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专利名称：对疾病严重度分级和检测抑郁治疗的多个生物标记组的制作方法
技术领域：
本发明涉及在抑郁个体中对疾病严重度分级和监控治疗有效性的材料和方法。2.背景信息神经精神疾病在“劳力丧失的寿命年”(YLD)方面世界领先，占总YLD的大约30%。仅单相重度抑郁症(MDD)就占全球YLD的11%。包含诊断不准确、提早停止治疗和抗抑郁药剂量不足在内的数个因素，可能造成伤残持续而且治疗结果非最佳。例如，近半数接受抗抑 郁药处方的门诊病人在第I个月里即中止了治疗。取决于所研究的人群和所用治疗药剂，头三个月治疗内的停用率可达68%。对诊断和治疗有效性监控的临床评价和患者自我症状报告的传统依赖经常阻碍对MDD和其他神经精神疾病患者的提供最佳治疗的努力。所述方法主观并且经常不可靠。发明概述对诊断抑郁和建立治疗计划的临床评价和患者面谈的传统依赖能与很多患者治疗结果非最佳相关。检测个体基础上疾病状况的能力可精确评价对象个体疾病状态。但是，需要诊断临床病症和评价对象疾病状态或治疗反应的可靠方法。因此，临床医生和其他精神卫生专业人员有利地使用基于生理学测量的量化诊断参数以提供或取代临床评价和患者面谈，用于诊断抑郁、精确对疾病严重度分级和监控患者治疗反应。本文部分基于所述量化诊断参数的确定和诊断抑郁症、对疾病严重度分级和监控对象治疗反应的方法发展。如本文所述，本文通过发展算法、评价多个参数和使用算法以测定一组量化诊断评分来提供建立抑郁的基线诊断的材料和方法。本文所述方法不同于一些更传统方法，在构建算法与分析单一标记或标记组中使用生物标记。如本文所提供，可以使用算法来获得反映特定疾病状况、预后和/或治疗反应的单一值。可以使用基于高度复用微阵列的免疫学工具来同时测定多个参数。所述方式中，所有结果能同时从相同样品和在相同情况下得出。通过广泛可用工具如分层聚类、自组织映射、以及监督分类算法(例如，支持向量机、k_最近邻法(k-nearest neighbors)以及神经网络)，可以应用高级模式识别技术。后一组分析方法看似对本文所提供材料和方法的临床应用有实质性价值。一方面，本文涉及对对象疾病严重度分级方法(例如，体外方法)，包括(a)提供与轻度、中度和严重抑郁状态相关的多个各个分析物的数值，其中每个数值对应于对象生物样品中各分析物水平；(b)以对每个分析物特异的方式单独加权每个数值，以获得每个分析物的加权值；(c)根据包含每个加权值的方程测定结果值；(d)比较所述结果值与获自正常对象和有轻度、中度及严重抑郁状态对象的对照结果值；其中所述对照结果值测定的方式与所述结果值相当4P(e)如果所述结果值在没有抑郁、轻度抑郁、中度抑郁或严重抑郁的对照值预定范围内，分别将对象分类为没有抑郁、轻度抑郁、中度抑郁或严重抑郁。
抑郁能与MDD相关。算法能用于计算MDD诊断评分，其可用于支持轻度、中度或严重MDD状态的分级。多个分析物能包含一个或多个炎症生物标记，一个或多个神经营养生物标记，一个或多个代谢生物标记和/或一个或多个下丘脑-垂体-肾上腺轴生物标记。多个分析物能包含选自下组的两个或多个分析物酰基化刺激蛋白、脂连蛋白、促肾上腺皮质激素、青蒿琥酯(artemin)、α -I抗胰蛋白酶(AlAT)、α -2-巨球蛋白、载脂蛋白C3 (ApoC3)、精氨酸加压素、脑源性神经营养因子(BDNF)、促肾上腺皮质激素释放激素、C反应蛋白、CD40配体、皮质醇、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子、白介素-I、白介素-I受体激动剂、白介素_6、白介素-10、白介素-13、白介素-18、瘦素、巨噬细胞炎性蛋白-I α、髓过氧化物酶(MPO)、神经营养蛋白3、胰多肽、纤溶酶原激活物抑制剂-I、促乳激素、RANTES、抵抗素、络丝蛋白(reelin)、S100B、可溶性肿瘤坏死因子α、可溶性肿瘤坏死因子α受体II(sTNFR2)、促甲状腺激素、肿瘤坏死因子α或其组合。例如，多个分析物能包含皮质醇、促乳激素、EGF、MPO、BDNF、抵抗素、sTNFR2、ApoC3和AlAT。生物样品可以是全血、血清、血浆、尿液或脑脊液。对象可以是人。另外，所述方法还能包含获得一个或多个生物样品的多个分析物的测量水平，并且结果值能至少部分基于测量水平。另一方面，本文涉及监控诊断有抑郁疾病对象的治疗的方法(例如体外方法)，包 括(a)提供与抑郁相关的多个各分析物的第一数值，其中每个第一数值对应于对象第一生物样品中的各分析物水平；(b)以对每个分析物特异的方式单独加权每个第一数值，以获得每个分析物的第一加权值；(c)根据包含每个第一加权值的方程测定第一 MDD评分；(d)各提供多个分析物的第二数值，其中每个第二数值对应于对象第二生物样品的各分析物水平，其中所述第二生物样品在抑郁疾病治疗后取得；(e)以对每个分析物特异的方式单独加权每个第二数值，以获得每个分析物的第二加权值，前提是加权以与步骤(b)相当的方式完成；(f)在对象治疗抑郁疾病后，使用方程测定第二 MDD评分；和(8)比较第一 MDD评分与第二 MDD评分和从一个或多个正常对象测定的对照MDD评分或MDD评分范围，并且如果第二 MDD评分比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为有效，或如果第二 MDD评分没有比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为无效。生物样品可以是全血、血清、血浆、尿液或脑脊液。所述第二 MDD值能在抑郁治疗后数天、数周或数月测定。多个分析物能选自下组(a)RANTES、PRL、BDNF, S100B、RES、TNFR、A1A、皮质醇和 EGF ； (b) RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR、A1A 和 EGF ；(c) RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR 和 AlA ；(d) S100B、PRL、BDNF、RES、TNFR 和 AlA ; (e)皮质醇、卩此、80,、1 5、了,1 和六认；和(^80,、抵抗素、1,1 11和八1八。对象可以是人。一些示例中，所述方法还能包含获得多个第一或第二生物样品分析物中的一个或多个测量水平，并且相应的第一或第二 MDD评分能至少部分基于测量水平。另一方面，本文涉及监控诊断有抑郁疾病对象治疗的方法(例如体外方法)，包括(a)提供与抑郁相关的多个各分析物的第一数值，其中每个第一数值对应于对象第一生物样品的各分析物水平；(b)各提供多个分析物的第二数值，其中每个第二数据值对应于对象第二生物样品的各分析物水平，其中第二生物样品在抑郁疾病治疗后获得；(C)以对每个分析物特异的方式单独加权第一和第二数值，以获得每个分析物的加权值；(d)根据包含加权数值的方程测定监控值4P(e)比较监控评分和对照监控评分，并且如果监控评分大于或等于对照监控评分，将治疗归类为有效，或如果监控评分小于对照监控评分，将治疗归类为无效。生物样品可以是全血、血清、血浆、尿液或脑脊液。第一生物样品能从对象治疗开始前获得，和第二生物样品能从对象治疗开始后1-25天获得。所述方法还包括提供每个分析物的第三数值，其中，每个第三数值对应于对象的第三生物样品的分析物水平；以对每个分析物特异的方式单独加权第三数值，以获得每个分析物的加权值；并且根据包含第一、第二和第三加权数值的方程测定监控评分。所述多个分析物能选自下组(a)PRL、BDNF、RES、TNFRII 和 AlA ;和(b) RANTES、PRL、BDNF、SIOOB、RES、TNFR、AlA 和 EGF。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不构成限制。从下面的详述和所附权利要求很容易了解本发明的其他特征和优点。


图I是显示能发展用于评价疾病严重度或诊断或预后目的的疾病特异生物标记组所采用步骤的流程图。图2是显示能通过疾病特异生物标记组开发诊断或预后算法所采用步骤的流程图。图3是显示测定基本诊断评分的示例性方法中步骤的流程图。图4是显示使用诊断评分以诊断个体、挑选治疗选择和监控及优化治疗的示例性步骤的流程图。图5是患者抗抑郁治疗前后的血液中标记X水平的假设盒须图。图6描绘一组正常对象(实圈)和一组MDD患者(空心圈)的抑郁诊断评分(MDDSC0RE )和汉密尔顿抑郁量表(HDRS或HAM-D)评分之间的关系。图7描绘使用抗抑郁药物依地普仑(Lexapro)治疗后2和8周的患者HAM-D评分。HAM-D评分的下降指示改善。图8描绘MDD患者亚组在基线和依地普仑治疗2周后抑郁诊断评分(MDDSC0RE )的改变。图9描绘本文所公开方法的潜能以通过测定治疗2周后的MDDSC0RE 来预测治疗8周治疗的有效性。图10是显示使用算法监控MDD患者治疗结果的示例性步骤的流程图。图11描绘治疗预测原型的结果，其中在治疗头两周获得的生物标记测量用于计算监控评分，以预测治疗八周后的结果。发明详述本文部分基于通过发展算法、评价(如测量)多个参数和使用所述算法测定一组量化诊断评分来鉴定用于建立诊断或预后抑郁疾病情况的方法。可开发应用生物样品(例如血液或血浆)中多个生物标记的算法以对疾病严重度分级和鉴定疾病特异药效标记物。在一些实施方式中，可开发应用生物样品例如细胞、血清或血浆的多个生物标记的算法以对患者分级、鉴定药效标记物和监控治疗结果。如本文所使用，“生物标记物”是可作为正常生物或致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示剂而客观地加以测量和评估的一种特征。如本文所使用，“分析物”是可以在诸如免疫测定或质谱测定等分析过程中客观测量和确定的物质或化学成分。算法本文提供开发纳入多个测量参数和能用于检测定量诊断评分的算法的材料和方法。例如，可以针对任何临床病症确定用于测定个体疾病状态或治疗反应的算法。本文所提供的算法可为包含多参数的数学函数，所述参数可用例如医疗设备、临床评估得分、或生物样品的生物、化学或物理检测所量化。各数学函数可以是确定与所选临床病症相关的参数水平的加权调整表达式。使用常规统计工具(例如但不限于T检验、PCA、LDA或双向逻辑回归)对每个标记的收集数据进行单变量和多变量分析。算法能用于产生诊断值评分组。所述算法一般可以用式I的形式来表达诊断评分=f(xl, x2, x3, x4, x5, . . . xn) (I)·所述诊断评分是所述诊断或预后结果的值，“f”是任意数学函数，“n:是任意整数(例如，从I到10，000的整数)，并且XI、χ2、χ3、χ4、χ5· · · χη是“η”个参数，其为例如由医疗设备、临床评估得分、和/或生物样品(例如人类生物样品如血液、血清、血浆、尿液或脑脊液)的试验结果所确定的测量值。算法的参数可进行单独加权。这种算法的示例以式2来表达诊断评分=al*xl+a2*x2-a3*x3+a4*x4_a5*x5(2)在此^1^2^3^4和x5可以是由医疗设备、临床评估得分、和/或生物样品(例如，人类生物样品)的试验结果所确定的测量值，而al、a2、a3、a4和a5分别是xl、x2、x3、x4和x5的权重调整因子。诊断评分可以用来量化定义医疗状况或疾病或医学治疗的效果。例如，可以使用一种算法来确定诸如抑郁症等疾病的诊断评分。在这类实施方式中，可以基于式I确定抑郁程度，通式如下抑郁诊断评分=f(xl, x2, x3, x4, x5. . . xn)抑郁诊断评分是可用于测量个体的抑郁状况或严重度的量化数字，“f ”是任何数学函数，“η”可以是任何整数(例如，从I到10，000的整数)，并且xl、x2、x3、x4和χ5是“η”个参数，其为例如用医疗设备、临床评估得分、和/或生物样品(例如人类生物样品)的试验结果所确定的测量值。在更通用的形式中，可以通过将多个公式应用于特定生物标记物测量分组来生成多重诊断评分Sm，如式(3)所示诊断评分Sm=Fm(xl, · · · xn) (3)多重评分可用于例如鉴定特定类型和亚型的抑郁症和/或相关疾病。一些病例中，抑郁疾病是MDD。多重评分也可以是指示患者治疗进展或所选治疗功效的参数。抑郁症亚型的诊断评分可帮助抗抑郁药和其他药物的选择或优化。构建生物标记文库为了确定哪些参数可用于包括在诊断算法中，可以开发分析物的生物标记库，并且可评价来自该库的单独分析物以包括在特定临床病症的算法中。作为起始点，所述库可包括一般指示炎症、细胞黏附、免疫反应、或组织重塑的分析物。在一些实施方式中(例如，在初始库开发期间)，库可以包括十二个或更多标记物、一百个标记物、或数百标记物。例如，生物标记库包括数百个蛋白质分析物。在构建生物标记库时，可以添加新标记物(例如，对单独疾病状态特异的标记物和/或诸如生长因子等更一般化的标记物)。一些示例中，生物标记库能通过加入从开发研究(例如，使用不同展示方法，如同位素编码的亲和标签(ICAT)或质谱)中获得的疾病相关蛋白来精化。在此方法中，库对特定疾病状态的特异性可变得更高。向生物标记库添加新的蛋白分析物可能需要纯化的或重组的分子以及用于捕获和检测所述新分析物的适当抗体(或多种抗体)。加入基于核酸的新分析物到生物标记库可能需要鉴定特异性mRNA以及探针和检测系统以定量所述特异性RNA的表达。虽然开发单独的“新或新型”生物标记物对于开发有用的算法并不必要，但这种标记物可以包括在内。本文所述适用于多重分析物检测方法的平台技术通常是灵活的并且对添加新分析物而言是开放的。例如,Luminex多重分析系统(xMAP ;万维网上的luminexcorp. com)是灵活的并且易配置以纳入新的疾病特异分析物。 尽管本文指出多重检测系统提供与诊断、分级和监控临床病症相关分析物的稳健且可靠检测，这不排除使用能检测组中个体分析物浓度的试验(如一系列单个分析物ELISA)。生物标记组能扩展并转移到传统蛋白阵列、多重珠平台或没有标记的阵列，并且能开发算法以支持临床医生和临床研究。可以设计、开发并分析验证大约20-25个抗原的定制抗体阵列。一开始，一组大约5-10(例如，5、6、7、8、9或10)个分析物的选择可基于它们例如用于区分受影响和未影响对象或根据疾病严重度从确定样品集中分级患者的能力。然而，富集数据库(通常是在其中测量超过10个重要分析物的数据库)可增加试验算法的敏感性和特异性。除了反映炎症和免疫反应的组以外，操作其他组以进一步定义疾病状态或细分患者。通过实施例，从神经营养因子测量获得的数据能分辨神经可塑性发生变化的患者。类似地，从代谢因子测量获得的数据能分辨代谢功能改变或异常的患者，并且从下丘脑-垂体-肾上腺(HPA或HTPA)轴因子测量获得的数据能分辨神经内分泌系统改变的患者。注意到所述方法也能包含或应用于其他生物分子，包括但不限于DNA和RNA。选择个体生物标记在构建库或组时，标记物和参数可以使用多种方法中的任意一种来进行选择。构建疾病专用库或组的主要考虑可能是对参数与该疾病相关性的知识。文献检索或实验也可用来识别要包括的其他参数/标记物。许多转录因子、生长因子、激素、和其他生物分子与神经精神紊乱相关。用于选择MDD分析物或确定MDD生物标记物的参数，可选自例如由炎症生物标记物、HPA轴因子、代谢生物标记物、和神经营养因子组成的功能组，所述神经营养因子包括神经营养蛋白、胶质细胞源性神经营养因子家族配体(GFL)、和神经生成细胞因子。一些示例中，MDD生物标记可以是包含以下一个或多个分析物的组酰基化刺激蛋白(ASP)、脂连蛋白(ACRP30)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、青蒿琥酯(ARTN)、α-I抗胰蛋白酶(AlAT)、α -2-巨球蛋白(Α2Μ)、载脂蛋白C3 (apoC3)、精氨酸加压素(AVP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、C反应蛋白(CRP)、⑶40配体、皮质醇、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白介素-I (IL-I)、白介素-I受体激动剂(IL-IRA)、白介素-6 (IL-6)、白介素-10 (IL-10)、白介素-13 (IL-13)、白介素-18 (IL-18)、瘦素、巨噬细胞炎性蛋白-Ια (ΜΙΡ-1α)、髓过氧化物酶、神经营养蛋白3(ΝΤ_3)、胰多肽、纤溶酶原激活物抑制剂-I、促乳激素、RANTES、抵抗素、络丝蛋白(RELN)、S100B、可溶性肿瘤坏死因子α (TNF-α )、促甲状腺激素(TSH)、肿瘤坏死因子a (TNF- a )或其组合。一些示例中，生物标记能是参与炎症反应的因子。炎症涉及各种各样的蛋白质，且这些蛋白质中的任一种对损伤或破坏该蛋白质正常表达和功能的遗传突变都是开放的。炎症还诱导高全身水平的急性期蛋白。这些蛋白质包括C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、血清淀粉样蛋白P、血管加压素以及糖皮质激素，它们都造成一系列全身效应。炎症还涉及促炎性细胞因子和趋化因子的释放。研究表明炎症反应系统的异常功能会破坏免疫系统的反馈调节，因此导致神经精神和免疫疾病的发展。事实上，已经报道了由慢性炎症反应(例如，类风湿性关节炎)表征的若干疾病伴随着抑郁症。而且，近期的证据将炎症细胞因子水平提高与抑郁和恶病质相联，且实验显示引入细胞因子诱导人类和啮齿动物的抑郁和恶病质症 状，表明在分子水平可能有共同的病原。例如，向动物给予促炎性细胞因子(如癌症或丙型肝炎治疗中)可诱发“病态行为”，这是一种与人类的抑郁行为症状非常类似的行为改变模式。目前正评估靶向特异细胞因子分子的治疗性试剂如肿瘤坏死因子a同时药理学治疗抑郁和恶病质的潜力。总之Inf lammatory Response System (IRS) model of depression(《抑郁的炎症反应系统(IRS)模型》)，，(Mae Adv. Exp. Med. Biol. 461:25-46 (1999))提出，用作神经调节剂的促炎性细胞因子代表了在抑郁症的行为、神经内分泌和神经化学特征调节中的关键因子。在一些情况中，生物标记可为神经营养因子。神经营养因子是负责发育神经元的生长和存活和维持成熟神经元的蛋白家族。大多数神经营养因子属于三种家族之一 (I)神经营养蛋白，⑵胶质细胞源性神经营养因子家族配体(GFL)和(3)神经生成细胞因子。各家族有其自身不同的信号家族，然而引起的细胞反应常常重叠。诸如脑源性神经营养因子(BDNF)和其受体TrkB的神经营养因子是负责发育中神经元的生长和存活以及维持成熟神经细胞的蛋白。神经营养因子可促进CNS和PNS内神经元的初始生长和发育以及体内外受损神经元的再生长。另外，所述因子常由靶标组织释放以指导发育中轴突的生长。研究表明神经营养因子合成的缺陷可导致关联抑郁症中所述认知修复的海马区和前额皮质内细胞凋亡增加。在一些情况下，生物标记可为所述HPA轴因子。所述HPA轴，也称为边缘系统-下丘脑-垂体-肾上腺轴(LHPA轴)，是下丘脑(大脑的中空漏斗形部分)、垂体(位于下丘脑之下的豌豆形结构)及肾上腺(adrenal或suprarenal)(位于肾脏顶部的小型锥形器官)之间一组复杂的直接影响和反馈相互作用。这些器官之间的相互作用组成所述HPA轴，其为神经内分泌系统的主要部分,控制身体应激反应并调节很多身体过程,包含消化、免疫系统、感情和情绪、性欲、和能量储存及消耗。HPA轴生物标记物的例子包括ACTH和皮质醇。皮质醇抑制促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的分泌，导致ACTH分泌的反馈抑制。在人接触慢性应激时这一正常反馈环可能瓦解，且这可能是抑郁的根本原因。在一些情况中，生物标记可为代谢因子。代谢生物标记物是一组提供对健康和疾病状态中代谢过程认识的生物标记物。人类疾病体现在复杂的下游效应中，其影响多种生物化学途径。例如，抑郁和其他神经精神紊乱常常与代谢疾病如糖尿病相关。因此，各种代谢物和控制代谢过程的蛋白质及激素可用来诊断抑郁症如MDD、对疾病严重程度分级、和监控对象对所述抑郁症治疗的反应。如图I的流程图所述，开发疾病特异生物标记组的过程能包括两个统计学方法I)通过单变量分析测试与疾病相关的分析物分布；和2)使用多变量分析将分析物分组。一些示例中，能用单变量分析来测试与MDD相关的生物标记分布，并且用线性判别分析(LDA)或二元逻辑回归来构建算法以生成诊断评分。单变量分析在数据组中分别研究每个变量并且鉴定值的范围和集中趋势。多变量分析把变量分成非交叠、单维群。能挑选每个群的两个或多个分析物以为进一步分析设计生物标记或分析物组。选择通常是基于标记物的统计学强度和目前对疾病的生物学理解。例如，根据统计学显著性选择的分析物能进行多变量分析以鉴定能区分有临床病症如抑郁的患者与 正常人群的标记。用于确定统计显著性的方法可是本领域中常规使用的那些方法，包括，例如t_统计、卡方统计和F-统计。一些示例中，多变量分析可以是线性判别分析(LDA)，这是一种用于发现最佳区分两个或多个对象或事件种类的线性特征组合的统计方法。一些示例中，多变量分析可以是主成分分析(PCA)，这是将数据转化至新坐标系的统计方法，使得任何数据投影的最大方差位于第一坐标(称为第一主成分)，第二大方差位于第二坐标，并依此类推。PCA通过保留数据集中那些对其方差贡献最大的特征，通过保留低阶主成分而忽略高阶主成分，能用于降低数据集的维度。这种低阶成分往往含有数据的“最重要”方面。一些示例中，多变量分析可以是偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，这种统计学方法通过旋转PCA成分使得各群间获得最大间隔并且确定哪个变量区分和间隔所述群，用于最大化变量组间的分隔。如图2的流程图所示，相关生物标记物的选择无需依赖于图I所述的选择过程，虽然第一过程是有效的并且能够提供基于实验和统计学的生物标记物选择。该过程可由完全基于假设和目前可用数据选择的一组生物标记物开始。该过程通常包括选择相关患者群体和合适的正常对象匹配(例如年龄、性别、种族和/或BMI)群体。分析物测量本文提供的分级疾病严重度和监测对象对抑郁治疗的反应的方法包括确定从对象收集的生物学样品中一组生物标记物的水平。示例性对象是人,但对象也可以包括用作人类疾病模型的动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗和非人灵长类)。该组生物标记物可对具体疾病特异性。例如，多种分析物可以形成MDD特异性组。很多合适方法能用于定量包含在诊断/预后算法中的参数。例如，使用一种或多种医学设备或临床评价得分以获得分析物测量来评价对象病症。如图3流程图所示，本文所提供建立诊断评分的方法能包含使用检测生物样品以测定特定分析物水平的试验。如本文所用，“生物样品”指包含细胞或细胞物质的样品，由该样品可获得核酸、多肽或其他分析物。根据进行的分析类型，所述生物样品是可以通过标准技术分离得到的血清、血浆或血细胞。血清和血浆是示例性生物样品，但也可使用其他生物样品。例如，可测量尿液中的特定单胺类。此外，发现与健康对照对象相比，作为一组的抑郁患者的尿液中排出更大量的邻苯二酚胺(CA)和代谢物。其他合适的生物样品的例子包括但不限于脑脊液、胸膜液、支气管灌洗液、痰、腹膜液、膀胱洗液、分泌物(例如乳房分泌物)、口腔洗涤液、擦拭物(例如口腔擦拭物)、分离的细胞、组织样品、印片检查(touch preps)和细针抽吸物。在一些情况下，如果所述生物样品要立即测试，则该样品可以保持在室温；否则该样品分析前应冷藏或冷冻(例如在-80°C )。能分别得到单独参数的测量值，或就多个参数能同时得到测量值。任何合适平台能用于得到参数测量。一些示例中，生物样品中的生物标记表达水平能使用多同位素成像质谱(MMS)设备或任何其他合适技术测量，包括例如，单个分析如ELISA或PCR。可用于同时定量多重参数的平台包括例如美国临时申请号60/910，217和60/824，471，美国实用申请号11/850，550，和PCT公开号W02007/067819所述的平台，上述所有发表物通过引用全文纳入本文。有用的平台的例子采用精确人类生物实验室有限公司(Precision HumanBiolaboratories, Inc.现在是美国北卡罗来纳州三角科技园的里奇诊断有限公司(RidgeDiagnostics, Inc.))开发的MIMS无标记实验技术。简单的说，薄膜边缘的局部干涉为光学检测技术的基础。对于生物分子相互作用分析，具有SiO2干涉层的玻璃芯片可用作传感器。所述层表面的分子结合增加了所述干涉膜的光学厚度，其可如例如上述应用所示而检测。可用于多路复用的一个平台例子是FDA批准的基于流动的Luminex分析系统(xMAP)。该多重技术采用流式细胞分析来监测抗体/肽/寡核苷酸或受体标签或标记的微 球。另外，Luminex技术允许单个样品内多至100个独特分析的多路复用。由于该系统为开放式体系结构，Luminex易配置成宿主特定疾病组。使用诊断评分的方法如图4流程图所示，诊断评分能用于帮助确定诊断、分级患者、选择治疗和监控治疗。一个或多个诊断评分能从一组生物标记表达水平中得出。在该例子中，测量对象血样中的多重生物标记物，通过算法得到三个诊断评分。在一些情况下，单个诊断评分就足以帮助确诊和选择治疗。本文提供方法产生的诊断评分能用于，例如，对疾病严重度分级。因此，一些示例中，本文提供算法测定的单个分析物水平和/或诊断评分能提供给临床医生以用于诊断对象是否有轻度、中度或严重抑郁。例如，使用本文提供算法得到的诊断评分能由测定诊断评分的研究技术员或其他专业人员传递给会基于特定评分或在一段时间内诊断评分的增加或减少来分类有特定疾病严重性对象的临床医生、治疗师或者其他健康护理专业人员。基于所述分类，临床医生、治疗师或者其他健康护理专业人员能评价和推荐目标为最优化患者护理的合适治疗选择、教育程序和/或其他治疗。例如，诊断能用本领域方法确定，或由具有相关患者群经验的单个内科医师或一组内科医师作出。如本文所述，方法能包含提供与轻度、中度或严重抑郁状态相关的多个各分析物的数值，其中每个数值对应获自对象的生物样品中的各分析物水平，以对每个分析物特异的方式单独加权每个数值以获得每个分析物的加权值，并且基于包含每个加权值的方程测定结果值。然后结果值能与对照值作比较(如使用从正常对象和有轻度、中度或严重抑郁的对象得到的生物样品)，前提是对照值是以与结果值相当的方式测定。然后，根据结果值相较对照值落入的范围，所述对象能分类成没有抑郁或有轻度抑郁、中度抑郁或严重抑郁。所述方法能包含使用算法计算能用于支持分类的MDD诊断评分。多个分析物能包含任何两个或多个表I所列的分析物。一些情况中，例如，所述多个分析物能包含皮质醇、促乳激素、EGF、ΜΡ0、BDNF、抵抗素、sTNFR2、ApoC3和A1AT。另外，所述方法能包含获得生物样品的多个分析物中一个或多个的测量水平，其中结果值能至少部分基于测量水平。
诊断评分也能用于治疗监控。例如，可向临床医师提供诊断评分和/或个体分析物水平，用于建立或改变对象的治疗过程。当选择治疗且治疗开始时，可以在两个或更多间隔通过收集生物样品来定期监测对象，测量生物标记物水平以产生对应于给定时间间隔的诊断评分，并比较各时间的诊断评分。基于这些评分以及就诊断评分的升高、降低或稳定所观察到的任何趋势，临床医师、治疗师或者其他健康护理专业人员可以选择继续原先的治疗、中止治疗、或者调节治疗方案，目的是随着时间推进看到改善。例如，由诊断评分改变测定的疾病严重性下降能对应患者对治疗的正反应。由诊断评分改变测定的疾病严重性增加可指示未对治疗正反应和/或需要重新评价当前治疗计划。统计学诊断评分能对应静态疾病严重性。一些情况中，在疾病层(即轻度、中度和严重抑郁)之间的移动能指示疾病严重性的增加或降低。一些示例中，在疾病层之间的移动能对应特定对象或对象组所选定治疗计划的有效性。一些示例中，方法包含(a)提供与抑郁相关的多个各分析物的第一数值，其中每个第一数值对应从对象得到的第一生物样品的各分析物水平，以对每个分析物特异的方式单 独加权每个第一数值以得到每个分析物的第一加权值，并且根据包含每个第一加权值的方程测量第一 MDD评分；和6)提供多个分析物中每一个的第二数值，其中每个第二数值对应于对象的第二生物样品的各分析物水平，其中第二生物样品在抑郁疾病治疗(如治疗数天、数周、数月或更长)后获得，以对每个分析物特异的方式单独加权每个第二数值以得到每个分析物的第二加权值，前提是所述加权以与步骤(a)相当的方式完成，并且使用方程以测定对象抑郁疾病治疗后的第二 MDD评分。第一 MDD评分能与第二 MDD评分和从一个或多个正常对象测定的对照MDD评分或MDD评分范围作比较，并且如果第二 MDD评分比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为有效，或如果第二 MDD评分没有比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为无效。在一些实施方式中，在治疗如从对象犾取起始血液样品。能选择尚心样品以从细胞中分离血浆，并且存储为PSl (患者P图画I)。然后能治疗患者(如用一种或多种抗抑郁药)一段时间，并且能在治疗过程中收集血液样品(如开始治疗后数天、数周或数月)。能选择离心、标记和存储样品，从而与起始样品一起，可以有多个样品-PSl、PS2、PS3等，这取决于治疗持续时间和样品收集的频率。能分析对象的样品(PS1、PS2、PS3等)以测量所选生物标记(Mnl、Mn2和Mn3 =生物标记nl、n2和n3 ;例如见图10)的水平。标记组能包含从四个主要生物系统/通路(本文所述的炎症、HPA轴、代谢生物标记和神经营养因子)中选择的生物标记。例如，每个通路的生物标记包含选择表I所列的生物标记(例如，RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR、A1A、皮质醇和 EGF ;RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR、A1A 和 EGF ;RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES,TNFR 和 AlA ;S100B、PRL、BDNF、RES、TNFR 和 AlA ;皮质醇、PRL、BDNF、RES、TNFR 和 AlA ；或 BDNF、抵抗素、TNFRII 和 A1A)。数学算法能用于生物标记测量以计算与抗抑郁治疗期结束时最终结果(如HAMD评分改变)有关的评分。数学算法能使用特定生物标记改变和所述改变的比率以计算评分。例如，Mnl，Mn2(n=l，2，...标记数目)能用于计算评分。或者，如果使用两个样品，(Mnl-Mn2/(Mnl+Mn2)的改变能用于计算评分。另一实例中，Mnl，Mn2，Mn3 (n=l，2，3，· · ·标记数目)能用于计算评分，并且如果收集三个样品，(Mnl-Mn2)/(Mnl+Mn2)、(Mn2_Mn3)/(Mn2+Mn3)的改变能用于计算评分。在治疗结束时，已知每个患者的结果(即治疗是否成功)。所述结果能用作输入以优化包含使用生物标记测量(Mnl、Mn2、Mn3等)的计算从而预测患者治疗结果。比较生物标记测量的临床结果能优化生成与患者治疗抑郁(如用抗抑郁药)的治疗结果最大化相关的评分。对照监控评分能使用所述方法测定，并且随后对照评分能用作标准以确定对象的抑郁治疗是否有效。在另一个实施方式中，方法能包含各与抑郁相关的多个分析物的至少两个(即2、3、4、5或多个5个)数值，其中，每个数值对应于对象生物样品的分析物水平。例如，第一数值能从获自对象的第一生物样品的分析物得到，第二数值能从对象的第二生物样品的分析物获得，等等。第一生物样品能在抑郁疾病治疗前获得，并且第二和任何随后生物样品能在治疗开始后获得(如治疗开始后12小时,或治疗开始后1、2、3、4、5、6、7、14、21或更多天)。数值能以对每个分析物特异的方式加权，从而对每个分析物产生加权值，并且“监控评分”能根据包含加权数值的方程测定。监控评分能与对照评分作比较，并且能根据计算监控评 分是否大于对照评分来测量治疗成功。例如，如果监控评分大于或等于对照监控评分，将治 疗归类为有效，或如果监控评分小于对照监控评分，将治疗归类为无效。多个分析物能包含任何两个或多个表I所列的分析物。例如，多个分析物能包含PRL、BDNF、RES、TNFRII和AlA ;或RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR、A1A和EGF。对照值能从临床治疗监控研究中测定，从而试验数据用于测定与治疗结果(如成功治疗)相关的监控评分。所述监控评分能作为对照。报告了患者的诊断评分之后，健康护理专业人员可采取一项或多项行动来影响患者护理。例如，健康护理专业人员可以在患者病历上记录诊断或监控评分。在一些情况下，健康护理专业人员可以记录MDD诊断,或者另外转换患者的病历，以反映患者的医疗状态。在一些情况下，健康护理专业人员可以回顾和评价患者病历，并且可以评价用于临床干预患者病症的多种治疗方案。健康护理专业人员可以在接收了关于患者诊断评分的信息之后启动或改良MDD症状的治疗。在一些情况下，可将先前关于诊断评分和/或个体分析物水平的报告与最新沟通的诊断评分和/或疾病状态作比较。基于这种比较，健康护理专业人员可以推荐改变疗法。在一些情况下，健康护理专业人员可以招募患者进行新型MDD症状治疗干预的临床试验。在一些情况下，健康护理专业人员可以选择等待直到患者的症状需要临床干预才开始治疗。健康护理专业人员可以告知患者或患者家属诊断评分和/或个体分析物水平。在一些情况下，健康护理专业人员可以向患者和/或患者家属提供关于MDD的信息，包括治疗选择、预后、专家(例如神经学专家和/或顾问)转诊。在一些情况下，健康护理专业人员可提供患者病历的复印件以告知专家诊断评分和/或疾病状态。研究人员可以应用关于对象诊断评分和/或疾病状态的信息来推进MDD研究。例如，研究者可以汇编关于MDD诊断评分的数据与关于药物治疗MDD症状治疗效力的信息以鉴定有效的治疗。在一些情况下，研究人员可以获得对象的诊断评分和/或个体分析物水平以评价对象的招募或继续参与研究或临床试验。研究人员可以基于对象目前或先前诊断评分来分类对象病症的严重度。在一些情况下，研究人员可以向健康护理专业人员告知对象的诊断评分和/或个体分析物水平，和/或将对象委托健康护理专业人员进行MDD的临床评价和MDD症状的治疗。可使用任何合适的方法向其他人(例如专业人员)传递信息，且信息可以直接或间接传递。例如，实验室技术人员可以将诊断评分和/或个体分析物水平输入基于计算机的记录。在一些情况下，信息可以通过对病历或研究记录进行物理变更来传递。例如，医学专业人员可以进行永久注释或标记病历，用于和其他阅读该记录的健康护理专业人员交流诊断。可使用任何类型的通信(如，邮件、电子邮件、电话和面对面交谈)。信息也可以通过将这些信息电子化来传递给专业人员。例如，可将信息置于计算机数据库以使健康护理专业人员能够获得这些信息。此外，信息可以传递给医院、诊所、或者作为所述专业人员媒介的研究机构。以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范 围。
实施例实施例I-抑郁的诊断标记物采用本文提供的方法来开发一种用于确定抑郁评分的算法，这种抑郁评分可用于例如，诊断MDD、对疾病严重度分级和/或评价患者对抗抑郁治疗的反应。建议所述系统性、高度平行、组合方式使用本文所述算法，组装“疾病特异标志”。使用两种统计学方法进行生物标记物评价和算法开发(I)单独分析物水平的单变量分析，和(2)算法构造的线性判别分析和二元逻辑回归。个体分析物水平的单变分析单变量分析分别探索数据集合中的每一个变量。此分析考察值的范围以及值的集中趋势，描述对变量作出响应的模式，并独立描述每一个变量。例如，图5显示了一系列假设的6位MDD患者在治疗前后血中X标记物水平的分布。由该图可知的第一点是，与对照对象相反，标记物X的浓度在未治疗MDD患者中较高。其次，治疗之后MDD患者中标记物X的水平类似于对照。然后，使用学生t检验来比较这两组数据并检验其均值存在显著性差异的假设。采用学生t检验，用Luminex多重技术(xMAP)分析各测试分析物的血清水平以比较抑郁和正常对象。统计学显著性定义为P〈0. 05。对数据应用学生t检验，其中有相同数目的点，显示在对照对象和MDD患者之间的标记X表达差异在统计学上显著(P=O. 002)，以及治疗前后的差异也是统计学上显著(p=0. 013)。对照组与治疗后MDD患者之间不存在统计学显著差异(P = O. 35)。基于线性判别分析的算法为了确定对区分类别分级(例如抑郁对比正常对象)作用最大的分析物，采用适合微软WINDOWS :操作系统的来自SPSS统计V. 11. O软件(SPSS公司(SPSS，Inc.))的线性判别分析(LDA)分段法，其设置如下用威尔克斯λ (Λ)法选择使聚类间隔最大化的分析物并通过其F值控制进入模型的分析物。F值较大表明两组之间特定分析物的水平存在差异，F值较小(F〈l)表明无差异。在该方法中，较小的Λ拒绝虚假设(null hypothesis)。因此，目的是使A最小。为了构建一个分析物预测子的列表，计算每种分析物的F值。从具有最大F值的分析物开始(即两组间差异最大的分析物)，确定Λ值。然后将具有第二大F值的分析物加入列表，重新计算Λ。如果加入第二种分析物降低了 Λ值，则将其保留在分析物预测子列表中。重复一次加入一个分析物的过程直到Λ不再降低。然后进行交叉验证，这是一种测试预测模型稳健性的方法。为交叉验证预测模型，剔除一个样品并置于一旁。用剩余的样品基于预先选择的分析物预测子建立预测模型。确定新的模型是否能够正确预测未用于构建新模型的样品。可一次一个地对所有样品重复该过程，计算累积的交叉验证率。采用从单变分析和交叉验证获得的信息，通过人工加入和剔除分析物以使交叉验证率最大化来确定分析物预测子的最终列表。然后，最终的分析物分类器确定为一组给出最高交叉验证率的分析物预测子。选择重度抑郁症的多个生物标记使用Luminex多重技术测量约100个分析物的血清水平。学生t检验用于比较抑郁个体与正常对象的数据。统计学显著性定义为α <0.05。起始研究后，选择统计学显著分析物用于进一步研究。表I列举选择的生物标记组并且指示每个如何与在单极抑郁对象中观察到改变的通路相关。所述分析物进行多变量分析(PCA、PLS-DA和LDA)以确定能用于从正常群中区分MDD患者的生物标记。表I
基因符号基因名称pM
ΜΑΤα I抗胰蛋白酶S
Α2Μa 2巨球蛋白S
ApoC3载脂蛋白CIIIS
CD40LCD40 配体S
~ 白介素IS
Π~6白介素6S
IL-13白介素13S
IL-18白介素18S
IL-Ira白介素I受体拮抗剂炎症
MPO髓过氧化物酶S
PAI-I纤溶酶原激活物抑制剂-1S
RANTESRANTES (CCL5)
sTNFR2可溶性TNF-I受体II
TNFA肿瘤坏死因子aS
权利要求
1.一种在对象中对疾病严重度分级的体外方法，所述方法包含 (a)提供与轻度、中度和严重抑郁状态相关的各分析物的数值，其中每个数值对应于对象生物样品中的各分析物水平； (b)以对每个分析物特异的方式单独加权每个数值，以获得每个分析物的加权值； (C)根据包含每个加权值的方程测定结果值； (d)将所述结果值与从正常对象和有轻度、中度和严重抑郁状态的对象得到的对照值作比较，其中所述对照结果值比照所述结果值的测定方式测定；和 (e)如果结果值在没有抑郁、轻度抑郁、中度抑郁或严重抑郁的对照值预定范围内，分别将对象分类为没有抑郁、轻度抑郁、中度抑郁或严重抑郁。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述抑郁与重度抑郁症(MDD)相关。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，用算法计算MDD诊断评分用于支持轻度、中度或严重MDD状态的分级。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含一种或多种炎症生物 T 己 O
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含一种或多种神经营养性生物标记。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含一种或多种代谢生物 T 己 O
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含一种或多种下丘脑-垂体-肾上腺轴生物标记。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含选自下组的两个或多个分析物酰基化刺激蛋白、脂连蛋白、促肾上腺皮质激素、青蒿琥酯、α-I抗胰蛋白酶(Α1ΑΤ)、α-2-巨球蛋白、载脂蛋白C3(ApoC3)、精氨酸加压素、脑源性神经营养因子(BDNF)、促肾上腺皮质激素释放激素、C反应蛋白、⑶40配体、皮质醇、表皮生长因子(EGF)、粒细胞集落刺激因子、白介素-I、白介素-I受体激动剂、白介素_6、白介素-10、白介素-13、白介素-18、瘦素、巨噬细胞炎性蛋白Ia、髓过氧化物酶(MPO)、神经营养蛋白3、胰多肽、纤溶酶原激活物抑制剂-I、促乳激素、RANTES、抵抗素、络丝蛋白、S100B、可溶性肿瘤坏死因子α、可溶性肿瘤坏死因子α受体II (sTNFR2)、促甲状腺激素、肿瘤坏死因子α或其组合。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述多个分析物包含皮质醇、促乳激素、EGF、MPO、BDNF、抵抗素、sTNFR2、ApoC3 和 AlAT。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物样品是全血、血清、血浆、尿或脑脊液。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
12.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包含获得生物样品的一个或多个所述分析物的测量水平，其中所述结果值至少部分基于所述测量水平。
13.—种监控诊断有抑郁症对象治疗的体外方法，所述方法包含 (a)提供与抑郁相关的多个分析物各自的第一数值，其中每个第一数值对应于对象第一生物样品中的各分析物水平；(b)以对每个分析物特异的方式单独加权每个第一数值，以获得每个分析物的第一加权值； (c)根据包含每个第一加权值的方程测定第一MDD评分； (d)提供所述多个分析物各自的第二数据值，其中每个第二数值对应于对象第二生物样品中的各分析物水平，其中第二生物样品在抑郁症治疗后获得； Ce)以对每个分析物特异的方式单独加权每个第二数值，以获得每个分析物的第二加权值，前提是加权比照步骤(b)的方式完成； Cf)在对象接受抑郁症治疗后使用方程测定第二 MDD评分；和(g)将第一 MDD评分与第二 MDD评分和从一个或多个正常对象测定的对照MDD评分或对照MDD评分范围比较，如果第二 MDD评分比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为有效，或如果第二 MDD评分没有比第一 MDD评分更接近对照MDD评分，将治疗归类为无效。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物样品是全血、血清、血浆、尿或脑脊液。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二MDD评分在治疗抑郁后数天、数周或数月测定。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述多个分析物选自下组(a)RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR、ΑΙΑ、皮质醇和 EGF ；(b)RANTES、PRL、BDNF、SIOOB、RES、TNFR、AlA 和 EGF ；(c)RANTES、PRL、BDNF、S100B、RES、TNFR 和 AlA ；(d)SIOOB、PRL、BDNF、RES、TNFR 和 AlA ； (d)皮质醇、PRL, BDNF、RES、TNFR 和 AlA ;和 (f) BDNF、抵抗素、TNFRII 和 A1A。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述对象是人。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包含获得第一或第二生物样品的多个分析物中一个或多个的测量水平，其中所述相应第一或第二 MDD评分至少部分基于测量水平。
19.一种监控诊断有抑郁症对象治疗的体外方法，所述方法包含 (a)提供与抑郁相关的多个分析物各自的第一数值，其中每个第一数值对应于对象第一生物样品中的各分析物水平； (b)提供所述多个分析物各自的第二数值，其中每个第二数值对应于对象第二生物样品中的各分析物水平，其中第二生物样品在抑郁症治疗后获得； (c)以对每个分析物特异的方式单独加权每个第一和第二数值，以获得每个分析物的加权值； Cd)根据包含加权数值的方程测定监控评分；和 Ce)比较监控评分与对照监控评分，并且如果监控评分高于或等于对照监控评分，将治疗归类为有效，或如果监控评分低于对照监控评分，将治疗归类为无效。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述生物样品是全血、血清、血浆、尿或脑脊液。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第一生物样品在治疗开始前从所述对象中获得。
22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二生物样品在治疗开始后1-25天从所述对象中获得。
23.如权利要求19所述的方法，所述方法还包括 提供所述多个分析物各自的第三数值，其中每个第三数值对应于对象第三生物样品中的各分析物水平； 以对每个分析物特异的方式单独加权每个第三数值，以获得每个分析物的加权值；和 根据包含每个分析物的第一、第二和第三加权数值的方程测定监控评分。
24.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述多个分析物选自下组(a)PRL、BDNF、RES、TNFRII 和 AlA ;和(b)RANTES、PRL、BDNF、SIOOB、RES、TNFR、AlA 和 EGF。
全文摘要
本发明提供用于对疾病严重度分级和监控重度抑郁症的材料和方法。
文档编号G01N33/15GK102884428SQ201180011737
公开日2013年1月16日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者J·比雷洛, B·皮 申请人:里奇诊断学股份有限公司