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专利名称：基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法
技术领域：
本发明属于生物技术和水环境监测技术领域，涉及ー种基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法。
背景技术：
近10余年来的研究表明，水环境中存在大量病毒，这些病毒或感染进入水生生物细胞内、或漂浮在水体中，被称为浮游病毒。浮游病毒是水体中含量最高的生物类群。浮游病毒含噬菌体(噬藻体)、藻类病毒，游离在水中的各种动植物病毒以及在极端水环境中的泉古菌病毒等类群。开发利用浮游病毒这类战略生物资源，筛选杀藻病毒(噬藻体)，是控制直至消灭有害藻华(赤潮)暴发的生物技术途径之一。环境中病毒的定量检测方法主要包括传统培养法和显微镜技术(如透射电子显微镜法、荧光显微镜法)，现有的这些方法大多耗时费力，因此急需检测结果稳定，可快速定量检测的淡水环境中总病毒的方法。流式细胞术(FCM)最先发展于二十世纪六十年代，并快速地应用于医学领域来进行哺乳动物细胞的分析。微生物学家七十年代后期才开始用这个工具。而如今随着荧光染料的不断改进，流式细胞术(FCM)正在迅速成为ー种在环境水生微生物领域的不可或缺的工具。它使得微生物分析既可以在群落水平开展也可以在单细胞水平开展。与其他技术相比，FCM实现了快速的数据采集和多參数分析，因此得到了广泛的应用。目前，尚无可详细參考的有关使用流式细胞仪定量检测淡水环境中总病毒方法的报导。

发明内容
本发明的目的解决现有方法大多耗时费カ的问题，建立ー种利用流式细胞仪快速定量測定淡水环境中总病毒含量的检测方法。本发明提供的基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法，步骤如下第I、水样过孔径为0. 22 iim的滤膜后加入戊ニ醛，使戊ニ醛的最终质量浓度为 0. 25%，并立即放入4°C冰箱；固定15min后用液氮冷冻并放置于_80°C的冷藏室中保存。第2、检测前将第I步保存的水样置于室温下解冻；加入Na2EDTA使最終浓度达到 5mmol/l，随后加入荧光染料SYBR Green I储备液。第3、将第2步处理后的水样于80°C避光染色lOmin，待冷却至室温后上流式细胞仪检测，水样测试前用Milli-Q水稀释至流式细胞仪检测浓度小于2X 105COunts/ml。其中第2步中的SYBR Green I储备液为用过孔径0. 22 y m滤膜的ニ甲基亚砜 (DMSO)稀释100倍SYBR Green I原液作为储备液，保存在_20°C下。染色前，将第I步保存的样品取出并在室温下解冻后，于每Iml中加入5iU SYBR Green I储备液。第3步中的流式细胞仪，光源功率为50mW，发射波长488nm的蓝色激光，使用流式细胞仪进行测定时，通过调节滤光片来收集发射光信号，信号收集软件为FlowMax。绿色荧光(FLl)被设定为触发參数，信号收集波长520 ±20nm，SSC为侧向散射光；所有信号均被收集在绿色荧光与侧向散射光的ニ维散点图上。本发明的优点和积极效果本发明方法避免了现有淡水总病毒測定中耗时费力的问题，在水样采集保存后， 利用本发明中的方法，仅在30min之内即可完成水样的染色，上机并给出检测结果，实现了淡水总病毒的快速定量測定。利用该方法不但可以得到水中总的病毒含量，还可以根据绿色荧光与侧向散射光的ニ维散点图来分析病毒的群落结构特征。本该方法操作步骤简単， 检测用时短，在淡水病毒检测及水生生态学研究等领域具有广阔的应用前景。


图I为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的淡水样品中总病毒检测结果，其中 Rl所包含的区域为某淡水样品中的病毒，最终检测浓度为3. 4X108counts/ml ；图2为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的Milli-Q水样中总病毒检测結果。图3为利用本发明方法检测河水稀释水样所得浓度与稀释程度的关系。
具体实施例方式下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I天津某淡水水样中病毒总量的检测第I、将采集到的淡水水样过0. 22 y m滤膜，加入适量戊ニ醛进行固定，使戊ニ醛的最终质量浓度为0. 25%，并立即放入4°C冰箱；待15min后用液氮冷冻并放置于_80°C的冰箱中保存。第2、取出上步冷冻后的样品于室温下解冻，取Iml于已灭菌的离心管中，加入 10 u I浓度为0. 5mol/l的Na2EDTA溶液(最终浓度达为5mmol/l)，随即加入5 的SYBR Green I储备液(用过孔径0. 22 y m滤膜的ニ甲基亚砜稀释100倍SYBR Green I原液作为储备液)。第3、震荡混匀后于80 0C避光染色lOmin，冷却至室温后，用Mi 11 i_Q水稀释至流式细胞仪检测浓度小于2X 105counts/ml。进样，上流式细胞仪进行检测。检测结果如图I所示，左侧部分为仪器背景，右侧Rl内为病毒。此淡水样品中所含总病毒浓度为3. 4 X 108counts/ml。实施例2空白水样中病毒总量的检测将Milli-Q水作为待测水样，按照实施例I中的方法步骤进行检测。由于Milli-Q 水不含有病毒、细菌等，检测结果如图2所示，仅可看到背景部分，无病毒群落出现。此样品可作为阴性对照样品。实施例3方法的检出限将某河水水样用Milli-Q水进行稀释，稀释后每个样品中的河水量分别占 0. 05%,0. 1%,0. 5%A. 0%、10%、25%、50%、80%、100%。将上述样品按照实施例I中的方法处理后，上流式细胞仪检测。检测结果表明(图3)，本发明中的方法可检出淡水中病毒的最低浓度为4. 04X 104counts/ml，方法的相关性很好，相关系数R2 > 0. 99 (n = 9)，方法的重复性很好，检测样品(n = 9)平均误差小于 10%。
权利要求
1.一种基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下第I、水样过孔径为O. 22μπι的滤膜后加入戊二醛，使戊二醛的最终质量浓度为O.25%，并立即放入4°C冰箱；固定15min后用液氮冷冻并放置于_80°C的冷藏室中保存；第2、检测前将第I步保存的水样置于室温下解冻；加入Na2EDTA使最终浓度达到 5mmol/l，随后加入荧光染料SYBR Green I储备液；第3、将第2步处理后的水样于80°C避光染色lOmin，待冷却至室温后上流式细胞仪检测，水样测试前用Milli-Q水稀释至流式细胞仪检测浓度小于2X 105COunts/ml。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于第2步中所述的SYBRGreen I储备液为 用过孔径O. 22 μ m滤膜的二甲基亚砜(DMSO)稀释100倍SYBR Green I原液作为储备液，保存在-20°C下；染色前，将第I步保存的样品取出并在室温下解冻后，于每Iml中加入5μ I SYBR Green I储备液，于80°C避光染色lOmin。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于第3步中所述的流式细胞仪，光源功率为 50mff,发射波长488nm的蓝色激光，使用流式细胞仪进行测定时，通过调节滤光片来收集发射光信号，信号收集软件为FlowMax;绿色荧光(FLl)被设定为触发参数，信号收集波长 520±20nm，SSC为侧向散射光；所有信号均被收集在绿色荧光与侧向散射光的二维散点图上。
全文摘要
一种基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法，属于生物技术和水环境监测领域。该方法包括过膜、固定、保存、染色、稀释、检测共六个主要步骤。具体操作过程如下将采集到的水样过0.22μm的滤膜后；加入戊二醛4℃固定15min后经液氮冷冻；保存于–80℃冰箱；检测前加入Na2EDTA以及荧光染料SYBRGreenI于80℃避光染色10min；待样品降至室温后用Milli-Q水稀释；上流式细胞仪进行检测。本发明方法避免了现有淡水总病毒测定方法耗时费力的问题，实现了淡水病毒的快速定量测定，在淡水病毒检测及水生生态学研究等领域具有广阔的应用前景。
文档编号G01N15/14GK102590068SQ20121006328
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月8日 优先权日2012年3月8日
发明者余辉, 王莹莹, 马丽丽, 马克·巴特兰姆 申请人:南开大学