专利名称：农药西维因快速检测用试纸条及其制作方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域；涉及有机合成，免疫化学，生物化学及物化测试等技术；主要应用在农药残留快速免疫分析方面。
背景技术：
西维因(亦称甲萘威)是氨基甲酸酯类农药的代表性商品。在我国西维因可用于141种作物，防治565种害虫，是目前注册范围最广的杀虫剂。西维因被广泛应用于蔬菜、棉花、大田粮食作物，在果树上甲萘威被用作疏花剂，在水产养殖中用于鱼塘有害生物的防除。由于西维因在我国使用广泛，我国许多农产品中存在西维因残留。随着农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应，日益受到人们关注和担忧。为此，对农药残留的限制也因此越来越严格，并且对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面，都提出新的要求和更高的标准。我国对于西维因在农产品中的残留量，有较严格的检测标准。按照GB 5009.21对粮、油、菜中甲萘威残留量的规定粮食≤5.0mg/kg，蔬菜≤2.0mg/kg，水果≤2.5mg/kg，食用油≤0.5mg/kg，烟草≤1.0mg/kg。
然而，由于分子量小于1000dolton(道尔顿)的小分子有毒化学品，如农药及其代谢产物，其传统的残留分析方法，主要是依靠气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段。该传统的理化分析方法，繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，难以满足实际分析的需要，因此迫切要求发展简便、快速、灵敏的分析技术。
1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清，自此免疫分析技术被引入农药残留分折领域。免疫分析技由于具有快速、简便、灵敏的特点而成为一种最有发展和应用潜力的分析技术之一，受到广泛的重视。
基于抗原抗体免疫反应检测小分子化和物的分析技术，目前多采用酶联免疫分析(ELISA)。利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。80年代以来发展起来的农药ELISA和简易酶免疫EIA技术，使农药残留分析在方法上获得更大的生命力；对使用快速分析样本基质过于复杂，用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。
酶联免疫检测技术可以用于定量和定性检测。目前广泛使用的各种农药残留实验室酶联免疫快速检测技术和快速检测试剂盒基本上都是定量检测，而试纸条技术属于定性检测技术。试纸条与试剂盒相比较具有更加易于携带、检测更加迅速。在实际检测过程中，特别是现场快速检测，并不一定需要对每个样品都获得定量数据而只需要定性的判别出某个样品是否含有某种农药，含量是否超标既可以。因此只需要几分钟或十几分钟就可以获得结果的快速检测试纸条是最为合适的检测工具。目前市售的商品化试纸条绝大多数是采用胶体金技术，这种试纸条生产技术复杂，成本高因而价格一般比较昂贵，而且胶体金技术在大分子(如蛋白质)检测方面有着技术性能较为出色，但是在小分子检测上还不能很好的应用，在检测精确度、稳定性方面还需要改进，因此目前我们急需要一种性能稳定、价格低廉的小分子物质免疫快速检测试纸条技术和相关产品。
发明内容
需要解决的问题针对上述问题，本发明的目的是，填补当前尚未有农药西维因快速检测试纸条的空白。提供一种简易、快速、抗体特异性好、检测灵敏度高的现场定性检测试纸条和方法。
技术方案本发明利用醋酸纤维膜作为固相载体，将抗体在膜上进行固定化处理，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性、定量地检测样本中超微量西维因。该技术研究的关键是抗体的固定化处理技术和固相表面免疫反应技术。
农药西维因快速检测试纸条，它是浸有农药西维因抗体的条状固相载体膜；其中固相载体膜，是经浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡预处理的醋酸纤维膜，农药西维因抗体推荐采用200410020332.2号专利中的西维因抗体，其抗体具有特异性好，检测灵敏度高等特点，其抗体浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体。该检测试纸条包括插入式快速检测试纸条和垂直流过式快速检测试纸条两种，其规格分别为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm和1.5cm×1.0cm。
农药西维因快速检测试纸条的制作方法，是将西维因抗体，经过点样、固定、封闭、冲洗工序固定到经过预处理的固相载体膜上。
其具体做法如下方法一·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出紧贴于用双蒸水润湿的滤纸上，其具体做法是将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，紧贴于平滑的塑料板上，然后将用Tris缓冲液已浸泡好的固相载体膜，贴在湿润的滤纸上，确保膜与滤纸之间紧贴无气泡，避光晾干；然后剪成条状，其规格为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm，再用笔在固相载体膜上等分出3-6个点样区域，并在每个点样区的中心部位，画出直径为6-10mm的圆形反应区。
·点样用微量加样枪将50μl浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体西维因抗体，点加于上述处理好的条状固相载体膜上，且必须点于该膜圆形反应区的中心部位。需要说明的是我们推荐采用200410020332.2号专利申请中的西维因特异性抗体。
·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，再在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。
·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5-10分钟，在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，轻轻甩掉多余的水分，30℃下放置20分钟干燥，或将冲洗完后的膜冻干，于4℃下密闭保存。
通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为垂直流过式快速检测试纸条。
方法二·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出避光晾干；然后剪成条状，其规格为2.5-3.5cm×15-16cm；·点样用自动点样仪将50-100μl西维因抗体涂布在经过上述预处理的固相载体膜上，然后用小刀将该膜切割成规格为1.5cm×1.0cm小试纸条，其它同方法一。；·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。
·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5-10分钟，然后在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的PBS缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，用滤纸吸干多余的水分，30℃下放置20分钟干燥或将冲洗后的膜冻干，于4℃下密闭保存。；通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为插入式快速检测试纸条。
农药西维因快速检测试纸条在检测西维因残留中的应用，其具体做法是西维因酶标抗原与将待测样品按体积比1∶10-50混合，作为待测混合液，另取西维因酶标抗原与10％甲醇，按体积比1∶10-50混合，作为对照混合液。需要说明的是，所用的酶标抗原要与点样用的抗体匹配，推荐采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原和待测样品提取方法得到的待测样品。
·竞争反应将上述两种混合液分别垂直滴加在垂直流过式快速检测试纸条上的两个反应区中心部位，避免混合液侧流出反应区或将两条插入式西维因快速检测试纸条，分别粘贴于宽为0.5cm、长为5-10cm的两根带有双面胶的聚乙烯条上，手持聚乙烯条，分别将试纸条快速插入上述两种混合液中；待10-20分钟，完成竞争反应过程，·冲洗然后将试纸条用PBST洗涤1次，用滤纸吸干多余的水分；·显色用加样枪分别快速滴加底物液于垂直流过式快速检测试纸条上的竞争反应点处或手持聚乙烯条，将插入式西维因快速检测试纸条插入底物液中(该底物液是由1.5-3.0mg四甲基联苯胺或邻苯二胺溶于1ml的PBS中配制而得)，进行显色反应2-3分钟；·终止最后再用去离子水冲洗，终止反应；观察上述试纸条各反应点的颜色，与对照混合液的反应点相比，待测样品混合液反应点的颜色越浅，代表待测样品中西维因的浓度越高；如待测样品混合液的反应点与对照混合液的反应点试纸条颜色深浅完全相同，则代表待测样品不含西维因。
有益效果本发明提供的农药西维因快速检测试纸条，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。由于试纸条所使用的抗体特异性良好、灵敏度很高，检测极限达到1.0×109ng/ml，而且试纸条表现出良好的抗干扰能力和稳定性。通过实际比较试验，使用垂直流过式快速检测试纸条和插入式试纸条对蔬菜、水果和谷物中的西维因残留进行定性检测，表现出了良好的稳定性。
经试验验证，上述铺条和固定化处理技术措施不仅方法简便，反应步骤少，且所用的仪器设备简单，不合格试纸条低于1％，为试纸条进行大规模生产提供了很好的技术基�。梢杂行Ы档蜕杀荆诓返耐乒�、普及。
本发明提供的快速检测方法操作简便、快速，使用者所进行的操作仅是用提取液(甲醇)对待测样品进行简单的提�。恍枰鹘徊降拇恚灾教醴湃胩崛∫杭纯桑瓿扇考觳獠僮鞴讨恍�10-20分钟，检测结果可以通过肉眼直观判断，而且由于试纸条良好的抗干扰能力，检测的精确度可达90％以上，非常适合现场检测的需要。
本发明试纸条除可以用于直观定性检测外，还可以用于量化的定性检测。根据不同农产品中西维因残留的检测标准，在试纸条上可以预设不同的抗体浓度，在检测时可以根据显色区域来判定是否存在西维因残留和其残留是否超标。因此，本发明不仅具备准确的定性能力，而且也具有广泛意义上的定量能力。比较目前国内外同类技术，本发明是一个检测效率高、操作简便的酶联免疫快速检测工具，具有良好的应用前景；既有经济效益又有社会效益。
图1本发明的垂直流过式快速检测试纸条；图2本发明的插入式快速检测试纸条；图3本发明的垂直流过式快速检测试纸条检测结果；图4本发明的插入式快速检测试纸条检测结果；图5本发明试纸条抗基质干扰能力比较图；具体实施方式
实施例1(垂直流过式快速检测试纸条的制备)·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为100mmol/L，pH7.2，含0.6％的NaCl的Tris缓冲液浸泡30分钟后，取出紧贴于用双蒸水润湿的滤纸上，其具体做法是将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，紧贴于平滑的塑料板上，然后将用Tris缓冲液已浸泡好的固相载体膜，贴在湿润的滤纸上，确保膜与滤纸之间紧贴无气泡，避光晾干；然后剪成条状，其规格为1.8cm×4.5cm，再在固相载体膜上，用笔画平行直线，使之等分出3个点样区域，并在每个点样区的中心部位，画出直径为6mm的圆形反应区。(其中100mmol/L，pH7.2，含0.6％的NaCl Tris缓冲液是将12.1g的(三羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶解于800ml的双蒸水中，然后定溶至1L，即为100mmol/L的Tris溶液。然后吸取100ml的100mmol/L Tris溶液加入89.4ml的100mmol/L的HCl溶液即可配制成100mmol/L，pH7.2 Tris缓冲液。再在该溶液中加入0.6g的氯化钠，即可得到100mmol/L，pH7.2，含0.6％的NaCl Tris缓冲液。)
·点样选取200410020332.2号专利申请中的西维因特异性抗体(抗体与磷酸缓冲液的体积比为1∶2500000)，用微量加样枪点加于上述处理好的条状固相载体膜上，每点加样体积为50μl，且必须垂直点于该膜圆形反应区的中心部位，避免侧流出反应区外。
·固定点样完后，先在室温下固定5分钟，再在30℃的恒温箱中固定55分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。
·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中10分钟，在30℃的恒温箱中封闭10分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的磷酸缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，轻轻甩掉多余的水分，然后将冲洗后的膜冻干，于4℃下密封闭保存。
通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为垂直流过式快速检测试纸条，如图1所示。在图1中平行竖线将垂直流过式快速检测试纸条平分为3个点样区，圆内部分即为反应区。
实施例2(插入式快速检测试纸条制备)·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为100mmol/L，pH7.2，含1.0％的NaCl的Tris缓冲液(将12.1g的(三羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶解于800ml的双蒸水中，然后定溶至1L，即为100mmol/L的Tris溶液。然后吸取100ml的100mmol/L Tris溶液加入89.4ml的100mmol/L的HCl溶液即可配制成100mmol/L，pH7.2 Tris缓冲液。再在该溶液中加入1.0g的氯化钠，即可得到100mmol/L，pH7.2，含1.0％的NaClTris缓冲液。)浸泡15分钟后，取出避光晾干；然后剪成条状，其规格为2.5cm×15cm；·点样用自动点样仪将抗体(选取200410020332.2号专利申请中的西维因特异性抗体，抗体与磷酸缓冲液的体积比为1∶250000)，涂布在经过处理的2.5cm×15cm固相载体膜上，点样完后，将膜用小刀切割成小条形，其规格为1.5cm×1.0cm。
·固定先在室温下固定10分钟，然后在30℃恒温箱中固定45min。
·封闭将切割的试纸条浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5分钟，30℃恒温箱中20min。
·冲洗用PBST冲洗三次封闭完的试纸条，用滤纸吸干多余的水分，冻干后将小试纸条粘贴于带有双面胶(0.5cm宽、8cm长)的透明聚乙烯条上，于4℃环境密闭保存。其它同实施例1。
通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作。该方法所制作的试纸条，为插入式快速检测试纸条，如图2所示。
实施例3(垂直流过式快速检测试纸条的制备)·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为100mmol/L pH7.2，含0.6％的NaCl的Tris缓冲液浸泡30分钟后，取出紧贴于用双蒸水润湿的滤纸上，其具体做法是将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，紧贴于平滑的塑料板上，然后将用Tris缓冲液已浸泡好的固相载体膜，贴在湿润的滤纸上，确保膜与滤纸之间紧贴无气泡，避光晾干；然后剪成条状，其规格为2.0cm×8.50cm，再在固相载体膜上，用笔画平行直线，使之等分出6个点样区域，并在每个点样区的中心部位，画出直径为10mm的圆形反应区。
·点样选取200410020332.2号专利申请中的西维因特异性抗体(抗体与磷酸缓冲液的体积比为1∶3500000)，用微量加样枪点加于上述处理好的条状固相载体膜上，每点加样体积为50μl，且必须垂直点于该膜圆形反应区的中心部位，避免侧流出反应区外。
其余步骤同实施例1。
实施例4(应用实施例)本实施例是，使用垂直流过式快速检测试纸条(每条试纸标有4个点样区域)，检测油菜中西维因含量的方法。具体做法是·取样在菜市场随机购买油菜2.5千克，将油菜的叶和茎分别用剪刀剪成0.25cm；×0.2cm；左右的碎片，分别称取油菜茎和叶样品各5克。
·提取将样品分别与100％甲醇的按照质量比1∶5混合，用匀浆机粉碎匀浆(即待测样品提取方法采用200410020332.2号专利申请中的方法)。匀浆静置20分钟，小心吸取上清液，用0.5％鱼皮胶-磷酸缓冲液稀释10倍，此时甲醇的最终浓度为10％。
·配制待测样品混合液、空白混合液和标准对照混合液分别吸取稀释好的上清液2000μl放入5ml的离心管中，然后加入40μl酶标-抗原(Ag-HRP)作为待测样品混合液。吸取10％甲醇2000μl和40μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为空白混合液。吸取2mg/L的西维因标准样2000μl和40μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为标准对照混合液。其中酶标-抗原采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原。
·加样竞争用微量加样枪分别吸取待测样品混合液和空白对照混合液、标准对照混合液140μl，分别加样于试纸条的反应区中心位置，使其垂直流过包被好的抗体膜，待测样品与酶标-抗原竞争与抗体的结合。
·冲洗待液体完全通过膜后，静置15分钟，再用PBST洗涤三次，用滤纸吸干多余的水分。
·显色在反应区加底物液(2mg四甲基联苯胺溶于2mlPBS缓冲液后加入2μl双氧水)，进行显色反应2-3分钟，最后用去离子水冲洗终止反应。检测结果见附图3。图中A为空白对照混合液的显色反应区，B为油菜茎待测样品混合液的显色反应区，C为待测样品油菜叶片的混合液显色反应区，D为2mg/L西维因标准样对照混合液的反应区。观察颜色，颜色越浅，代表西维因的浓度越高。可以看出，B、C反应区待测样品的颜色比空白反应区A要浅，比标准反应区D样要深，说明油菜样品中含有西维因，但是没有超标(2mg/L为蔬菜西维因残留标准)。
实施例5(应用实施例)本实施例为，使用插入式快速检测试纸条检测油菜样品中西维因含量的方法。具体做法是·取样在菜市场随机购买油菜2.5千克，将油菜的叶和茎分别用剪刀剪成0.25×0.2cm；的碎片，分别称取油菜茎和叶样品各5克。
·提取将样品分别与100％甲醇的按照质量比1∶5混合，用匀浆机粉碎匀浆(即待测样品提取方法采用200410020332.2号专利申请中的方法)。匀浆静置20分钟，小心吸取上清液，用0.5％鱼皮胶-磷酸缓冲液稀释10倍，此时甲醇的最终浓度为10％。
·配制待测样品混合液、空白混合液和标准对照混合液分别吸取稀释好的上清液2000μl放入5ml的离心管中，然后加入40μl酶标-抗原(Ag-HRP)作为待测样品混合液。吸取10％甲醇2000μl和40μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为空白混合液。吸取2mg/L的西维因标准样2000μl和40μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为标准对照混合液。其中酶标-抗原采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原。
·加样竞争手持粘有试纸条的透明聚乙烯条，将试纸条分别插入待测样品混合液和空白对照混合液中，进行竞争反应10min。
·冲洗用PBST冲洗三次，轻轻甩干多余的水分。
·显色再将竞争反应后的试纸条，快速插入底物液(2mg四甲基联苯胺溶于2mlPBS缓冲液后加入2μl双氧水)中，进行显色反应2-3分钟。
·终止最后用去离子水冲洗终止反应，即可终止显色反应。
观察插入式快速检测试纸条颜色变化，颜色越深，代表西维因的量越少。检测结果见附图4。图中E为插入空白对照混合液的试纸条，F、G分别为插入油菜茎和油菜叶片待测样品混合液的试纸条，H为插入西维因标准样(2mg/L为蔬菜西维因残留标准)混合液的试纸条。可以看出，样品F、G的试纸条颜色比空白E试纸条颜色要浅，比插入标准样H的试纸条颜色要深，说明该油菜样品中含有西维因，但是没有超标(2mg/L为蔬菜西维因残留标准)。
实施例6不同基质对插入式快速检测试纸条检测稳定性的影响基质干扰是指待测样品中的不同物质对检测结果的影响。本实施例选取了不同基质，观察其检测结果，验证试纸条的抗基质干扰能力。
·取样分别取经过净化的待测样品油菜、苹果和小麦各5克。待测样品预先经过检测，确证不含西维因。
·匀浆将样品与100％甲醇的按照质量比1∶5混合，用匀浆机粉碎匀浆(即待测样品提取方法采用200410020332.2号专利申请中的方法)。匀浆静置20分钟，小心吸取上清液，用0.5％鱼皮胶-磷酸缓冲液分别稀释10、20、100倍。此时菜汁甲醇溶液中甲醇的最终浓度为10％、5％和1％。
·西维因标准样的配制分别用上述10％、5％和1％的菜汁甲醇溶液，配制成10、50、100ppb的西维因标准样品(即每升菜汁甲醇溶液中分别加入10ng、50ng、100ng99.5％的西维因)·配制待测样品混合液分别吸取西维因标准样品2000μl放入5ml的离心管中，然后加入40μl酶标-抗原(Ag-HRP)。其中酶标-抗原采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原。
·加样竞争将试纸条分别插入待测样品、混合液和空白对照混合液中竞争反应10min。
·冲洗用PBST冲洗三次，轻轻甩干多余的水分。
·显色再将上述竞争反应后的试纸条，快速插入底物液(2mg四甲基联苯胺溶于2mlPBS缓冲液后加入2μl双氧水)中，进行显色反应2-3分钟。
·终止最后用去离子水冲洗终止反应。
检测结果见附图5。在图5中I、J和K分别为油菜基质、苹果基质、小麦基质的插入式试纸条的显色情况，观察颜色，颜色越相近，说明试纸条抗基质干扰能力越强。从图中可以看出，三种基质试纸条的检测颜色非常相近，肉眼难以分辨出差异，说明在相同条件下，不同基质不影响西维因的检测结果，从而证明本发明快速检测试纸条的抗干扰能力非�：�。
实施例7(应用实施例)·取样、提取步骤与实施例4相同·配制待测样品混合液、空白混合液和标准对照混合液分别吸取稀释好的上清液2000μl放入5ml的离心管中，然后加入80μl酶标-抗原(Ag-HRP)作为待测样品混合液。吸取10％甲醇2000μl和80μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为空白混合液。吸取2mg/L的西维因标准样2000μl和80μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为标准对照混合液。其中酶标-抗原采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原。
·其余步骤与实施例4相同。
实施例8(应用实施例)·取样、提取步骤与实施例5相同·配制待测样品混合液、空白混合液和标准对照混合液分别吸取稀释好的上清液2000μl放入5ml的离心管中，然后加入100μl酶标-抗原(Ag-HRP)作为待测样品混合液。吸取10％甲醇2000μl和100μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为空白混合液。吸取2mg/L的西维因标准样2000μl和100μl酶标-抗原(Ag-HRP)放入干净的5ml离心管中作为标准对照混合液。其中酶标-抗原采用200410020332.2号专利申请中的西维因酶标抗原。
其余步骤与实施例5相同。
权利要求
1.农药西维因快速检测试纸条，其特征在于它是浸有农药西维因抗体的条状固相载体膜，其中固相载体膜是经过40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡预处理的醋酸纤维膜。
2.按照权利要求1所述的农药西维因快速检测试纸条，其特征在于农药西维因抗体采用200410020332.2号专利申请中的西维因抗体，其抗体浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体。
3.按照权利要求1所述的农药西维因快速检测试纸条，其特征在于它分为垂直流过式快速检测试纸条和插入式快速检测试纸条两种，其规格分别为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm或1.5cm×1.0cm。
4.权利要求1所述的农药西维因快速检测试纸条的制作方法，其特征在于是将西维因抗体经过点样、固定、封闭、冲洗工序固定到经过预处理的固相载体膜上，其具体做法如下·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出紧贴于用双蒸水润湿的滤纸上，其具体做法是将滤纸用双蒸水润湿后，甩掉多余的水分，紧贴于平滑的塑料板上，然后将用Tris缓冲液已浸泡好的固相载体膜，贴在湿润的滤纸上，膜与滤纸之间紧贴，避光晾干；然后剪成条状，其规格为1.8-2.2cm×4.5-9.0cm，再用笔在固相载体膜上等分出3-6个点样区域，并在每个点样区的中心部位，画出直径为6-10mm的圆形反应区。·点样用微量加样枪将50μl西维因抗体，点加于上述处理好的条状固相载体膜上，且必须点于该膜圆形反应区的中心部位；·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，再在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。·封闭将固定好的抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液(PBS)溶液中5-10分钟，在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的磷酸缓冲液(PBS)即PBST洗涤液冲洗三次，轻轻甩掉多余的水分，然后30℃下放置20分钟干燥或将冲洗后的膜冻干，于4℃下密闭保存。通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作，该方法所制作的试纸条为垂直流过式快速检测试纸条。
5.权利要求1所述的农药西维因快速检测试纸条的制作方法，其特征在于是将西维因抗体经过点样、固定、封闭、冲洗工序固定到经过预处理的固相载体膜上，其具体做法如下·膜的预处理将醋酸纤维膜用浓度为40-100mmol/L，pH7.0-7.2，含0.6-1.0％的NaCl的Tris缓冲液浸泡10-30分钟后，取出避光晾干；然后剪成条状，其规格为2.5-3.5cm×15-16cm；·点样用自动点样仪将50μl西维因抗体涂布在经过上述预处理的固相载体膜上，然后将该膜切割成规格为1.5cm×1.0cm小试纸条；·固定点样完后，先在室温下固定5-10分钟，再在30℃的恒温箱中固定40-60分钟，让抗体在固相载体膜上充分固定。·封闭将固定好抗体的固相载体膜浸泡在1.5％的白明胶磷酸缓冲液溶液中5-10分钟，在30℃的恒温箱中封闭10-20分钟；·冲洗将封闭好的固相载体膜，用含0.5ml/L吐温-20的磷酸缓冲液(PBS)缓冲液即PBST洗涤液冲洗三次，用滤纸吸干多余的水分，30℃下放置20分钟干燥或将冲洗后的膜冻干，于4℃下密闭保存。通过以上工序即完成了农药西维因快速检测试纸条的制作，该方法所制作的试纸条为插入式快速检测试纸条。
6.按照权利要求4或5所述的农药西维因快速检测试纸条的制作方法，其特征在于农药西维因抗体采用200410020332.2号专利申请中的西维因抗体，其抗体浓度为1∶200000-400000的高特异性农药西维因抗体；
7.权利要求1所述的农药西维因快速检测试纸条在检测待测样品农药西维因中的应用，其特征在于，是将西维因酶标抗原与待测样品按体积比1∶10-50混合，作为待测样品混合液，另取西维因酶标抗原与10％甲醇，按体积比1∶10-50混合，作为对照混合液，所用的酶标抗原要与点样用的抗体匹配，具体做法是·竞争反应将上述两种混合液分别垂直滴加在垂直流过式快速检测试纸条上的两个反应区中心部位，避免混合液侧流出反应区或将两条插入式西维因快速检测试纸条，分别粘贴于宽为0.5cm、长为5-10cm的两根带有双面胶的聚乙烯条上，再分别将试纸条插入上述两种混合液中；待10-20分钟，完成竞争反应过程；冲洗然后将试纸条用PBST洗涤1次，用滤纸吸干多余的水分；显色用加样枪分别快速滴加底物液在垂直流过式试纸条上的竞争反应点处或将插入式试纸条插入底物液中，进行显色反应2-3分钟，该底物液是由1.5-3.0mg四甲基联苯胺或联苯二胺(OPD)溶于1ml的磷酸缓冲液(PBS)中配制而得；终止最后再用去离子水冲洗，终止反应；观察上述试纸条各反应点的颜色，与对照混合液的反应点相比，待测样品反应点的颜色越浅，代表西维因的浓度越高。
8.按照权利要求7所述的农药西维因快速检测试纸条的应用，其特征在于，点样所用的西维因抗体、酶标抗原以及待测样品的提取方法分别采用中国200410020332.2号专利申请中的西维因抗体、酶标抗原和待测样品提取方法得到的。
全文摘要
农药西维因快速检测用试纸条及其制作方法与应用，涉及西维因特异性抗体、及其在固相载体膜上的固定化技术、固相载体膜的处理技术以及在样品检测中的应用。它克服了目前试纸条产品，抗体固定化技术繁琐复杂、成本较高，分析灵敏度较低、精确度和准确度较差，结果不稳定等问题。本发明试纸条为浸有农药西维因抗体的经特殊处理的醋酸纤维膜。它是以高特异性西维因抗体为免疫检测抗体，采用直接竞争酶联免疫检测法，通过溶液流过、浸沾的手段，使抗体、待测样品和酶标抗原在短时间内完成反应，获得检测结果，具有良好的抗干扰能力，检测精度高。本发明还提供了简便、快速、灵敏、准确的试纸条分析技术，具有良好的应用前景，既有经济效益又有社会效益。
文档编号G01N33/50GK1588077SQ20041007194
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月15日 优先权日2004年9月15日
发明者王硕, 王俊平, 张燕 申请人:天津科技大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
