专利名称：浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种抗生素含量的测定方法，尤其是一种浊度法测定杆菌肽及 其制剂含量的方法。
技术背景杆菌肽(Bacitracin)的产生菌为枯草芽孢杆菌(Bacilus subtilis)和 苔藓样芽孢杆菌(Bacilus Licheniformis)，系含噻唑环的多肽类多组分抗生 素。杆菌肽能抑制细菌细胞壁中主要成分线性肽聚糖链的形成，也影响原生质 体、破坏浆膜等，对革兰氏阳性菌有高度的抗菌活性，细菌很少对本品产生获 得性耐药性，与新霉素(Neomycin)、多粘菌素B (Polymyxin B)等联合局部 应用有协同作用。目前，杆菌肽原料药及其制剂为《中国药典》2005年版二部 所收载，其含量测定方法为抗生素微生物检定法之管碟法，其基本原理是利用 抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内的扩散作用，形成一定浓度的含抗生 素的球型区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈，将已知效价的标准 溶液和未知效价的供试品溶液在同样条件下进行培养，比较两者抑菌圈大�。� 在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度与抑菌圈直径成正比。管碟法要严格控制培养时间，防止不适当的培养时间对抑菌圈的清晰度的 影响，由于某些抗生素呈抑菌作用，在抑菌圈边缘的菌群只是被抑制，当延长 培养时间后，细菌总量增加，使抗生素敏感度下降。抑菌圈边缘的菌群继续生 长导致抑菌圈变小和边缘不整齐，如采用枯草芽孢杆菌作为检定菌时，培养时 间过长，菌丝向圈内生长，导致边缘不整齐，但采用藤黄微球菌作为检定菌时， 在规定的温度和时间培养后，可再置室温和继续培养2 — 3小时，可使抑菌圈清晰，这可能是抑菌圈边缘菌群继续生长，并产生色素，使抑菌圈边缘致密而显 清晰。这样就造成了管碟法在测定抗生素的含量时对时间的掌控要求较高，并 且耗时较长。所以采用管碟法测定抗生素如杆菌肽的含量有以下缺点操作不 易掌控、测定结果误差较大、测定速度较慢，使其在工业生产中存在很大的应 用局限性。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方 法，以简单、快速、准确的测定杆菌肽及其制剂含量。为解决上述技术问题，本发明采用下述方法步骤(1)、标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2.5mg，用O. 1M盐酸溶液定容至25ml，制成标准品贮备液； 取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成标准品中间溶液； 用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在 0. lug/ml-0.8ug/ml之间的3 — 5组溶液，制成标准品系列剂量溶液，其中标准 品系列剂量溶液的浓度中含有0. 4ug/ml的溶液，其它溶液浓度分散在0. 4ug/ml 两边；(2) 、供试品溶液的制备称取杆菌肽样品2. 5mg，用水定容至25ml量瓶 中，制成样品贮备液；取上述样品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制 成样品中间溶液；取样品中间溶液4.0ml，用灭菌缓冲液定容至100ml，制成供 试品溶液；(3) 、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中 培养，稀释后制成试验菌悬液；(4) 、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成4一6个浓度 组，取对应组数的试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml;在37T:培养3h-4h，用比浊法测量 仪在线测定各管在530rnn处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH=6. 0 的磷酸盐缓冲液1. Oml和抗生素微生物检定用培养基液体9. Oml，作为同条件 培养的溶液的空白；另一支加入PH二6. 0的磷酸盐缓冲液1. Oml和试验菌悬液 9.0ml，作为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3 — 5组测定；(5)、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂 的含量。本发明也可采用下述方法步骤(1)、标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2. 5mg，用0. 1M盐酸定容至25ml，制成标准品贮备液；量取上述标准品贮备 液5ml，用灭菌缓冲液稀定容至25ml量瓶中，制成标准品中间溶液；用灭菌缓 冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之间的 2组溶液，制成标准品高剂量溶液和标准品低剂量溶液；(2)、称取杆菌肽样品2.5mg，用水定容至25ml，制成样品的贮备液； 量取上述贮备液5ml，定容至25ml，制成样品中间溶液；用灭菌缓冲液稀释样 品中间溶液，制成与上述标准品溶液浓度相同的供试品高剂量溶液和供试品低 剂量溶液；(3) 、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中 培养，稀释后制成试验菌悬液；(4) 、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成4个浓度组， 取6个试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的 标准品或供试品溶液各l.Oml;在37。C培养3h-4h，用比浊法测量仪在线测定 各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓 冲液1. Oml和抗生素微生物检定用培养基液体9. Oml，作为同条件培养的溶液的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓冲液1. 0ml和试验菌悬液9. Oml，作 为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3 — 5组测定；(5)、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂 的含量。本发明还可采用下述方法步骤标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2.5mg，用O. 1M盐酸溶液定容至25ml，制成标准品贮备液；量取上述标准品贮 备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将 标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之间的3组溶 液，制成标准品高剂量溶液、标准品中剂量溶液和标准品低剂量溶液；(2) 、称取杆菌肽样品2. 5mg，加水定容至25ml，制成样品贮备液；量取 样品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成样品中间溶液；用灭菌缓冲 液稀释样品中间溶液，制成与上述标准品溶液浓度一致的供试品高剂量溶液、 供试品中剂量溶液和供试品低剂量溶液；(3) 、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中 培养，稀释后制成试验菌悬液；(4) 、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成6个浓度组， 取6个试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的 标准品或供试品溶液各l.Oml;在37。C培养3h-4h，用比浊法测量仪在线测定 各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓 冲液1. Oml和抗生素微生物检定用培养基液体9. Oml，作为同条件培养的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓冲液1. Oml和试验菌悬液9. Oml，作 为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3 — 5组测定；(5) 、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂的含量。本发明采用浊度法测定杆菌肽及其制剂的含量，浊度法又称为比浊法，其 为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散 射测量技术。当光束通过一含有悬浮质点的介质时，由于悬浮质点对光的散射 作用和选择性的吸收，使透射光的强度减弱。在浊度法中，透光度和悬浮物质浓度的关系类似于朗伯一 比尔定律^1g+=^<:，式中s为浊光度(或浊率)， 表示由于悬浮物的散射作用而引起的光强度衰减；/。和/分别为入射光强度(通过纯溶剂)和透射光强度(通过混浊样品)；6为光程长度；C为悬浮质点的浓度；《为常数，有时又叫浊度系数，其值与粒子的大小、形状、入射光的波长、悬浮物和介质的折射率有关。本发明的原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的澄清的营养丰 富的液体培养基中，混匀后，在一定的温度下，短期培养，培养基变浑浊，其 浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增加之 间存在直接关系，当一定光束照射培养基时，通过测定其透过率就可知道细菌 生长的情况，其吸光度与抗生素浓度关系符合比尔定律，即在一定的抗生素浓 度范围内，剂量反应为一直线。因此，在剂量反应响应曲线的直线范围内，即 可设计用比浊法测定抗生素含量。浊度法分为一剂量法、二剂量法和三剂量法， 本发明分别选用该三种方法测定杆菌肽及其制剂的含量。本发明采用的浊度法采用振摇培养，以增加氧的供应，促进细菌生长，所 以本发明方法要尽量縮短培养时间，避免因静置培养过程中，细菌慢慢沉降至 底部，产生梯度的微生物生长区，表面为微亲氧性，底部为厌氧性。这样本方 法就大大縮短了培养的时间，从而加快了测定的速度。本测定方法简单、准确、 快速，可广泛的应用与工业生产和实验室内。本发明的抗生素微生物检定法-多剂量浊度法是利用抗生素在液体培养基 中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大�。冉媳曜计� 与供试品对试验菌生长抑制的程度，以测定供试品效价的一种方法。采用管碟 法测定含量时，受扩散系数、培养基粘稠度、抑菌圈大小等诸多因素影响，因 此测定误差较大；而杆菌肽系含噻唑环的多肽类多组分抗生素，组成分较复杂， 各组分在固体培养基中扩散系数不同，抑菌圈极易产生次级圈，从而影响测定， 使结果准确度大大下降。采用浊度法测定，是在液体培养基中进行，可避免上述因素的影响；用固 定波长测定菌液的吸光度，其精密度优于管碟法中对抑菌圈的测定。本发明方 法的培养方式采用振摇培养，以增加氧的供应，促进细菌生长，所以本发明方 法要尽量縮短培养时间，避免因静置培养过程中，细菌慢慢沉降至底部，产生 梯度的微生物生长区，表面为微亲氧性，底部为厌氧性。本发明测定过程3h 4h，加上其他操作，可在当天获得结果；而采用管碟法需第二天才能获得结果。 因此本发明测定方法更为快速、准确，当遇到争议样品时，采用浊度法作为仲 裁方法。采用一剂量法及二剂量法可以大量快速测定产品，适用于生产企业中间体 的快速检测，对于产品的投料、产品的合成等有指导意义；也可作为医院、海 关等部门的快速检测使用。采用三剂量法测定产品，是产品含量的准确度的最 佳及最高检测方法，可作为仲裁方法。采用本发明方法测定，其结果能真实反映出供试品的体外抗菌活性。有关 生产企业可根据测定结果优选出最佳的合成生产工艺，因此，抗生素微生物检 定法-多剂量浊度法对有关生产企业指导生产，进一步改进生产工艺，提高药品 质量具有不可替代的指导作用。采用抗生素微生物检定法-多剂量浊度法测定杆菌肽及其制剂的含量不但试验方法准确、有效、成本低廉，而且试验结果能真 实反映出杆菌肽及其制剂的抗菌活性，该方法在该药品及其制剂的生产和质量 控制中具有较强的实用性和操作性。下面对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
实验材料检定菌采用美国标准菌库公开出售的表皮葡萄球菌(Staph. Epidermidis) ATCC12228，菌液浓度为6. 0%—8. 0%;培养基采用《中国药典》 2005年版二部规定的由中国药品生物制品检定所公开出售的III号pH二7.0 — 7.2的抗生素检定用培养基，灭菌缓冲液为pH=6.0的磷酸盐缓冲液，其配制 方法为取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115 。C灭菌30分钟，备用；试验过程(1)标准品溶液的制备l (一剂量法)精密称取杆菌肽标准品2. 5mg，置 25ml量瓶中，加O. 1M盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌 肽100ug的溶液的贮备液；精密量取上述贮备液5ml，置50ml量瓶中，用灭菌 缓冲液稀释至刻度，制成每lml含杆菌肽lOiig的溶液的中间溶液。分别取此溶 液1.0ml、 2. Oml、 4. Oml、 6.0ml和8.0ml，置100ml容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为标准品系列剂量溶液；制成杆菌肽标准品浓度为0.1ug/ml、 0.2ug/ml、 0.4ug/ml、 0.6ug/ml、 0. 8ug/ml共5组标准品系列剂量溶液。最好 将杆菌肽标准品浓度制成为O. 256ug/ml、 0. 32ug/ml、 0. 40ug/ml、 0. 50ug/ml、 0. 625ug/ml共5组标准品系列剂量溶液，以获取更佳的检测结果。标准品溶液的制备2 (二剂量法)精密称取杆菌肽标准品2. 5mg,置25ml 量瓶中，加0. 1M盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌肽lOOug的溶液的贮备液；精密量取上述贮备液5ml，置25ml量瓶中，用灭菌缓冲液稀 释至刻度，制成每lml含杆菌肽20ug的溶液的中间溶液。分别取此溶液2. Ornl， 置100ml容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为标准品高剂量溶液；置200ml 容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为标准品低剂量溶液；制成杆菌肽标准品 浓度为0. 40ug/ml标准品高剂量溶液和0. 20ug/ml的标准品低剂量溶液。标准品溶液的制备3 (三剂量法)精密称取杆菌肽标准品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加0. 1M盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌肽100ug 的溶液的贮备液；精密量取上述贮备液5ml，置50ml量瓶中，用灭菌缓冲液稀 释至刻度，制成每lml含杆菌肽10ug的溶液的中间溶液。分别取此溶液3. 6ml、 3.0ml、 2.4ml，分置100ml容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度分别作为标准品 高剂量溶液、中剂量溶液、低剂量溶液；制成杆菌肽标准品浓度分别为 0.24ug/ml、 0.30ug/ml、 0. 36ug/ml的标准品低剂量溶液、标准品中剂量溶液 和标准品高剂量溶液(2)供试品溶液的制备1 (一剂量法)精密称取杆菌肽样品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌肽100ug的溶液的 贮备液；精密量取上述贮备液5ml，置50ml量瓶中，用灭菌缓冲液稀释至刻度， 制成每lml含杆菌肽10ug的溶液的中间溶液。分别取此溶液4.0ml，置100ml 容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为供试品溶液；供试品溶液的制备2 (二剂量法)精密称取杆菌肽样品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌肽10Gug的溶液的 贮备液；精密量取上述贮备液5ml，置25ml量瓶中，用灭菌缓冲液稀释至刻度， 制成每lml含杆菌肽10ug的溶液的中间溶液。分别取此溶液2.0ml，置100ml 容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为供试品高剂量溶液；置200ml容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度作为供试品低剂量溶液；供试品溶液的制备3 (三剂量法)精密称取杆菌肽样品2. 5mg，置25ml量 瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每lml含杆菌肽100ug的溶液的贮 备液；精密量取上述贮备液5ml，置50ml量瓶中，用灭菌缓冲液稀释至刻度， 制成每lml含杆菌肽10ug的溶液的中间溶液。分别取此溶液3. 6ml、 3. Oml、 2. 4ml，分置100ml容量瓶中加灭菌缓冲液稀释至刻度分别作为标准品高剂量溶 液、中剂量溶液、低剂量溶液；(3) 试验菌悬液的制备取试验菌表皮葡萄球菌斜面培养物，接种于营 养琼脂培养基中，置35 — 37"C培养16 — 18小时后，用无菌0.9%氯化钠溶液洗 下菌苔，并加无菌O. 9%氯化钠溶液稀释，使得其在580nm波长处的吸光度为1. 0。(4) 操作方法 一剂量法6个浓度组，二剂量法4个浓度组，三剂量法6 个浓度组，每一浓度组作3 — 5组测定，最好作5组测定，以减少误差。在每组 测定中，在各试验管内精密加入各含表皮葡萄球菌(580nmA^.0， 6. 0%—8. 0%) 的试验菌悬液9. 0ml，再分别精密加入各浓度的标准品或供试品溶液各1. 0ml。 在37t:培养3—4小时，用比浊法测量仪在线测定，在530nm处测定各管的吸 光度。同时另取2支试验管各加入pH6. 0的磷酸盐缓冲液1. Oml后， 一支加入 培养基液9. Oml，作为同条件培养的溶液的空白；另一支加入试验菌悬液9. Oml，作为同条件培养的阳性对照。(5 )在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂的
权利要求
1. 一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征在于该方法步骤为(1)、标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2.5mg，用0.1M盐酸溶液定容至25ml，制成标准品贮备液；取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度在0.1ug/ml-0.8ug/ml之间的3-5组溶液，制成标准品系列剂量溶液，其中标准品系列剂量溶液的浓度中含有0.4ug/ml的溶液，其它溶液浓度分散在0.4ug/ml两边；(2)、供试品溶液的制备称取杆菌肽样品2.5mg，用水定容至25ml量瓶中，制成样品贮备液；取上述样品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成样品中间溶液；取样品中间溶液4.0ml，用灭菌缓冲液定容至l00ml，制成供试品溶液；(3)、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中培养，稀释后制成试验菌悬液；(4)、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成4-6个浓度组，取对应组数的试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的标准品或供试品溶液各1.0ml；在37℃培养3h-4h，用比浊法测量仪在线测定各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH＝6.0的磷酸盐缓冲液1.0ml和抗生素微生物检定用培养基液体9.0ml，作为同条件培养的溶液的空白；另一支加入pH＝6.0的磷酸盐缓冲液1.0ml和试验菌悬液9.0ml，作为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3-5组测定；(5)、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂的含量。
2、 根据权利要求1所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征 在于试验菌悬液用下述方法制备取试验菌表皮葡萄球菌斜面培养物，接种于营养琼脂培养基中，置35'C-37。C培养16h-18h后，用无菌0. 9%氯化钠溶液洗 下菌苔，并加无菌O. 9Q/。氯化钠溶液稀释，使得其在580nm波长处的吸光度为1. 0。
3、 根据权利要求1或2所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其 特征用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度为0. lug/ml、 0.2ug/ml、 0.4ug/ml、 0.6ug/ml、 0. 8ug/ml共5组标准品系列剂量溶液。
4、 根据权利要求1或2所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其 特征用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌肽标准品浓度为0. 256ug/ml、 0. 32ug/ml、 0.40ug/ml、 0. 50ug/ml、 0. 625ug/ml共5组标准品系列剂量溶液。
5、 一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征在于该方法步骤为 (1)、标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2.5mg，用O. 1M盐酸定容至25ml，制成标准品贮备液；量取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液稀定容 至25ml量瓶中，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成 杆菌肽标准品浓度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之间的2组溶液，制成标准品高剂量 溶液和标准品低剂量溶液；(2)、供试品溶液的制备称取杆菌肽样品2.5mg，用水定容至25ml， 制成样品的贮备液；量取上述贮备液5ml，定容至25ml，制成样品中间溶液； 用灭菌缓冲液稀释样品中间溶液，制成与上述标准品溶液浓度一致的供试品高 剂量溶液和供试品低剂量溶液； (3) 、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中 培养，稀释后制成试验菌悬液；(4) 、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成4个浓度组，取6个试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9.0ml，再分别加入各浓度的 标准品或供试品溶液各l.Oml;在37"C培养3h-4h，用比浊法测量仪在线测定 各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓 冲液1. Oml和抗生素微生物检定用培养基液体9. Oml，作为同条件培养的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓冲液1. Oml和试验菌悬液9. Oml，作 为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3 — 5组测定；(5)、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂 的含量。
6、 根据权利要求5所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征 在于试验菌悬液用下述方法制备取试验菌表皮葡萄球菌斜面培养物，接种于 营养琼脂培养基中，置35。C-37。C培养16h-18h后，用无菌0. 9%氯化钠溶液洗 下菌苔，并加无菌O. 996氯化钠溶液稀释，使得其在580mn波长处的吸光度为1.0。
7、 根据权利要求5或6所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其 特征在于在标准品溶液的制备过程中，用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成 杆菌肽标准品浓度为0. 40 ug/ml标准品高剂量溶液和0. 2ug/ml的标准品低剂 量溶液；供试品溶液高、低剂量溶液的浓度与标准品高低剂量溶液的浓度相同。
8、 一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征在于该方法步骤为 (1)、标准品溶液的制备称取杆菌肽标准品2. 5mg,用O. 1M盐酸溶液定容至25ml，制成标准品贮备液；量取上述标准品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定 容至50ml，制成标准品中间溶液；用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释成杆菌 肽标准品浓度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之间的3组溶液，制成标准品高剂量溶液、 标准品中剂量溶液和标准品低剂量溶液；(2)、供试品溶液的制备称取杆菌肽样品2. 5mg，加水定容至25ml，制成样品贮备液；量取样品贮备液5ml，用灭菌缓冲液定容至50ml，制成样品中 间溶液；用灭菌缓冲液稀释样品中间溶液，制成与上述标准品溶液浓度相同的 供试品高剂量溶液、供试品中剂量溶液和供试品低剂量溶液；(3) 、试验菌悬液的制备取表皮葡萄球菌斜面培养物，在细菌培养基中 培养，稀释后制成试验菌悬液；(4) 、含量测定上述标准品系列剂量溶液和供试品溶液组成6个浓度组， 取6个试验管，在各试验管内均加入试验菌悬液9. Oml，再分别加入各浓度的 标准品或供试品溶液各l.Oml;在37'C培养3h-4h，用比浊法测貴仪在线测定 各管在530nm处的吸光度；取2支试验管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓 冲液1. Oml和抗生素微生物检定用培养基液体9. Oml，作为同条件培养的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸盐缓冲液1. Oml和试验菌悬液9. Oml，作 为同条件培养的阳性对照；以重复以上操作，作3 — 5组测定；(5) 、在抗生素比浊法测量仪上在线测量并计算结果即得杆菌肽及其制剂 的含量。
9、 根据权利要求8所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，其特征 在于试验菌悬液用下述方法制备取试验菌表皮葡萄球菌斜面培养物，接种于 营养琼脂培养基中，置35"C-37X:培养16h-18h后，用无菌0. 9%氯化钠溶液洗 下菌苔，并加无菌O. 9y。氯化钠溶液稀释，使得其在580nm波长处的吸光度为1. 0。
10、 根据权利要求8或9所述的浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法， 其特征在于在标准品溶液的制备过程中，用灭菌缓冲液将标准品中间溶液稀释 成杆菌肽标准品浓度分别为0.24ug/ml、 0.30ug/ml、 0. 36ug/ml的标准品低剂 量溶液、标准品中剂量溶液和标准品高剂量溶液；供试品高剂量溶液、供试品 中剂量溶液和供试品低剂量溶液的浓度分别与标准品高剂量溶液、标准品中剂匱溶液和标准品剂量低溶液的浓度相同。
全文摘要
本发明公开了一种浊度法测定杆菌肽及其制剂含量的方法，该方法含有标准品溶液的制备、供试品溶液的制备、试验菌悬液的制备、含量测定等步骤。采用本发明的抗生素微生物检定法-多剂量浊度法测定杆菌肽及其制剂的含量不但试验方法准确、有效、成本低廉，而且试验结果能真实反映出杆菌肽及其制剂的抗菌活性，该方法在该药品及其制剂的生产和质量控制中具有较强的实用性和操作性。
文档编号G01N33/68GK101271117SQ200810054939
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月9日 优先权日2008年5月9日
发明者姜建国, 张西如, 王茉莉, 彬 韩, 高燕霞 申请人:高燕霞
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