上。
13.AKR1C3基因在筛选用于逆转或降低食管癌放疗抗性的增敏治疗的药物中的用途。
14.AKR1C3基因作为食管癌病人不适合放疗或放疗效果不显著的诊断生物标志物的用途。
15.AKR1C3基因作为食管癌病人对放疗的敏感性差的诊断生物标志物的用途。
16.AKR1C3作为区分食管高分化鳞癌和低分化鳞癌的生物学标志物的用途。
全文摘要
本发明涉及逆转或降低食管癌放疗增敏剂、筛选方法及其用途。具体而言涉及对逆转或降低食管癌放疗抗性基因的基因沉默剂、沉默方法及其用途。本发明通过对选择的特定抗性基因的沉默，能够有效地实现放疗的增敏效果，进而能够更好地进行个体化治疗，为食管癌的治疗提供更有效的治疗方案。
文档编号G01N33/15GK102836433SQ20111016989
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月23日 优先权日2011年6月23日
发明者周德敏, 高献书, 熊伟, 赵静, 张礼和 申请人:北京大学, 北京大学第一医院
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