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专利名称：基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测生物分子反应的装置技术领域，特别涉及一种基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置。
背景技术：
生命科学中，生物分子之间相互作用是一种基本的生命现象，也是现代生命科学研究的重大课题之一。研究生物分子之间相互作用的传统方法有多种，如放射免疫分析法、 酶连结免疫分析法和标记示踪法等。然而，由于涉及不同种类和不同含量的细胞或生物分子，并且细胞或生物分子之间存在复杂的相互作用，因此上述传统方法很难准确获取相关的传递信息。另一方面，日益增加的新蛋白和DNA序列数据也迫切需要能够准确、快速鉴定生物分子之间相互作用的新方法。近年来，许多新技术如激光共聚焦显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、电子显微镜(TEM、SEM, AFM)和表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)等已被用于实时观察生物分子之间的相互作用过程。在这些技术中，表面等离子共振技术具有灵敏度较高、响应快、抗电磁干扰能力强、能实时监控、样品消耗低和操作简便等优点。特别是在生物科学领域，表面等离子共振技术可实时追踪生物分子之间相互作用的动力学信息，并能获得生物分子之间相互作用的动力学常数和平衡常数。因此， 表面等离子共振技术引起了人们的极大兴趣，并在近十年中迅速发展。目前，表面等离子共振技术获取信息主要有角度调制、波长调制、相位调制和强度调制四种方式。角度调制方式因其灵敏度高已成为商用和科研用表面等离子共振系统的主要检测方式。但是，与波长调制方式相比，角度调制方式仍然存在设备造价高和操作复杂的缺点。表面等离子共振技术的上述四种检测方式都存在难以区分非特异性吸附、无法原位精确观察生物分子之间的相互作用过程、以及对温度和样品组成等干扰因素敏感的问题。为了解决这些问题，研究人员对表面等离子共振系统进行了优化和改进，最常见的方法是将其与其它检测设备联合使用，如电化学表面等离子共振仪、腔环降(ring-down)表面等离子共振仪、近场光学扫描显微镜表面等离子共振仪、傅立叶变换表面等离子共振仪、 MALDI-T0F质谱表面等离子共振仪和微流控多通道表面等离子共振检测仪等。发明专利CN101441175B基于角度调制型表面等离子共振系统，设计了激光扫描共聚焦表面等离子共振装置，将激光共聚焦技术与角度调制型表面等离子共振相结合，实现了对生物分子之间相互作用过程的原位、实时、定量和灵敏检测。该发明专利为深入了解不同物种包括小分子、蛋白分子、大分子、纳米单体、细胞之间的相互作用信息及其动力学过程提供了强有力的研究工具和手段。然而，该发明所述装置仍然存在如下两个缺点(1)需要斩波器和锁相放大器，设备昂贵，成本高，不利于推广使用；(2)操作复杂，使用不便
发明内容
本发明的目的是提供一种基于激光共聚焦成像的波长调制型表面等离子共振检测装置。本发明提供的基于激光共聚焦成像的波长调制型表面等离子共振检测装置包括直角棱镜、一面镀有反射膜的基片、恒温流通池、光路机构、注射泵、倒置激光扫描共聚焦显微镜、光谱仪和处理系统；所述光路机构包括白光光源、光束整形镜组、起偏器、聚焦透镜和光纤接收头；所述白光光源、光束整形镜组和起偏器依次设置在沿入射光的光路上，所述聚焦透镜和光纤接收头依次设置在沿出射光的光路上； 所述恒温流通池上端开口，所述基片设置在所述恒温流通池上使得所述恒温流通池上端封闭，所述基片镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池内；所述棱镜设置在所述基片上，所述棱镜与所述基片之间有折射率匹配液；所述恒温流通池的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵的出液口和进液口连接；所述恒温流通池置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜的载物台位置；所述光纤接受头通过光纤与所述光谱仪连接，所述光谱仪与所述处理系统电连接，所述处理系统分别与所述注射泵和所述倒置激光扫描共聚焦显微镜电连接。优选地，所述装置还包括三维调节机构，用于调节所述恒温流通池及置于其上的所述基片和所述棱镜的空间三维位置，以使得所述基片表面的所述反射膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜的焦平面处。优选地，所述装置还包括调角机构，用于调节入射光和/或出射光的光路方向。优选地，通过所述调角机构的调节能够使入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在-20度到90度之间连续变化。优选地，所述光谱仪用于将来自所述光纤接受头的光信号转换成电信号并将转换后的电信号发送到所述处理系统。优选地，所述倒置激光扫描共聚焦显微镜用于对生物样品的反应过程进行成像并将其发送到所述处理系统。优选地，所述处理系统包括带有BNC适配器的数据采集卡和数据处理装置，所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。优选地，所述BNC适配器用于接受来自所述光谱仪的电信号，所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据，所述数据处理装置用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。优选地，所述恒温流通池的侧壁和底面采用石英玻璃材质；所述恒温流通池的进液口和出液口采用聚四氟乙烯材质的密封圈密封。优选地，所述棱镜和所述基片的材质相同，所述棱镜和所述基片的材质包括K9玻
璃或蓝宝石玻璃。优选地，所述白光光源发出的光的波长范围为400-800nm。优选地，所述基片表面的所述反射膜包括金膜、银膜AiK45nm)/[Ti(^20nm)/ IT0(20nm)]4/Au(20nm)复合膜、Au (25nm) / [TiO2 (20nm) /SiO2 (20nm) ] 2/Au (30nm)复合膜或金纳米阵列结构。
本发明具有如下有益效果(1)所述装置用白光光源代替现有技术的激光器，成本降低；(2)所述装置用光纤接受头代替现有技术的硅光电二极管作为出射光的接收元件，成本进一步降低；(3)所述装置用光谱仪代替现有技术的锁相放大器和斩波器，成本进一步降低；(4)所述装置用直角棱镜、一面镀有反射膜的基片和折射率匹配液代替现有技术的底面镀有反射膜的半球形棱镜，不仅成本进一步降低，而且使得所述装置的应用范围更广，使用更方便；(5)所述装置通过所述调角机构的调节能够使入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在-20度到90度之间连续变化，操作简单；(6)所述装置能够检测的折射率变化高达2 X 10_5，检测灵敏度高达10_、/πι1，图像分辨率高达2 μ m。


图1为本发明实施例1提供的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置的示意图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明的发明内容作进一步的描述。实施例1如图1所示，本实施例提供的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置包括直角棱镜1、一面镀有反射膜的基片2、恒温流通池3、光路机构4、注射泵5、倒置激光扫描共聚焦显微镜6、光谱仪7、处理系统8、三维调节机构(图中未示出)和调角机构 (图中未示出)。所述恒温流通池3上端开口，其两侧分别设有进液口和出液口。所述基片2设置在所述恒温流通池3上使得所述恒温流通池3上端封闭，所述基片2镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池3内。所述棱镜1设置在所述基片2上，所述棱镜1与所述基片2之间有折射率匹配液，用于使所述棱镜1和所述基片2的折射率匹配。在本实施例中，所述恒温流通池3的尺寸例如为15mmX 15mmX2mm ；所述恒温流通池3的四侧壁和底面采用例如石英玻璃材质，且四侧壁和底面的厚度例如分别为Imm和0. 17mm ；所述恒温流通池3的进液口和出液口采用例如聚四氟乙烯材质的密封圈密封；所述恒温流通池3中的温度范围为 20-45°C，其温度精度为士0.5°C。在本实施例中，所述直角棱镜1和所述基片2采用例如 K9玻璃材质；所述直角棱镜1的尺寸例如为20mmX20mmX^mm ；所述基片2的一面镀有例如50nm厚的金膜作为所述反射膜；所述直角棱镜1与所述基片2之间的折射率匹配液的折射率例如为1.52。所述恒温流通池3的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵5的出液口和进液口连接。所述注射泵5用于使恒温流通池3中的液体循环流通。在本实施例中，所述注射泵5采用例如带有控制器的注射泵，其型号例如为PHD22/2000，所述注射泵5的容量例如为 0. 5 μ L-140ML，其流速例如为 220. 82ml/min_0. 0001 μ 1/hr。
所述恒温流通池3置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜6的载物台位置。在本实施例中，所述倒置激光扫描共聚焦显微镜6采用例如40倍的物镜，其分辨率例如为2 μ m，其焦平面在竖直方向的可调距离例如为2. 7-3. 7mm。所述三维调节机构用于调节所述恒温流通池3及置于其上的所述基片2和所述棱镜1的空间三维位置。在本实施例中，所述三维调节机构采用例如手动三维调节机构。通过所述手动三维调节机构调节所述恒温流通池3 及置于其上的所述基片2和所述棱镜1的空间三维位置，以使得所述基片2表面的所述金膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜6的焦平面处。所述光路机构4包括两个机械臂(图中未示出)，其中，在一机械臂上沿入射光的光路方向依次设置有白光光源41、光束整形镜组42和起偏器43，在另一机械臂上沿出射光的光路方向依次设置有聚焦透镜44和光纤接收头45。通过所述调角机构调节入射光和/或出射光的光路方向。在本实施例中，所述白光光源41采用例如功率为3W、波长为 400-800nm的LED ；所述光束整形镜组42包括沿入射光的光路方向依次设置的连续变倍扩束镜头(图中未示出)和准直镜筒(图中未示出)；所述连续变倍扩束镜头的适用波长范围例如为400-800nm，其扩束比例如为5_6倍；所述准直镜筒的镜筒总长度例如为134mm ； 所述光束整形镜组42的入射光斑和出射光斑的直径例如分别为4mm和24mm。所述白光光源41发出的入射光先经所述光束整形镜组42准直成准平行光，然后经所述起偏器43成为偏振方向平行于入射面的P偏振光或S偏振光，再以入射角等于全反射角的方式入射到所述棱镜1和所述基片2中并被所述基片2表面的所述金膜反射后出射；所述出射光经所述聚焦透镜44聚焦后被所述光纤接收头45接收，所述光纤接收头45 将接受到的光信号发送到所述光谱仪7。通过所述调角机构的调节能够使入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在-20度到90度之间连续变化。所述光纤接受头45通过光纤与所述光谱仪7连接，所述光谱仪7与所述处理系统 8电连接，所述处理系统8分别与所述注射泵5的控制器和所述倒置激光扫描共聚焦显微镜 6电连接。所述光谱仪7用于将来自所述光纤接受头45的光信号转换成电信号后发送到所述处理系统8。所述处理系统8包括带有BNC (Bayonet Nut Connector)适配器的数据采集卡和数据处理装置，所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。在本实施例中，所述BNC 适配器的型号例如为BNC-2110 ；所述数据采集卡的型号例如为PCI-6220 ；所述数据处理装置采用例如计算机。所述BNC适配器用于接受来自所述光谱仪8的电信号并将其进行分通道处理，所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据，所述计算机用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。所述倒置激光扫描共聚焦显微镜6用于对生物样品的反应过程进行成像并将其发送到所述计算机，所述计算机将成像信号与表面等离子信号进行实时比较。在本实施例中，所述金膜上有用化学方法修饰的生物敏感膜例如IgG抗体分子； 通过所述注射泵5控制例如含有anti-IgG的水溶液在所述恒温流通池3中流通，其流速例如为0. 005-200ml/min,其精度例如为士 1 % ；所述恒温流通池3中的anti-IgG与IgG抗体分子接触时发生反应并引起所述金膜表面的折射率变化，使得出射光的表面等离子共振波长发生变化。应用本实施例所述装置能够对生物分子样品之间的反应和相互作用进行定量和/ 或定性表面等离子信号检测，并能够同时进行荧光成像观察，操作方便，检测成本低。本实施例所述装置能够检测的折射率变化高达2 X 10_5，检测灵敏度高达10_、/πι1，图像分辨率高达2 μ m。实施例2所述基片2表面的发射膜采用例如Au (45nm) / [TiO2 (20nm)/ITO (20nm) ] J Au (20nm)复合膜或 Au (25nm) / [TiO2 (20nm) /SiO2 (20nm)]2/Au (30nm)复合膜，其它与实施例 1相同。与实施例1相比，本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高1-2个数量级。实施例3所述直角棱镜1和所述基片2采用例如折射率为1. 81的蓝宝石玻璃，其它与实施例1相同。本实施例所述装置将样品的折射率检测范围扩大为1. 33-1. 76。实施例4所述基片2表面的发射膜采用例如用纳米刻蚀法制备的金纳米阵列结构，其它与实施例1相同。与实施例1相比，本实施例所述装置的灵敏度和检测精度能提高1-2个数量级。实施例5所述光谱仪8采用例如型号为AM1300的1300 X 1024面阵CXD (电荷耦合器件)， 其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够实现对面积大于或等于9cm2的阵列式生物样品进行检测。实施例6所述基片2表面的例如金膜表面修饰有能够识别汞离子的荧光探针，所述恒温流通池3中流通有被汞离子污染的生物细胞蛋白分子，其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够对生物体内的汞离子进行检测。实施例7所述基片2表面的例如金膜表面修饰有能够识别锌离子的荧光探针，所述恒温流通池3中流通有被锌离子污染的生物细胞蛋白分子，其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够对生物体内的锌离子进行检测。实施例8所述基片2表面的例如金膜表面修饰有能够识别镁离子的荧光探针，所述恒温流通池3中流通有被镁离子污染的生物细胞蛋白分子，其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够对生物体内的镁离子进行检测。实施例9所述基片2表面的例如金膜表面修饰有能够识别氟离子的荧光探针，所述恒温流通池3中流通有被氟离子污染的生物细胞蛋白分子，其它与实施例1相同。本实施例所述装置能够对生物体内的氟离子进行检测。应当理解，以上借助优选实施例对本发明的技术方案进行的详细说明是示意性的而非限制性的。本领域的普通技术人员在阅读本发明说明书的基础上可以对各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
权利要求
1.基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，其特征在于，该装置包括直角棱镜⑴、一面镀有反射膜的基片⑵、恒温流通池⑶、光路机构⑷、注射泵(5)、倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)、光谱仪(7)和处理系统(8)；所述光路机构(4)包括白光光源(41)、光束整形镜组(42)、起偏器(43)、聚焦透镜 (44)和光纤接收头0 ；所述白光光源(41)、光束整形镜组0 和起偏器依次设置在沿入射光的光路上，所述聚焦透镜G4)和光纤接收头0 依次设置在沿出射光的光路上；所述恒温流通池( 上端开口，所述基片( 设置在所述恒温流通池C3)上使得所述恒温流通池( 上端封闭，所述基片( 镀有反射膜的一面朝向所述恒温流通池(3)内；所述棱镜(1)设置在所述基片( 上，所述棱镜(1)与所述基片( 之间有折射率匹配液；所述恒温流通池C3)的进液口和出液口通过管路分别与所述注射泵( 的出液口和进液口连接；所述恒温流通池( 置于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)的载物台位置；所述光纤接受头0 通过光纤与所述光谱仪(7)连接，所述光谱仪(7)与所述处理系统(8)电连接，所述处理系统(8)分别与所述注射泵( 和所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)电连接。
2.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述装置还包括三维调节机构，用于调节所述恒温流通池(3)及置于其上的所述基片( 和所述棱镜(1)的空间三维位置，以使得所述基片( 表面的所述反射膜位于所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)的焦平面处。
3.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述装置还包括调角机构，用于调节入射光和/或出射光的光路方向。
4.根据权利要求3所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，通过所述调角机构的调节能够使入射光和/或出射光与所述反射膜之间的夹角在-20度到90度之间连续变化。
5.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述光谱仪(7)用于将来自所述光纤接受头0 的光信号转换成电信号并将转换后的电信号发送到所述处理系统(8)。
6.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)用于对生物样品的反应过程进行成像并将其发送到所述处理系统(8)。
7.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述处理系统(8)包括带有BNC适配器的数据采集卡和数据处理装置，所述数据采集卡与所述数据处理装置电连接。
8.根据权利要求7所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述BNC适配器用于接受来自所述光谱仪(7)的电信号，所述数据采集卡用于采集所述BNC适配器输出的数据，所述数据处理装置用于对来自所述数据采集卡的数据进行存储、分析和处理。
9.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置， 其特征在于，所述恒温流通池( 的侧壁和底面采用石英玻璃材质；所述恒温流通池(3)的进液口和出液口采用聚四氟乙烯材质的密封圈密封。
10.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，其特征在于，所述棱镜(1)和所述基片O)的材质相同，所述棱镜(1)和所述基片(2) 的材质包括K9玻璃或蓝宝石玻璃。
11.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，其特征在于，所述白光光源Gl)发出的光的波长范围为400-800nm。
12.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，其特征在于，所述基片(2)表面的所述反射膜包括金膜、银膜AiK45nm)/[Ti0j20nm)/ IT0(20nm)]4/Au(20nm)复合膜、Au (25nm) / [TiO2 (20nm) /SiO2 (20nm) ] 2/Au (30nm)复合膜或金纳米阵列结构。
13.根据权利要求1所述的基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，其特征在于，所述装置能够检测的折射率变化高达2X10_5，检测灵敏度高达KT11gAil, 图像分辨率高达2 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种基于激光共聚焦成像的波长调制表面等离子共振检测装置，该装置包括直角棱镜(1)、一面镀有反射膜的基片(2)、恒温流通池(3)、光路机构(4)、注射泵(5)、倒置激光扫描共聚焦显微镜(6)、光谱仪(7)和处理系统(8)；所述光路机构(4)包括白光光源(41)、光束整形镜组(42)、起偏器(43)、聚焦透镜(44)和光纤接收头(45)；所述白光光源(41)、光束整形镜组(42)和起偏器(43)依次设置在沿入射光的光路上，所述聚焦透镜(44)和光纤接收头(45)依次设置在沿出射光的光路上。所述装置成本低，操作简单，使用方便，应用范围广。所述装置能够检测的折射率变化高达2×10-5，检测灵敏度高达10-11g/ml，图像分辨率高达2μm。
文档编号G01N21/55GK102519914SQ20111043626
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月22日 优先权日2011年12月22日
发明者张洪艳, 汪鹏飞 申请人:中国科学院理化技术研究所