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专利名称：表面增强拉曼散射活性测定基板的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有高重复性的表面增强拉曼散射(以下，称之为SERQ活性的测定基板以及使用该测定基板的表面增强拉曼光测定方法。
背景技术：
近年来，在以生命科学为中心的生物领域里，测量细胞上的单一分子(例如蛋白质)，从而解释疾病的机理或者生命现象的需求变高。为了满足上述需求，需要一种在活的状态下，未标识即可观察细胞的超高灵敏度分析技术。现在，作为生物领域中的检测方法，表面增强拉曼分光法(Surface Enhanced Raman Spectroscopy)作为组合了“通过拉曼效果的分光法”和“金属表面上的光增强效果” 的用于鉴别物质的超高灵敏度分析方法受到人们的关注。拉曼效果是指，当光射入物质时， 在散射的光中含有与入射光的波长不同波长的光的现象(非弹性散射)。此时的散射光称之为拉曼散射光。通过拉曼效果散射的光和入射光的能量差，对应于物质内的分子或者结晶的振动能级或者转动能级，或者电子能级的能量，因而分子或者结晶具有与其结构相应的特有的振动能量，因此，拉曼分光法，作为入射光使用单色光激光，利用调制成反映其分子固有能量状态的光的现象，从光谱中鉴别化学种类，从其散射光强度进行目的物质的定量。然而，拉曼分光法的灵敏度本质上很低，不适于微量试样的分析。另一方面，金属纳米粒子，金属表面上的自由电子集中振动的现象即等离子体激元存在于金属表面，该表面等离子体激元与可视 近红外区域的光电场耦合，在金属纳米粒子表面使电场显著增强。利用该表面等离子体激元共鸣(Surface)，对吸附在金属纳米粒子表面的分子照射激光，可使吸附分子所产生的拉曼散射光活跃的增强，因此，表面增强拉曼分光法受到关注。作为其中的一种方法，使物质吸附在金、银等贵金属电极或者胶体 (Colloid)表面，利用振动光谱比单独一分子增强的现象，进行SERS测量(专利文献1)。该SERS测量，对于微量物质的结构解析非常有用，现在，该方法需要将数十 数百nm左右大小的银或者金等贵金属微粒子积累在玻璃基板上，而以往，需要在溶液中合成银或者金的胶体，并在用赖氨酸或者氰基修饰的基板上进行固定(非专利文献1、2、3，专利文献幻。尤其，在专利文献2中，采用了将用于防止聚集的胶体进行凝胶化，并且进行涂覆干燥，制作基板的drop&dry法，而且其成为主流。专利文献1日本专利公开公报特开平7-146295号专利文献2日本专利公开公报特开平11-61209号非专利文献1S. Nie and S. R. Emory, Science. 275,1102(1997)非专利文献2K. C. Grabar，P. C. Smith, Μ. D. Musick, J. A. Davis, D.G.Walter， Μ. A. Jackson, Α. P. Guthrie and Μ. J. Natan, J. Am. Chem, Soc. , 118,1148(1996)与巨专禾Ij文■ 3R· Μ. Bright, Μ. D. Musick and Μ. H. Natan, Langmuir, 14, 5695(1998)然而，drop&dry法，测定时需要时间，而且为了迅速且准确地检测出被检体，必须在滴了被检体之后立即在非干燥状态(drop insitu)下进行检测，还不足以利用于疾病的诊断等、气相中的极微量化学种类的分析上。这是因为，例如，银纳米粒子在溶液中具有较强的活性，而使其干燥后其纳米粒子大小发生变化，活性会下降，而且，金纳米粒子在大气中也稳定，而与银相比其SERS活性原本低，且纳米粒子分散液能够在玻璃基板上固定的密度极小。

发明内容
本发明的发明人发现，通过表面等离子体激元共鸣所产生的电场增强效果显著发生的位置(热站)，主要在于相邻金属纳米粒子或者团簇之间或棱边形状的前端等。本发明鉴于上述问题而作，其目的在于提供一种能够控制作为上述热站的金属纳米粒子的聚集状态，并且在滴了试样之后立即可以进行检测的测定基板以及利用该测定基板的测定方法。本发明的的发明人发现，银纳米粒子或者团簇分散液在铜或者铜合金基板上立即开始聚集并且固定，从而成为能够立即测定表面增强拉曼散射光的状态。本发明的表面增强拉曼散射光测定用基板，使具有SERS活性的金属之粒径为IOOnm以下的纳米粒子(包括团簇)100 500ppm包含在内的分散液在具有比该金属的电极电位低(高电离倾向)的电极电位的金属基板上聚集，使其以规定的聚集状态停止聚集而成，其聚集区域形成为用于测定表面增强拉曼散射(SERS)的热站。采用本发明，在金属纳米粒子或者团簇分散液的聚集过程中，金属纳米粒子或者团簇在金属基板上的固定附着强度牢固，即使在聚集过程中予以擦拭，该聚集膜也不易剥离，可以在此时几乎停止聚集。因此，可以在金属纳米粒子分散液中分散被检试样，将其滴于金属基板上并且对其照射激光，而且，只将金属纳米粒子分散液滴于金属基板上，经过适当聚集过程之后予以擦拭并进行干燥，从而可以准备测定基板，并对其滴被检溶液，就可以测定最理想的拉曼散射光，而上述测定基板上形成有聚集区域，该聚集区域成为有效检测拉曼散射光的金属纳米粒子热站。测定基板，较为理想的是，单位面积上具有数个金属纳米粒子或者团簇两个以上连锁，粒子间距调整为至少IOnm以下的热站。在此，金属纳米粒子是指粒径为IOOnm以下的金属粒子，其可以通过物理方式进行粉碎制备而成，但是，将金属粒子还原或者络合化直接使其聚集也能够制备金属纳米粒子。下面，金属纳米粒子是指粒径为IOOnm以下的金属粒子或者团簇，不仅包括将金属离子还原使其聚集制备而成的，还包括通过分散剂使金属离子聚集的团簇。作为金属纳米粒子的制备方法，已知有将金属离子还原，经过金属原子， 金属团簇制备纳米粒子的化学方法(鸟越幹二郎等著、触媒、41521 (1999))、以及其他物理方法(日本专利公开公报特开3-34211号、日本专利公开公报特开5-98195号)。尤其，难以用物理方法制备数十纳米以下的纳米粒子。因此，较为理想的是，将金属电极进行电解以形成离子，并将其进行聚集而制备团簇。尤其，“纳米团簇”是数个至数百个原子/分子聚集而成的集合体，其大小在数纳米到数十纳米之间。上述金属纳米粒子或者团簇选自具有SERS活性的金属一金、银及其合金所构成的群组中，为了形成热点(hot spot)，粒子或者团簇的粒径，较为理想的是，50 5nm、20 5nm。在银纳米粒子的二联球，有时会出现随着粒径的增大高峰(peak)位置变高的现象，而考虑到单位面积的热站数形成为离子间或者棱边形状的前端，粒径越小越有利。而且，纳米粒子或者团簇的形状通常为球形，然而还可以使其变形，以使单位面积的热站数对应于粒子尺寸增大。在金属离子分散液中，添加提供配位子的配位化合物，而配位子与金属离子形成金属络合物，就容易调整团簇聚集尺寸。通过配位化合物种类和其浓度的调整，能够形成适当尺寸的金属团簇以形成分散液。另外，作为配位化合物使用银离子时，已知的配位化合物有氨、脂肪族胺、氨基酸等具有氨基的配位化合物。其中，最佳的配位化合物为具有氨基和羧基的氨基酸系表面活性剂包含在内的两性表面活性剂，尤其是，氨基酸系表面活性剂的 L-丙氯酸，只需添加0. 001 0. 002重量％，银离子溶液就可以聚集形成5 20nm的纳米团簇。另一方面，上述金属基板取决于金属纳米粒子的种类，选自金、银、铜及其合金以使其电极电位低于金属纳米离子的电位。基板整体无需均为金属，只要具有至少在分散液中显示电位的金属表面即可。因此，例如，如图7(a)所示，可以在玻璃或者塑料板(1)上进行圆形冲压成型，贴上0. Imm左右的盘状薄金属板制作而成。该基板，其金属部分( 形成为盘状，因而滴了上述分散液，其会成为液滴(3)而鼓起(参照图7(b))。之后，利用氮气吹风吹散液滴，金属纳米粒子的聚集区域(4)形成在金属表面从而制作测定基板。通过使用金合金、银合金、铜合金等合金化技术并且调整其组成比，可以调制金属基板的电位。而且， 还可以使其带适当的电压。另外，重要的是，聚集速度影响检测时机，聚集程度影响粒子间距离。因为，用粒径为40nm的金粒子的二联球进行实践的结果，表面等离子体激元之间的共鸣现象发生在粒子间距IOnm以下，随着间距减小到Inm共鸣现象会增大。而且，在银纳米粒子的聚集中，随着时间其检测灵敏度增加然后减少，是因为在聚集开始到完全聚集完毕为止的过渡期出现表面等离子体激元之间的共鸣现象所引起的最佳聚集间隔，出现检测高峰。另外，本发明中使用的基板，较为理想的是，金属表面被氧化，因为可以调整金属纳米粒子的聚集速度。对此，在具有金属表面的基板上滴含有试样的金属纳米粒子分散液时，有时金属表面上形成氧化物为好。如上所述，金属基板，根据与聚集对象的金属纳米粒子或者团簇之间的关系考虑电极电位来进行选择，当聚集银纳米粒子或者团簇时，较为理想的是，选择铜板、黄铜板或者磷青铜板等铜合金板。如果使该银纳米团簇分散液聚集在金属基板上，在金属基板上具有SERS活性的团簇会与配位子一同形成结晶(图5)，成为适于制作热站的聚集区域。上述金属纳米粒子或者团簇的含量为5000 lOOppm，较为理想的是，300 500ppm。其浓度高时，由于粒子间密度高因而形成热站的速度变快(当分散液中含有 0. 001 0. 002重量％的L-丙氯酸时，适当的聚集时间为IOOOppm时6分钟左右、2000ppm 时3分钟左右、3000ppm时1分钟左右)，所以要提早停止聚集，而浓度低时，由于形成热站的速度变慢因而推迟聚集的停止。因此，通常，开始聚集后设定适当的时间，然而，成为热站的聚集状态受分散液中的金属纳米粒子或者团簇的含量、分散剂、与金属基板之间的电极电位差等的影响，因而重要的是，预先决定最佳条件。本发明，提供一种使用上述测定基板测定各种拉曼散射光的表面增强拉曼散射光测定方法，其包括使具有表面增强拉曼活性功能的金属之粒径为IOOnm以下的纳米粒子 (包括团簇)包含在内的分散液在比具有表面增强拉曼活性功能的金属的电极电位低(高电离倾向)的电极电位的金属基板之金属表面上开始聚集，并在适当的时候使聚集停止从而提供最佳聚集区域的工程；使被检试样附着在该金属聚集区域的工程；在被检试样的非干燥状态下，用规定的激光照射金属纳米粒子表面所吸附的被检试样，测定从被检试样产生的拉曼散射光的工程。各种疾病标志物或者各种病毒为蛋白质分子，使蛋白质分子吸附在最佳的热站， 成为能够利用表面等离子体激元共鸣(Surface)的条件。本发明的发明人发现，如果使用氨基酸系表面活性剂制备银纳米粒子或者团簇的分散液，通过氨基酸银纳米粒子会聚集在金属基板上，其结果，如果将氨基酸用等电点以上或者以下的PH溶液进行处理，则可以使基板上的氨基酸带电荷以使其容易吸附蛋白质分子。因此，本发明提供一种表面增强拉曼散射光测定方法，其特征在于在包含粒径为5 IOOnm的金或者银纳米粒子或者团簇 100 5000ppm的分散液中，分散至少具有氨基和羧基的两性电解质，并将含有该两性电解质的分散液滴于金属基板上，使其通过金属基板和纳米金属之间的电极电位差开始聚集， 在最佳聚集状态下使其停止聚集之后，将两性电解质用其等电点以上或者以下的PH溶液进行处理使之带正或者负电，从而使其吸附被检蛋白质试样，并对金或者银纳米粒子照射激光，测定所吸附被检蛋白质试样所产生的拉曼散射光。在本发明中，上述电解质为氨基酸系表面活性剂或者蛋白系表面活性剂，较为理想的是，相对于氨基酸系电解质、氨基乙酸(glycine)、L-丙氯酸、赖氨酸等羧基具有一个以上氨基的氨基酸系电解质。因为，氨基有利于银纳米粒子的吸附。而且，氨基，用等电点以上的PH溶液进行处理会带正电，用等电点以下的PH溶液进行处理会带负电，因此，容易有选择性地电荷吸附带正电或者负电的蛋白质分子。尤其，利用抗原抗体反应时，本发明所使用的金属纳米粒子分散液，较为理想的是，作为表面活性剂含有氨基酸系两性表面活性剂的蛋白系表面活性剂。该表面活性剂，存在于聚集的金属纳米粒子之间，具有将抗体成分或者抗原成分诱导于金属纳米粒子之间的作用。较为理想的是，选自抗体成分单独添加或者并用氨基酸电解质和抗体成分以进行添加。采用本发明，利用分散液中的两性电解质在金属基板上形成最佳聚集形态，并且利用两性电解质的性质可以选择吸附蛋白质所需电荷，因此，能够准确地进行蛋白质的吸附。而且，在本发明中，利用聚集时间控制金属纳米粒子或者团簇间隔的调整，因而可以使蛋白质吸附于最佳的热点。因此，可重复地进行各种蛋白质分子的SERS检测，能够检测出各种疾病标志物、各种病毒。在本发明中，上述金属纳米粒子分散液可以使用通常的各种分散剂，然而，选择分散液时需要考虑不给被检试样带来干扰。分散剂浓度等聚集防止效果，应考虑胶体金属、金属基板的电极电位的关系，设定最佳检测时机。因此，本发明提供一中用于上述测定方法的具有表面增强拉曼活性功能的金属纳米粒子分散液，其特征在于在具有表面增强拉曼活性功能的金属离子的分散液中，添加对金属离子提供配位子的配位化合物，从而形成金属络合物团簇。上述配位化合物，较为理想的是，当检测蛋白质时，是含有氨基和羧基的两性表面活性剂，当利用抗原抗体反应时，是将抗原抗体反应的抗体成分单独或者与所述两性表面活性剂一起添加的分散液。如果上述两性表面活性剂是含有氨基酸系表面活性剂的蛋白系表面活性剂，则具有将抗体成分或者抗原成分诱导于金属纳米粒子或者团簇之间的功能。


图1是在聚集时间为6分钟的基板上，没有4，4-联吡啶的基板的背景光谱图。图2是在聚集时间为7分钟的基板上，4，4-联吡啶1 μ M的SERS光谱图。图3是在聚集时间为6分钟的基板上，4，4-联吡啶InM的SERS光谱图。图4是在聚集时间为7分钟的基板上，4，4-联吡啶InM的SERS光谱图。图5是使含有电解质的银纳米粒子分散液聚集在磷青铜基板上的状态的两万倍 SEM照片。图6是在实施例2中所测定的CRP的SERS光谱。图7是表示本发明所涉及的测定基板制造工艺的工程图。
具体实施例方式下面，参照附图，就本发明的实施方式进行详细说明。实施例1在本实施方式中，使平均粒径为7 IOnm的银纳米团簇，在主要由L-丙氯酸组成的氨基酸系分散液包含在内的水溶液中分散，制备出2000ppm、IOOOppm以及IOOppm的银纳米团簇分散液(无色透明)，而上述银纳米团簇，通过化学方法将银离子聚集的方法制备而成。在表面干净的银基板、铜板以及黄铜基板上，隔着间隔一滴一滴(10 μ L)滴IOOOppm 的银纳米团簇，并对其聚集过程进行观察。在银基板上，聚集几乎需要一整夜，而在铜基板上数分钟，在黄铜基板上则数十秒到数分钟，即可形成黑色堆积物。在此，滴了分散液之后第6分钟和第7分钟进行氮气吹风使水滴飞溅干燥，从而使聚集停止。将4，4-联吡啶 (bipyridine)用纯水稀释成1 μ M、IOOnM之后，将其滴于如此制备的6分钟聚集和7分钟聚集的黄铜基板上的堆积物上，并用日本株式会社LAMBDA VISION公司的测量仪，以最大输出的波长为825nm的激光作为激发光，测定SERS光谱。其结果如图1至图4所示。图1是对6分钟聚集的基板上滴了纯水时的光谱。图2表示对7分钟聚集的基板上滴了 4，4-联吡啶1 μ M时的SERS光谱图。图3以及图4表示对6分钟聚集和7分钟聚集的基板上滴了 4,4-联吡啶InM时的SERS光谱图。对图1和图2 图4的光谱进行比较可以知道，能够测定1 μ Μ、100ηΜ浓度的试样。 而且，对图3和图4进行比较可以知道，6分钟聚集优于7分钟聚集，并且存在最佳聚集时间。采用上述测定基板，只要完成激光的对焦，通过对基板上的聚集区域滴规定试样， 能够瞬时检测出4，4-联吡啶的IOOnMSERS光谱。实施例2使实施例1中使用的平均粒径为7 IOnm的银纳米粒子或者银纳米团簇，在包含氨基酸系表面活性剂(L-丙氯酸0. 001 0. 002% )的水溶液中分散，制备出2000ppm、 IOOOppm以及IOOppm的银纳米分散液(无色透明)。在表面干净的银基板、铜板以及黄铜基板上，隔着间隔一滴一滴(IOyL)滴IOOOppm的银纳米分散液，并对其聚集过程进行观察。 在铜基板上，聚集几乎需要一整夜，而在黄铜基板上数分钟，磷青铜基板上则数分钟到十数分钟，即可形成黑色堆积物。在此，滴了分散液之后进行氮气吹风使水滴飞溅干燥，从而使聚集停止。将CRP (通常浓度的1000倍)用纯水稀释成10倍、100倍之后，将其滴于如此制备的6分钟聚集的磷青铜板(如图5所示SEM相片)上的堆积区域，并用日本株式会社 LAMBDA VISION公司的测量仪，以最大输出的波长为825nm的激光作为激发光，测定SERS光谱。其结果如图6所示。 采用本发明，能够提供一种滴了被检试样后可以立即测量SERS光的测定基板。而且，利用上述测定基板，可以调整作为热站的最佳聚集区域的带电状态，因而蛋白质容易吸附在检测蛋白质所必须的纳米粒子上。而且，利用抗原抗体反应，可以检测出肿瘤标志物以及病毒，从而可以诊断病情。
权利要求
1.一种表面增强拉曼散射光测定用基板，其特征在于使具有粒径为IOOnm以下、浓度为100 5000ppm、具有SERS活性的金属的纳米粒子 (包括团簇)的分散液在具有比该金属的电极电位低(电离倾向高)的电极电位的金属基板上聚集，使其以规定的聚集状态停止聚集而成，其聚集区域形成为用于测定表面增强拉曼散射(SERS)的热站。
2.根据权利要求1所述的表面增强拉曼散射光测定用基板，其特征在于所述分散液中的具有SERS活性的金属为银，在分散液中含有提供配位子的配位化合物，所述配位子能够与银离子形成金属络合物。
3.根据权利要求2所述的表面增强拉曼散射光测定用基板，其特征在于所述配位化合物，具有与银形成氨络物的氨基。
4.根据权利要求3所述的表面增强拉曼散射光测定用基板，其特征在于所述配位化合物为具有氨基和羧基的两性表面活性剂。
5.根据权利要求2所述的表面增强拉曼散射光测定用基板，其特征在于金属基板为铜板或者铜合金。
6.一种表面增强拉曼散射光测定方法，其特征在于，包括使具有粒径为IOOnm以下且具有表面增强拉曼活性功能的金属的纳米粒子(包括团簇)的分散液在比具有表面增强喇曼活性功能的金属的电极电位低(高电离倾向)的电极电位的金属表面基板上开始聚集，并在适当的时候使聚集停止从而提供最佳聚集区域的聚集过程；使被检试样附着在该金属聚集区域的附着过程；在被检试样的非干燥状态下，用规定的激光照射金属纳米粒子表面所吸附的被检试样，测定从被检试样产生的拉曼散射光的检测过程。
7.一种表面增强拉曼散射光测定方法，其特征在于在包含粒径为5 IOOnm的金或者银纳米粒子或者团簇100 5000ppm的分散液中，分散至少具有氨基和羧基的两性电解质，并将含有该两性电解质的分散液滴于金属基板上， 使其通过金属基板和金属纳米粒子之间的电极电位差开始聚集，在最佳聚集状态下使其停止聚集，之后，将两性电解质用其等电点以上或者以下的PH溶液进行处理使之带正或者负电，从而使其吸附被检蛋白质试样，并对金或者银纳米粒子照射激光，测定所吸附被检蛋白质试样所产生的拉曼散射光。
8.一种用于权利要求6或者7所述的测定方法的具有表面增强拉曼活性功能的金属纳米粒子分散液，其特征在于在具有表面增强拉曼活性功能的金属离子的分散液中，添加对金属离子提供配位子的配位化合物，从而形成金属络合物团簇。
9.根据权利要求8所述的蛋白质检测用分散液，其特征在于所述配位化合物为含有氨基和羧基的两性表面活性剂。
10.根据权利要求8所述的抗原抗体反应用分散液，其特征在于将抗原抗体反应的抗体成分单独或者与所述两性表面活性剂一起添加。
11.根据权利要求10所述的分散液，其特征在于所述两性表面活性剂为包含氨基酸系表面活性剂的蛋白系表面活性剂，具有将抗体成分或者抗原成分诱导于金属纳米粒子或者团簇之间的功能。
全文摘要
金属基板，使具有SERS活性的粒径为5～100nm的金属纳米粒子(包括团簇)在具有比其电极电位低(高电离倾向)的电极电位的金属基板上聚集，使其以最佳聚集状态进行固定而成，在该基板上，形成有具有SERS活性的金属纳米粒子的最佳聚集区域，因而可以吸附被检试样，并对其照射规定的激光，则在最佳聚集状态，通过表面等离子体激元共鸣检测出被检抗原试样的表面增强拉曼散射(SERS)光。采用本发明，可以提供一种具有高SERS活性的测定基板以及使用该测定基板的测定方法。
文档编号G01N21/65GK102428359SQ20108001930
公开日2012年4月25日 申请日期2010年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者长谷川克之, 长谷川裕起 申请人:长谷川裕起