专利名称：分析物检测方法和分析物检测集成电路的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测感兴趣的分析物的方法，包括提供多个可单独寻址的感测电极，所述感测电极包括第一感测电极，在其表面处包括第一受体，所述第一受体用于选择性地粘合到感兴趣的第一分析物；以及第二感测电极，在其表面处包括第二受体，所述第二受体用于选择性地粘合至感兴趣的第二分析物。本发明还涉及一种包括多个单独可寻址感测电极的集成电路(IC)，所述感测电极包括第一感测电极，在其表面处包括第一受体，所述第一受体用于选择性地粘合到感兴趣的第一分析物；以及第二感测电极，在其表面处包括第二受体，所述第二受体用于选择性地粘合至感兴趣的第二分析物。
本发明还涉及一种实现这种IC功能的方法。
背景技术：
生物传感器可以是指可用于分析物检测的设备，这种设备将生物部件与物理化学或者物理检测器部件相组合。例如，生物传感器可以基于这样的现象在生物传感器表面上固定不动的捕获分子可以选择性地与流体样品中的目标分子杂交，例如当作为捕获分子的抗体的抗体结合片段(antibody-binding fragment)或者DNA单链的序列适合目标分子的相应序列或结构时。当这种杂交或者传感器事件在传感器表面发生时，这可以改变表面以及表面正上方空间中的电学性质，这可以被检测为传感器事件。许多合适的特定结合对(binding pair)候选物本身是已知的,其典型地是基于受体分子和分子(例如药品)之间的锁钥(lock-and-key)类型的相互作用。这使得诸如基于分析(assay)的设备之类的感测设备特别适用于确定诸如DNA、RNA、荷尔蒙、代谢物、药品等等之类的特定蛋白质和其他生物化合物的存在与否，或者适用于确定诸如蛋白质、肽、感染性蛋白质、酶、核酸适体(aptamer)、核酶(ribozyme)和脱氧核酶(deoxyribozyme)之类的活跃和催化生物分子的活性和功能。例如，免疫分析已经用于确定体液中特定蛋白质的具体量，以辅助进一步的诊断和治疗。由于半导体技术的进步，检测这些传感器的感测表面上的单独捕获事件已经变得切实可行。在PCT专利申请W02009/047703中公开了这种传感器的示例，其中捕获分子形成电容器的绝缘层，电容器的极板或感测电极分别由导电感测表面和流体样品形成。捕获事件引起包括传感器表面正上方的空间(在其中发生捕获事件)在内的绝缘层的介电常数的变化，这影响了电容器的电容。电容变化可以测量作为例如通过晶体管的电流上的偏置，如在该申请中的情况那样。在PCT专利申请W02008/132656中公开了一种可选结构，其中公开了一种扩展栅场效应晶体管，在作为感测电极的扩展栅的表面上具有捕获分子，使得可以通过捕获事件更改晶体管的栅电势。已经获得广泛注意的另一类生物传感器是分析型生物传感器，其中将抗体结合到磁珠上，磁珠通过磁力被吸引到携带另外抗体的感测表面，通过与所述抗体和所述另外抗体形成结合对，感兴趣的分析物将磁珠结合到感测表面。例如，在PCT专利申请W02007/060601中给出了这种分析的示例，但是基于这种磁珠的生物传感器不太适用于单独结合事件方案中的检测。代替地，检测体磁(bulk magnetic)信号，其具有随着研究的样品中感兴趣分析物的浓度而缩放的幅度。例如，如W02008/132656和W02009/047703中所公开，可以将利用不同的受体分子来对生物传感器阵列的不同部分进行功能化，使得可以并行地检测不同的分析物。这当然是有吸引力的，因为这减小了不同分析物的总检测时间。然而，由于最先进CMOS生物传感器的小感测面积，IC上不同生物传感器的功能多样性并非易事。为了能够检测特定的结合事件，必须知晓哪个生物传感器元件(例如，电极或多个电极)包含哪种受体分子。因此，这要求受体分子在电极上的仔细放置，例如这可以通过定点(spotting)技术实现，其中将包含特定受体的溶液的液滴或液点放置到生物传感器表面的选定部分上。然而，现代制造技术促进了 IC的提供，所述IC包括生物传感器阵列，例如具有实 质上小于这些液滴尺寸的间距的电极阵列，使得标准的定点技术不适用于提供具有分离受体的单独电极。例如，常规地可以提供几百平方微米的面积，而通过普通定点技术提供的单点直径典型地在100-300微米的范围，即大了数个量级以至于不能对尺寸在IOOnm范围的单独电极进行定位。这种点尺寸与整个传感器阵列在相同的数量级，从而不能够将不同的液点沉积到一个生物传感器上。例如，可以通过使用原子力显微镜(AFM)等尖端定点技术来提供较小的液点，例如BioForce或者Nanadrop的商用系统,但是这些技术的成本不容许大规模工业应用。此外，这种传感器功能化典型地在生物实验室中进行，在这些实验室中这些先进的定点技术可能并不可用。除了以上功能化问题之外，与这种生物传感器阵列相关联的另一问题是单分子检测信号通常相当弱，使得可能要求较长的获得时间来实现可接受的信噪比。
发明内容
本发明旨在提供一种方法，使用包括多个感测电极的IC促进了对不同的感兴趣分析物进行同时检测，所述方法克服了至少一些上述问题。本发明还旨在提供一种包括多个感测电极的1C，能够改进对不同的感兴趣不同分析物进行同时检测。根据本发明的一个方面，提出了一种对集成电路进行功能化的方法，所述集成电路包括承载多个感测电极的暴露表面，所述方法包括提供一种包括多个生物分子受体分子的溶液，所述多个生物分子受体分子用于选择性地结合到不同的感兴趣分析物；以及将所述表面暴露到所述溶液，从而形成所述受体分子在相应感测电极上的随机分布。本发明是基于这样的认识与新型检测技术(参见下文)相结合，不再需要预先知晓具体类型的受体分子在电极阵列上的位置。因此，可以避免使用定点技术，从而显著地减小了对单独的生物传感器元件(例如，单独的感测电极)进行功能化的复杂性。根据本发明的另一方面，提出了一种检测感兴趣分析物的方法，包括提供根据本发明的功能化方法的功能化集成电路，使得第一感测电极在其表面处包括第一受体分子，所述第一受体分子用于选择性地结合到感兴趣的第一分析物，以及第二感测电极在其表面处包括第二受体分子，所述第二受体分子用于选择性地结合到感兴趣的第二分析物；将所述功能化集成电路暴露到潜在地包括第一分析物和第二分析物中至少一种的样品；提供具有第一电学签名的第一珠子，所述第一珠子附着于第一分子，所述第一分子具有用于依赖于所述样品中第一分析物的存在而结合到第一感测电极的构造(confirmation)或者亲和力(affinity);提供具有第二电学签名的第二珠子，所述第二珠子附着于第二分子，所述第二分子具有用于依赖于所述样品中第二分析物的存在而结合到第二感测电极的构造或者亲和力；以及分别确定第一电极和第二电极上第一珠子和/或第二珠子的电学签名的存在。本发明的检测方法是基于这样的认识通过使用具有电学签名(electricalsignature)的珠子,其中电学签名被设计为具有针对特定类型感兴趣分析物的特性,从而可以通过在感测电极阵列(多个感测电极)上该签名在某个地方的出现(或者消失)来在样品中检测这种感兴趣分析物。这同时也将揭示在本发明的功能化方法的随机分布步骤中，阵列中的哪些电极已经用与该感兴趣分析物形成结合对的受体分子来进行功能化。
可以按照任意合适的方式实现不同的电学签名。优选地，第一珠子和第二珠子具有不同的尺寸和/或由不同的材料制成，以实现这些不同的电学签名，例如不同的电容签名。第一分子和第二分子可以包括在所述样品中。例如，第一分子具有用于结合到第一受体分子的亲和力，而第二分子具有用于结合到第二受体分子的亲和力。例如，第一和第二分子可以是抗体等，其选择性地结合到感兴趣的分析物，例如作为三明治分析(sandwichassay)的一部分。在可选实施例中，结合事件可以基于置换分析(replacement assay),在这种情况下所述方法还包括步骤在将所述阵列暴露到所述样品之前，在第一受体分子和第一分子之间以及在第二受体分子和第二分子之间形成相应的结合对；以及在将所述阵列暴露到所述样品之后，在所述结合对中用第一分析物代替第一分子和/或用第二分析物代替第二分子。在该实施例中，通过来自感测电极的电学签名的消失来检测到结合事件，因为在电极表面处附着有珠子的第一分子被感兴趣的分析物所代替。在再一个实施例中，第一分子是第一受体分子，而第二分子是第二受体分子，并且其中在不存在感兴趣的第一分析物的情况下第一受体分子采用发夹构造(hairpinconfirmation),而在不存在感兴趣的第二分析物的情况下第二受体分子采用发夹构造。例如，这是在DNA识别领域中的合适实施例，其中互补碱基对序列典型地采用发夹或者折叠构造，其在与互补DNA序列形成结合对时断开。这将受体分子末端处的珠子从感测电极的表面移开，可以通过电容变化检测到这种移动。变化量将至少部分地依赖于珠子的电学签名。在另一实施例中，第一珠子和第二珠子是磁珠。例如，这可以如下使用分别电学地检测第一感测电极和第二感测电极上第一珠子和/或第二珠子的存在可以包括至少向第一感测电极和第二感测电极提供具有时变频率的振荡电磁�。灰约凹觳馄德室览档缛菪藕牛闷德室览档缛菪藕胖甘久恳凰龈胁獾缂暇咛宄叽缰樽拥拇嬖�。因此，由珠子的不同尺寸、不同材料和/或不同重量引起的珠子的不同电学签名将使每一珠子在施加的电磁场中谐振，直到其达到对于珠子的具体电学签名而言特定的临界频率为止。大于该频率，珠子将不再能够跟随交变的电磁�。饪梢约觳馕胁獾缂戏降缃橹实氖北涞缛莸谋浠醇觳獾降男藕挪辉僖运┘拥牡绱懦∑德世吹髦�。因此，针对每一电极的临界谐振频率的检测将确定哪一个珠子(以及因此哪一种感兴趣分析物)已经结合到该感测电极上(先前未知的)受体分子。根据本发明的另一个方面，提出了一种集成电路，所述集成电路包括多个可单独寻址的感测电极和与各感测电极单独耦合的信号处理器，所述信号处理器适用于基于在所述感测电极之一上感兴趣分析物(40，40’ )的特定结合事件中所涉及的珠子(60，60’ )的电学签名，来识别所述特定结合事件。这种IC促进了不同感测电极上不同的感兴趣分析物的并行检测，而不需要预先知晓在哪个电极上已经放置即固定了哪种受体分子。在实施例中，所述集成电路是功能化的1C，其中相应的电极包括不同受体分子的随机分布。所述集成电路还可以包括场发生器，用于向多个感测电极施加具有时变频率的振荡电磁�。渲兴鲂藕糯砥魇视糜谕ü行巳し治鑫锏慕岷戏从χ兴婕暗闹樽釉谒稣竦吹绱懦≈械男痴裉匦裕词侗鹚龈行巳し治鑫�。
将参照附图，通过非限制性示例，更加详细地描述本发明的实施例，在附图中图I示意性地示出了现有技术的传感器设备；图2示意性地示出了现有技术传感器设备的电学置换模型；图3示意性地示出了具有已经使用定点技术功能化的感测阵列的IC ；图4示意性地示出了感测电极模型；图5示意性地示出了这种感测电极的电信号对于该电极上方珠子距离的依赖性；图6示意性地示出了本发明的检测方法的实施例；图7示意性地示出了利用图6的检测原理获得的感测信号；图8示意性地示出了本发明的另一种检测方法的实施例；图9示意性地示出了本发明的再一种检测方法的实施例；图10示意性地示出了具有已经根据本发明的方面进行功能化的感测阵列的IC ；图11示意性地示出了根据本发明的IC的实施例；图12示意性地示出了根据本发明的另一 IC的实施例；图13示意性地示出了图12的IC的工作模型；图14示意性地示出了在图13的工作模型中可以获得的多个电信号；图15是根据本发明的示例生物传感器的显微图像；图16-20示出了利用图15的生物传感器获得的电极的各种信号迹线；图21示意性地示出了用于本发明IC的感测电极的示例控制信号；图22示意性地示出了图21的示例控制信号的调制频率；以及图23示意性0地示出了本发明的珠子检测原理的实施例。
具体实施例方式应该理解，附图只是示意性的并且没有按比例绘制。还应该理解，贯穿附图使用相同的参考数字表示相同或类似的部分。图I示出了 W02009/047703的传感器设备10的实施例。传感器设备10包括串联耦合在第一电压源V1和第二电压源V2 (例如分别是电源电压和地)之间的第一晶体管12和第二晶体管14。通过来自控制电路15 (例如，时钟信号发生器)的相应控制信号CLKl和CLK2控制第一晶体管12和第二晶体管14。第一晶体管12和第二晶体管14之间的源/漏连接中的节点连接至承载多个捕获分子30的电极16，捕获分子30用于捕获来自样品20的感兴趣分析物40。电极16和样品20形成电容器C的电容器极板，极板通过由一个或多个捕获分子30形成的电介质层18分离。在操作中，通过第一晶体管12将电极16与电压源V1相连来对电容器C充电。随 后捕获事件的发生，即捕获分子30和感兴趣分析物40的分子之间结合对的形成，导致电介质层18的介电常数的变化，从而影响电容器C的电容。因此，在通过将第一晶体管切换到非导通状态同时将第二晶体管14切换到导通状态来读出电容器C时，可以根据从电极16流到第二电压源V2的电荷来得出电容变化。电介质层18的介电常数的变化典型地受到表面电势变化和体积对于介电常数的贡献的影响，这将结合图2更加详细地予以解释。更具体而言，传感器10的信号(S)是三个阻抗的函数，如图2所示。每一个阻抗对于接近的分析物颗粒敏感，即如等式(I)所示S = S (Cn, Re, Ce)(I)电极电容Cn、电解液电阻Re和电解液电容Ce都由传感器电极的几何尺寸确定。在不存在分析物颗粒的情况下，可以将这些阻抗表示为如等式(2)-(4)所示C=C11Ti^(2)
R _ 16 1I ~
371 d(3)
_7] Ce = -S11S,(4)这里,d是电极的直径,C0是电介质层18 (例卯，硫醇化(thiolated) SAM或者硫醇化(thiolated)DNA杂交探针)的电容密度，oE是电解液的dc电阻率，e。是真空介电常数(8. 854xlO_12C/V-m)，以及e E是电解溶液的相对介电常数。典型的数值将是对于PT2，d =130nm ;对于硫醇化SAM, C0 = 0. 01F/m2 ;对于150mM的磷酸盐缓冲溶液,其中I升去离子水中包括 2g NaCl,0. 2g KCl，0. 2g Na2HPO4 和 0. 2g KH2PO4, o E = I. 57S 并且 e E = 75. 4 ;对于生理溶液中的纳米电极，得到典型的数值是(；=133& ，(^,(|=160& 并且1^(| = 2.60。注意可以将等式(2)-(4)的阻抗看作是与(生物)传感器10相关的基本阻抗。在电极表面(附近的)邻近区域中分析物颗粒或者生物分子的存在影响这些阻抗。图I的生物传感器元件是用于IC的合适传感器元件的非限制性示例，所述IC包括由多个单独可控的电容感测电极16形成的传感器阵列。这些感测电极的其他实施例(例如在W02008/132656中公开的感测元件)同样是切实可行的。应该理解，本发明的范围不是具体局限于特定类型的电容感测元件；适于集成到IC中并且能够检测单独的特定结合事件的任意感测元件可以用于本发明的场景中。如前所述，可以将在例如W02008/132656和W02009/047703中公开的感测电极的阵列进行功能化以同时检测多种感兴趣分析物，从而提供强大的芯片实验室解决方案。图3示出了这种功能化的现有技术方案，其中IClO的表面承载按照二维阵列或者网格组织的多个合适感测电极16。只是作为非限制示例，电极16具有方形形状；电极16可以具有任意合适的形状，例如圆形形状。在该阵列中可以识别出四个区域50，其表示利用特定类型的受体分子功能化的不同区域，每一个区域50中的感测电极16承载不同的受体，使得IC 10能够在四个不同的感测区域50中同时检测四种不同类型的感兴趣分析物。可以使用公知的定点技术实现功能化区域50的形成，其中将包含所需受体分子的溶液液滴沉积到指定的区域。液滴的直径典型地是几百微米，而现代IC制造工艺使得可以产生具有亚微米尺寸的感测电极16(为此原因，有时将这些电极称作纳米电极)，从而至 少在使用简单的定点技术时不能够避免大量感测电极16被相同的受体分子覆盖。因此，通过以下事实可以容易地识别已经使用这种定点技术功能化的IC 10 :已经同质地功能化了IC 10的感测阵列的区域50，即这种区域50内的所有感测电极承载相同的受体分子。应该注意，利用这些受体对电极表面功能化本身是已知的。本领域普通技术人员能够想到许多合适的处理(例如，在受体要结合到的感测电极16的表面上形成自组装单层)，从而为了简明起见不再进一步详细地解释本发明的这一方面。上述定点技术可能是有问题的。首先，由于需要仔细地将IC 10与定点设备(例如喷墨打印头)对齐，并且需要在定点工艺中应用若干清洗步骤，定点工艺是耗时的。例如，仔细的对齐必须确保对所需感测电极16进行功能化，以便准确检测出IC 10能够检测的一组分析物中一种具体感兴趣分析物的存在，需要预先知晓哪种受体分子30已经附着到感测电极16表面。此外，标准定点技术不能用于具有微米或者亚微米尺寸的IC 10。例如，申请人能够生产一种具有总尺寸仅为几百平方微米的感测阵列的1C，对于这种1C，感测功能的差异化变得不能利用这种标准定点技术来实现，因为单个液点或液滴将覆盖整个感测阵列。本发明的发明人已经基于以下认识解决了这一问题。本身已知的是提供颗粒或者珠子作为分析形成反应(assay forming reaction)中的标签,例如在W02007/060601中详细解释的那样。本发明的发明人已经认识到可以使用电容感测电极16来电容性地感测这种珠子。另外，本发明的发明人还认识到通过对于不同类型的特定结合对，即特定的感兴趣分析物40与其匹配受体分子30的(间接)直接结合，来选择不同类型的珠子，可以通过在形成具体的特定结合对中所涉及的珠子的特定电学签名来检测这种特定结合对的形成。通过提供多个具有不同电学签名的珠子、并且将不同的珠子与不同的结合对相关联，不再需要预先知晓受体分子30在具体感测电极16上的位置，因为可以将对于具体的特定结合事件而言唯一的电学签名的检测用于识别具体的感兴趣分析物的存在。换句话说，感兴趣的分析物不再通过检测感测电极16阵列中特定位置处的信号来检测，而是通过在该阵列内的任意位置处可能出现的唯一电容性信号来检测。为此，每一感测电极16必须能够检测单独的珠子及其电学签名。可以通过改变用于不同珠子的尺寸和/或材料来实现不同的电学签名。这可以根据以下等式(5)来理解
该模型表示由在位置&处将珠子插入到电解液中引起的电解液导纳改变A Ye，珠子具有半径a、dc电导率Ob和介电常数eB，电解液具有DC电导率Oe和介电常数eE。这里，《是(谐波)角频率，尾urfe)是在插入颗粒之前颗粒位置处电解液中的局部电�。约癡是在纳米电极的SAM-电解液界面处的平均电压(假设相对电极是0电压)。从等式
(5)可以看到，信号幅度倍增可以由三个参数引起体积(4Jia3)、电导率(Ob)以及介电常数(e B)。图4示出了具有典型的75nm电极半径r的圆形感测电极，图5示出了在圆形感测电极中心处的比率(E/V)2作为传感器上方的高度z的函数，Wz = O处进行归一化。从等式(5)可以看出，电容变化与颗粒或珠子的体积及其相对于介质的介电性质直接成比例。假定这样的事实当与生物分子相比较时，珠子典型地具有大得多的尺寸(大约大10-100倍)，并且可以选择或者调谐其材料性质，珠子或标签提供增加信号的优势，使得除了能够避免将定点技术用于IC 10的感测电极16的功能多样性之外，另外的优势是可以获得改进的信号强度，这不但有助于在不同的电学签名之间进行区分，而且也减小了感测试验的获取时间。图6示出了本发明的示例实施例,其基于三明治(或者ELISA)分析的原理。IC 10可以包括多个感测电极16、16’。作为非限制性示例并且只是为了清楚起见，示出了两个电极。电极16、16’承载不同的受体分子30、30’。受体分子30(例如抗体、互补DNA链等等)能够与感兴趣的分析物40形成特定的结合对，而与受体分子30不同的受体分子30’能够与另一种感兴趣的分析物40’形成特定的结合对。感兴趣的分析物40能够与另一分子45 (例如另一种受体)形成另一种特定的结合对，该另一分子45附着珠子60作为标签。感兴趣的分析物40’能够与另一分子45’ (例如另一种受体)形成另一种特定的结合对，该另一分子45’附着珠子60’作为标签。珠子60和60’具有不同的电学签名，即分别按照不同且可检测的方式影响包括感测电极16和16’在内的IClO的电容性感测元件的电容，使得可以通过这种电学签名来检测诸如感兴趣的分析物40和40’之类的感兴趣分析物的特定结合事件。在图7中示出了从感测电极16得出的传感器信号的简化表示，作为感兴趣分析物40结合到受体分子30和包括珠子60的另一分子45结合到感兴趣分析物40的函数。这说明了当包括珠子60的另一分子45结合到感兴趣分析物40时，获得了信号强度的大大增力口，从而如前所述通过电容器极板之间的电介质性质的显著变化显著地影响了包括感测电极16在内的电容性传感器的电容。在图6中，已经通过对于珠子60和60 ’选择不同的半径实现了不同的电学签名。应该理解的是，可以按照任意合适的方式实现不同珠子之间电学签名的差异，例如通过使用具有不同介电常数的材料、单独珠子中不同材料的组合(例如，由具有包层或者壳的核形成的珠子，其中可以单独地改变核和包层或壳材料)、不同尺寸珠子和不同珠子材料的组合等等。在实施例中，珠子60和60’是包括细铁粒的聚苯乙烯珠子。这种珠子是从Ademtech公司购得。可选地，珠子60和60’可以是例如金珠、银珠等等的金属珠子，或者珠子可以包括电介质材料，例如聚苯乙烯、聚丙烯、二氧化硅等等。本领域普通技术人员能够想到相对于样品介质(例如水)建立足够电学对比的珠子的其他合适材料。本发明不局限于三明治分析。可以与本发明实施例结合使用任意合适类型的分析。例如，图8示出了可选实施例，其中示出了置换分析。在该实施例中，在将IC 10暴露到潜在地包括感兴趣分析物40的样品之前，使与另一分子45结合的珠子60结合到匹配受体30。在暴露到感兴趣分析物40时，将包括珠子60的另一分子45从受体分子30驱除，并且替换以感兴趣分析物40，从而在感兴趣分析物40和受体分子30之间形成特定结合对，导致从感测电极16去除珠子60，这可以通过其电学签名的消失来检测，从而发信号表示感兴趣分析物40和受体分子30之间的特定结合事件。通过利用不同感测电极16上的不同受体分子30并且结合针对不同受体分子具有不同电学签名的珠子，可以通过相应的特征电学签名从各感测电极16消失来同时检测不同的感兴趣分析物。也可以采用其他类型的分析，例如竞争分析法。在以上示例中，已经将珠子60和60’附着到与感兴趣分析物相互作用的分子上。可选地，可以用珠子60和60’直接标记各种感兴趣的分析物。
本发明的原理不局限于基于分析的分析物检测。图9示出了可选实施例，其中将珠子60附着到感测电极16表面上的受体分子30。在该实施例中，受体分子30形成分子信标，例如DNA发夹，其中受体分子采用内部折叠的构造(internally foldedconformation),从而使得珠子60与感测电极16的表面相距第一距离。在特定结合事件中与感兴趣分析物40 (例如互补DNA单链)接合时，受体分子通过展开为更加线性或者伸展的构造来改变其构造，这使珠子60移动至感测电极16上方的新位置，与第一距离相比，该新位置相距感测电极16不同的距离。这引起了感测电极16上方电容的变化，变化的幅度由珠子60的电学签名支配。因此，具有不同电学签名的不同珠子60以及IC 10的相应感测电极16上不同类型受体分子30的结合使用，将允许通过由不同受体分子30在与匹配的感兴趣分析物形成特定结合对时的展开而导致的各种电容变化，来同时检测不同的感兴趣分析物。可以通过IC 10的表面暴露到包含多个所需受体分子30、30’的样品，来将包括多个感测电极16的IC 10的表面进行功能化。这导致受体分子在感测电极16上的随机分布。这在图10中示意性地示出。得到的功能化IClO可以容易地区别于使用定点技术来对感测电极16阵列的功能化进行差别化处理的现有技术1C，因为本发明的差别化IC在各感测电极16的表面上表现出各种受体分子30的随机(即无序)分布，而在现有技术IC中存在高度的秩序(如在图3的详细描述中所解释的那样按区域分组)。应该理解，图10提供了得到的IC 10的简化表示。实际上，大多数感测电极将包括多于一种类型的受体分子30，并且一些感测电极16根本没有被功能化。然而，这并不成问题，单独感测电极30上多种类型受体30的存在可以容易地检测到，因为在样品中存在多于一种合适的感兴趣分析物时，在该感测电极处可能发生多个结合事件，从而得到的传感器信号是这些结合反应中所涉及的珠子60的电学签名的集合。可使用已知的数学原理将该传感器信号分解为单独的分量。可选地，可以使用以下借助图21-23更加详细解释的信号调制技术在频域中检测各种结合事件。图11更加详细地示出了本发明的IC的实施例。IC 10包括具有多个感测元件的传感器阵列70，每一个感测元件均包括在IC 10的暴露表面处的分离感测电极16。可以如上所述对感测电极16功能化。可选地，可以使用已知的定点技术对感测电极16功能化。IC10还包括信号处理器80，所述信号处理器与感测阵列70的感测元件单独地相连。信号处理器80还配置用于检测包括相应感测电极16在内的每一个感测元件上的珠子60的电学签名。为此，例如，信号处理器可以访问存储器82，例如查找表，可以将多个预先定义的电学签名与分配给该签名的感兴趣分析物一起存储在存储器中。在操作中，信号处理器80可以将检测的电学签名与存储的电学签名进行比较，并且在匹配时产生输出信号，该输出信号表不检测到向存储器82中存储的电学签名所分配的感兴趣分析物。信号处理器80还可以配置用于对具体的感兴趣分析物的检测次数进行计数，例如通过对其相关联珠子的电学签名的肯定匹配次数进行计数，并且提供这种次数作为被测样品中感兴趣分析物浓度的表示。例如，IC 10可以形成包括流体通道的传感器设备(未示出)的一部分，在所述流体通道中暴露出感测阵列70，其中在典型的测量期间，通过所述流体通道馈送可能包含至 少一种感兴趣分析物的样品，从而使得感测阵列70与样品接触。可以应用后续的冲洗步骤，以去除任意未反应的感兴趣分析物，并且特别是去除任意未结合的珠子，以避免这些珠子污染感测阵列70并且破坏与相应感测电极16结合的珠子的电学签名。返回图11,应该注意,迄今为止，已经针对由相应感测电极16检测的电容大小或幅度变化，解释了电学签名的检测。然而，在频域中检测电学签名同样切实可行。在图12中示出了配置用于在频域中检测电学签名的IC的实施例。除了图11中已经示出的特征之夕卜，IClO还包括电磁场发生器90，其适用于使感测阵列70受到具有可变频率f的振荡电磁场。在该实施例中，各种珠子60应该是导电和/或磁性珠子。在操作中，电磁场发生器90使感测阵列70受到连续增加或降低频率的电磁�。窗凑崭闷德市〖缘牡绯』虼懦�。这引起了珠子60在施加的电磁场中振荡，如图13所不。在(I)中，电磁场92对于珠子60具有排斥效应,从而强迫其远离感测电极16的表面，而半个周期之后，电磁场92对于珠子60具有吸引效应，从而强迫其朝向感测电极16的表面。由受体分子30、感兴趣分析物40以及诸如三明治分析中的另一抗体之类的另一分子形成的特定结合对中的构造灵活性促进的这种周期性位移，导致了由包括感测电极16的感测元件所检测到的感测信号以振荡电磁场92的频率而被调制。依赖于珠子60的尺寸，运动阻力或者位移阻力将改变。对于每一个珠子60，将存在临界振荡频率，在所述临界振荡频率以上，珠子不能够跟随所施加的电磁场92，因为(样品)流体中的粘滞拖曳抑制了珠子60跟随该场。该截止频率与珠子60的尺寸直接相关。换句话说，不同尺寸的珠子60将表现出不同的截止频率，使得可以将具有特定尺寸的珠子的截止频率的确定用于检测与该珠子相关联的感兴趣分析物的存在。为此，信号处理器80适用于确定当具体的感测元件所检测的电容性信号的调制消失时的场频率，并且将该截止频率与在存储器82中与相关联的感兴趣分析物一起存储的截止频率进行比较。信号处理器80还可以适用于控制电磁场发生器90。在图14中示意性地示出了截止频率对于针对三个不同尺寸珠子而产生的信号调制的影响。珠子60是最大的珠子,而珠子60”是最小的珠子,珠子60’具有中间尺寸。应该立即明白的是对于这些不同尺寸的珠子，获得了不同的截止频率。现在将通过以下实验示例，更加详细地说明本发明概念的验证。应该理解的是只是为了说明性目的而选择了这些示例，并且不应该将它们解释为按照任意方式限制本发明的范围。图15示出了包括根据本发明实施例的集成电路10的生物传感器的显微图像。IC10包括65536个圆形金电极16的规则256*256阵列，每一个电极均具有130nm的直径，由图15右手侧的图像的放大部分所示。如W0200/047703中公开的那样，传感器电极16与一对串联连接的晶体管相连，并且具体地如该申请的图I所示。在图15中，利用暴露的连接110将IC 10安装到载体100上。应该理解的是这只是为了清楚起见，并且典型地用模制品覆盖连接110，以防止当将IC 10暴露到流体样品中时的短路。在以下实验中已经使用了图15所示的生物传感器。
实验I将生物传感器的IC 10暴露到IOmM磷酸盐缓冲溶液(PBS)中。在初始暴露到PBS溶液之后，将IC 10暴露到去离子水(mQ级)中10分钟，接着暴露到IOmM PBS溶液中10分钟。随后暴露到包括聚苯乙烯珠子的IOmM PBS溶液中，聚苯乙烯珠子包括细铁粒。珠子具有500nm的直径。最后，将IC 10暴露到IOmM的PBS溶液中再10分钟。实验2在该实验中，将IC 10暴露到与实验I中相同序列的溶液中，不同之处在于使用具有119nm直径的珠子。图16示出了在实验I期间获得的IC 10的两个电极16的测量信号210和220。可以看出，在用图15中标记为mQ的去离子水溶液代替PBS溶液时，观察到了电容传感器的电容的较大下降，这是由与PBS溶液相比较，去离子水的不同介电和导电性质造成的。可以观察到的并且由虚线箭头表示的电容较大下降是由电极16上方气泡的通过引起的。这导致了电极16上方介质的介电常数暂时接近1，减小了包括电极16在内的电容器的电容，这是已知的。在用PBS溶液代替去离子水时，包括电极16在内的电容器的电容再次增加。一旦将珠子添加到PBS溶液中，所测电容的向下尖峰清楚可见，如图15中的实线箭头表示。这种电容下降是由在感测电极16上方行进的电绝缘珠子引起的。应该理解，尖峰的大小除其他因素之外，依赖于珠子与感测电极16的重叠以及珠子与感测电极16的距离。重要的是观察到信号迹线210和220清楚地说明，在PBS+BEADS时间段期间，珠子信号比这些信号中的典型噪声电平强得多。图17针对不同电极16的多个信号迹线更加详细地示出了图16的PBS+BEADS时间段的一部分。这里，如实线箭头所示，可以清楚的认识到，通过电极16之一的珠子引起包括该感测电极16作为其极板之一的电容器的电容明显下降。从图18中可以得出，IClO的单独电极16能够检测单独珠子的另外证据，图18示出了图15中IC 10的130nm金电极16的信号迹线。如实线箭头所示，电容下降归因于足够邻近区域中通过金电极16表面的电绝缘珠子，使得通过金电极16检测到500nm直径的珠子。然而应该理解，珠子具有比金电极16显著地大的直径。当IC的金电极16之间的间距是300nm左右时，这意味着这种珠子也必须部分地与相邻的金电极重叠，这将在与主检测事件同时触发这些周围电极的信号迹线中较小幅度的检测信号。如图18中的虚线箭头所示，可以观察到这种次级检测事件。图16-18证明了检测到通过IClO表面上方的珠子。图19证明了可以在静止在电极16表面上的同时检测到珠子。示出了在实验I期间获得的IC 10的单独金电极16的若干信号迹线，包括信号迹线250和260。如实线箭头所示，信号迹线250和260示出了实验I的PBS+BEADS时间段期间电容的显著下降，这种减小在随后的PBS冲洗时间段期间反转。在信号迹线250和260中观察到的电容的这种持续下降归因于粘附到相应金电极16表面上的珠子。可以看出，在珠子粘附到电极表面期间，观察不到(另外的)单独珠子事件。应该注意的是为了完整性，尚未完全理解这些珠子粘附到电极16的金表面上背后的机制。图20示出了在实验2期间获得的相应单独电极16的多个信号迹线，其中使用119nm电绝缘珠子来代替实验I的500nm的珠子。在图20中示出了该实验的PBS+BEADS工作段。实线箭头表示由金电极16检测到的珠子粘附事件，而虚线箭头表示珠子经过金电极16。应该注意，为了清楚起见，图20的Y轴示出了电容的减小而不是电容，从而将图20中 的珠子检测事件表示为信号迹线中的正变化。更具体地，Y轴显示了 A/D转换器代码，该代码的增加对应于测量电容的减小。图21示意性示出了 IC 10的电极16的控制信号300的优选实施例。控制信号300包括第一调制，其典型的是高频调制，典型地位于MHz域中；以及第二调制，其由图21中的虚线表示，并且是比第一调制低得多的频率，并且典型地在kHz域。在图22中示出了控制信号300的调制频率。高频调制用于改善电容测量的分辨率，因为使用高频调制信号能够精确地测量小电容这本身是已知的。现在将更加详细的解释第二频率调制的目的。当诸如珠子60之类的珠子经由一个或多个(生物)分子而附着到电极16的表面时，珠子60将试图跟随控制信号300中的调制，因为这种调制使电极16上方的电场以第一和第二调制频率而被调制。第一(高)频率调制对于珠子60或60’而言太高而不能够对这种调制进行响应，因为珠子60所悬置于的介质的粘滞拖曳太高而不允许珠子60跟随这种调制。然而，具有nm尺寸的珠子60的临界响应频率典型地位于kHz域。临界响应频率是珠子60可以跟随的最大调制频率。因为临界响应频率由珠子60的物理性质支配，主要由其尺寸支配，不同尺寸的珠子60将表现出不同的临界响应频率，如图23中的箭头400所示。为此，IC 10的控制电路可以适用于执行控制信号300的信号扫描，其中将第二(低频)调制的频率系统地从第一频率值改变为第二频率值，或者按照离散步长改变或者连续地改变。只要控制信号30的第二调制频率保持小于具体珠子60的临界响应频率，电极16将产生以第二调制频率调制的电容信号，因为珠子60能够跟随电场中感应的变化，即珠子60能够根据所施加的电场而振荡，从而引起包括电极16在内的电容器的电容的调制变化。然而，一旦控制信号300的第二调制频率超过具体珠子60的临界响应频率，电极16所检测的信号的调制将消失，因为珠子不再能够跟随电场方向的变化，即变得静止不动，使得包括电极16在内的电容器的电容值调制将消失。因为不同的珠子60典型地具有不同的临界响应频率，具体珠子60在电极16上的结合事件可以简单地通过其临界响应频率的确定来检测。这也使得可以同时检测单一电极16上不同的感兴趣分析物的结合事件，因为可以通过其相关联珠子的唯一临界响应频率来识别每一个结合事件，从而可以在第二调制频率的单独频率扫描中容易地检测到多个结合事件。最后需要指出的是，本发明的方法和IC适用于涉及特定结合事件的所有已知生物亲和反应(affinity reaction),结合事件例如DNA、蛋白质、核酸适体(aptamer)、膜蛋白质结合反应等等。应该注意，上述实施例说明而不是限制本发明，并且在不脱离所附权利要求范围的情况下，本领域普通技术人员将能够设计许多替代的实施例。在权利要求中，放置在括号中的任意参考符号不应该解释为限制权利要 求。词语“包括”不排除权利要求中列举的元件或步骤之外的其他元件或步骤的存在。元件前的词语“一”或“一个”不排除多个这种元件的存在。可以通过包括若干不同元件的硬件来实现本发明。在枚举了若干装置的设备权利要求中，可以通过同一硬件来实现这些装置的若干装置。在相互不同的从属权利要求中阐述具体措施的事实不表示不能有利地使用这些措施的组合。
权利要求
1.ー种对集成电路(10)进行功能化的方法，所述集成电路包括承载多个感测电极(16)的暴露表面，所述方法包括 提供ー种包括多个生物分子受体分子(30，30’ )的溶液，所述多个生物分子受体分子(30，30’ )用于选择性地结合到不同的感兴趣分析物(40，40’ );以及 将所述表面暴露到所述溶液，从而形成所述受体分子在相应感测电极上的随机分布。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤向所述集成电路(10)提供信号处理器(80)，所述信号处理器与各感测电极(16，16’ )单独耦合，所述信号处理器适用于基于在所述感测电极之一上感兴趣分析物(40，40’ )的特定结合事件中所涉及的珠子(60，60’ )的电学签名，来识别所述特定结合事件。
3.—种检测感兴趣分析物的方法，包括 提供根据权利要求1或2所述的功能化的集成电路(10)，使得第一感测电极(16)在其表面处包括第一受体分子(30)，所述第一受体分子(30)用于选择性地结合到感兴趣的第一分析物(40)，以及第二感测电极在其表面处包括第二受体分子(30’)，所述第二受体分子(30’ )用于选择性地结合到感兴趣的第二分析物(40’ )； 将所述功能化的集成电路暴露到可能包括感兴趣的第一分析物和第二分析物中至少一种的样品； 提供具有第一电学签名的第一珠子(60)，所述第一珠子附着于第一分子(30，40，45)，所述第一分子(30，40，45)具有用于依赖于所述样品中第一分析物(40)的存在而结合到第一感测电极的构造或者亲和カ； 提供具有第二电学签名的第二珠子出0’)，所述第二珠子附着于第二分子(30’，40’，45’)，所述第二分子(30’，40’，45’)具有用于依赖于所述样品中第二分析物(40’)的存在而结合到第二感测电极的构造或者亲和カ；以及 分别确定第一感测电极和第二感测电极上第一珠子和/或第二珠子的电学签名的存在。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一珠子￠0)和所述第二珠子出0’)具有不同的尺寸和/或由不同的材料制成。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述样品中包括第一分子(40，45)和第二分子(40，，45，)。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述第一分子(40，45)具有用于结合到第一受体分子(30)的亲和力，而所述第二分子(40’，45’)具有用于结合到第二受体分子(30’ )的亲和力。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一分子是第一分析物(40)，而所述第二分子是第二分析物(40’)。
8.根据权利要求5所述的方法，还包括步骤 在将所述阵列暴露到所述样品之前，在第一受体分子(30)和第一分子(45)之间以及在第二受体分子(30’ )和第二分子(45’ )之间形成相应的结合对；以及 在将所述阵列暴露到所述样品之后，在所述结合对中用感兴趣的第一分析物(40)代替第一分子和/或用感兴趣的第二分析物(40’ )代替第二分子。
9.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述第一分子是第一受体分子(30)，而第二分子是第二受体分子(30’)，并且其中在不存在感兴趣的第一分析物(40)的情况下第一受体分子采用发夹构造，而在不存在感兴趣的第二分析物(40’ )的情况下第二受体分子采用发夹构造。
10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中第一珠子￠0)和第二珠子出0’)是磁珠。
11.根据权利要求10所述的方法，其中分别检测第一感测电极(16)和第二感测电极(16’ )上第一珠子￠0)和/或第二珠子出0’ )的电学签名的步骤包括 至少向第一感测电极和第二感测电极提供具有时变频率的振荡电磁场(92);以及 检测频率依赖电信号，所述频率依赖电信号指示每ー个所述感测电极上一定尺寸珠子的存在。
12.ー种集成电路(10)，包括 多个可单独寻址的感测电极(16，16’ );以及 与各感测电极单独耦合的信号处理器(80)，所述信号处理器适用于基于在所述感测电极之ー上感兴趣分析物(40，40’)的特定结合事件中所涉及的珠子出0，60’)的电学签名，来识别所述特定结合事件。
13.根据权利要求12所述的集成电路，其中所述多个感测电极包括第一感测电极(16)，在其表面处包括第一受体分子(30)，所述第一受体分子用于选择性地结合到感兴趣的第一分析物(40)，以及第二感测电极(16’)，在其表面处包括第二受体分子(30’)，所述第二受体分子用于选择性地结合到感兴趣的第二分析物(40’)。
14.根据权利要求12或13所述的集成电路(10)，其中相应的感测电极(16，16’)包括不同受体分子(30，30’ )的随机分布。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的集成电路(10)，还包括场发生器(90)，用于向所述多个感测电极(16，16’ )施加具有时变频率的振荡电磁场(92)，其中所述信号处理器(80)适用于通过感兴趣分析物(40，40’ )的结合反应中所涉及的珠子(60，60’ )在所述振荡电磁场中的谐振特性，来识别所述感兴趣分析物(40，40’)。
全文摘要
公开了一种提供功能化集成电路的方法，使第一感测电极在表面处包括选择性结合到感兴趣第一分析物的第一受体分子，第二感测电极在表面处包括选择性结合到感兴趣第二分析物的第二受体分子；将功能化集成电路暴露到潜在包括第一分析物和第二分析物中至少一种的样品；提供附着到第一分子、具有第一电学签名的第一珠子，第一分子具有依赖于样品中第一分析物的存在而结合到第一感测电极的构造或亲和力；提供附着到第二分子、具有第二电学签名的第二珠子，第二分子具有依赖于样品中第二分析物的存在而结合到第二感测电极的构造或亲和力；分别确定第一感测电极和第二感测电极上第一珠子和/或第二珠子的电学签名的存在。还提供了一种实现这种方法的IC。
文档编号G01N27/00GK102954984SQ20121029742
公开日2013年3月6日 申请日期2012年8月20日 优先权日2011年8月22日
发明者菲利浦·弗雷德里, 弗里斯科·耶德玛, 戴维·斯滕温克尔, 希尔柯·瑟伊 申请人:Nxp股份有限公司
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