一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法
技术领域：
本发明属于医学领域，具体涉及一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法。
背景技术：
QT间期指心电图上测量心跳电循环中Q波与T波这个时间段，代表心肌细胞从去极化到复极化整个过程。长QT综合症(long QTsyndrome, LQTs)分为先天性长QT综合症(co ngenital long QT syndrome)和获得性长 QT 综合症(acquired long QT syndrome) 先天性长QT综合征是因编码心肌细胞膜离子通道蛋白的基因突变导致离子通道功能障碍而引起的。药物是引起获得性长QT综合症的重要原因。当QT间期明显延长时，可能导致尖端扭转型室速(TdP)，TdP具有自限性，也可能进一步发展为室颤引起死亡。引起获得性长QT综合症的药物几乎都作用于一种特异性K+电流-快速激活的延迟整流钾电流(IKr)。IKr是由位于第7对染色体上的人hERG，(也称KCNH2)基因表达的产物。2005年起，G7各发达国家开始执行由欧盟、日本和美国的药品法规机构和大型制药企业联合制定的关于心脏安全评估的S7B法规。随着时间的推移，S7B法规将会逐渐被各国的药物管理局和制药公司所接受。据统计，259^40%的先导化合物都显示出不同程度的hERG通道相关的心脏毒性。因此，候选药物的hERG安全性评价是药物开发过程中至关重要的一环。hERG通道安全性评价作为新药临床前试验一个很重要的部分，经典的检测方法采用膜片钳技术进行评价，该方法实验设备较昂贵，对技术人员的要求较高，且由于手动膜片钳技术自身缺陷使得hERG通道安全性评价效率很低。

发明内容
本发明的目的是提供一种具有高通量、自动化、高效率、操作简便等特点的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法。本发明的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤常规培养表达hERG通道的细胞株，然后弃去其培养基，将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下孵育l_4h，然后弃去固定缓冲液，再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育5-40min，再弃去含待检药物的固定缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉残留Rb+，然后再加入离子通道开放缓冲液，孵育5-20min，移去细胞上清液，将细胞株裂解得细胞裂解液，分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度；再将上述含待检药物的固定缓冲液中的待检药物设定为其他不同浓度，按照上述方法重复测定，根据不同浓度的待检药物的测定所得的数据，得到该待检药物的IC5tl值，如果IC5tl值< 1000 u mol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC5tl值越�。得鞲靡┪锒詇ERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。根据《2011药品注册的国际技术要求安全部分》，体外哺乳动物细胞试验的最高浓度为1000 u mol/L,因此如果IC5tl值彡1000 u mol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC5tl值越�。得鞲靡┪锒詇ERG通道的抑制作用越大,心肌毒性的风险越大；所述的固定缓冲液RbCl2-10mM, NaCl 120_180mM，CaCl2 l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2O. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水。每升固定缓冲液的配置方法为在水中加入RbCl 2-10mmol, NaCl 120-180mmol, CaCl2 l_3mmol，NaH2PO4O. 4-1. 2mmol, MgCl2O. 8-1. 2mmol, glucose 3_7mmol、HEPES 20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。所述的洗涤缓冲液KC12-10mM, NaCl 120_180mM，CaCl2l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2O. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水。每升洗涤缓冲液的配置方法为在水中加入KCl 2-10mmol, NaCl 120-180mmol, CaCl2 l-3 mmol,NaH2PO4O. 4-1. 2mmol, MgCl2O. 8-1. 2mmol, glucose 3_7mmol、HEPES 20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。所述的离子通道开放缓冲液KC120-80mM, NaCl 70_130mM，CaCl2l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水。每升离子通道开放缓冲液的配置方法为在水中加入KCl 20-80mmol, NaCl 70-130mmol, CaCl2l_3mmol，NaH2PO4 0.4-1. 2mmol, MgCl2 0.8-1. 2mmol, glucose 3-7mmol>HEPES 20-30mmol,待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290-320m0sm。所述的再将上述含待检药物的固定缓冲液中的待检药物设定为其他不同浓度，按照上述方法重复测定，优选待检药物设置成浓度梯度10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3 X 10'10'3 X 10'10'3 X 10'KT9JXKT'KTiqM 等等。所述的表达hERG通道的细胞株优选为表达hERG通道的CHO细胞株或HEK 293细胞株。所述的常规培养表达hERG通道的细胞株是常规培养表达hERG通道的细胞株直至聚合度为80 90%。所述的将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下，优选孵育时间为2. 5h。所述的再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育时间优选为30min。所述的再加入离子通道开放缓冲液，孵育时间优选为lOmin。所述的固定缓冲液优选为RbCl5. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM,MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。所述的洗涤缓冲液优选为KC15. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM,MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。所述的离子通道开放缓冲液优选为KC1 50mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4
0.8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM,余量为水。所述的固定缓冲液、洗涤缓冲液和离子通道开放缓冲液的pH值优选为7. 4。所述的将细胞裂解得细胞裂解液优选是用裂解液裂解细胞20min得细胞裂解液，每IOOml裂解液为每IOOml的离子通道开放缓冲液中含有Iml Triton X-100。其配置方法为在每IOOml离子通道开放缓冲液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，过滤分装，4
度保存待用。所述的分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度优选是利用ICR 8000离子通道阅读器测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度。ICR 8000是一类中高通量的筛选仪器，每天能处理5000个样品。它是自动原子吸收光谱测量仪，能准确监视流经离子通道的离子流量，如K+，Na+，Rb+等，从而反映出离子的浓度变化。本发明中的HEPES是4-羟乙基哌嗪乙磺酸；N- (2-羟乙基)哌嗪-N’ _2_乙烷磺酸。本发明根据hERG通道对Rb+和K+的通透性是类似，且野生型或表达了 hERG通道的CHO或HEK293细胞株都不含有Rb+，然后在表达hERG通道的CHO或HEK293稳定细胞系上，固定缓冲液中含有Rb+而不含K+，使非放射性的铷元素来替代钾，通过hERG通道进入细胞内，然后再用待测药物孵育细胞株，再用不含Rb+洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉细胞株外的Rb+，再加入离子通道开放缓冲液，如果待测药物对hERG通道没有抑制，那么细胞株中的Rb+就会流出细胞外，进入上清液中，直至平衡，如果有抑制作用，导致hERG通道受到抑制的话，那么流出至细胞外上清液中的Rb+就会减少，抑制作用越大，即导致hERG通道受到抑制越多，流入细胞外上清液中的Rb+就越少，也就说明该待检药物对hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。本发明使用非放射性铷流量分析法间接地检测待检药物对hERG通道的作用，从而了解该药物对心肌毒性的大小。本发明方法简便、所需设备简单、对技术人员要求不高，高通量，效率高，如用ICR 8000离子通道阅读器测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度，每天可以处理5000个样品，一个人一天可以实现处理1000个样品的检测，而传统的膜片钳技术只能检测广2样品，实现了高通量的检测，使得效率大大的提高，并实现了自动化。由此可见，本发明的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法具有高通量、自动化、高效率、操作简单等优点，为新药临床前评价其对hERG通道安全性提供了简便有效的方法，大大加快了新药的筛选。

图I是阳性药Terfenadine的量效曲线；图2是阳性药verapamil的量效曲线；图3是阳性药多潘立酮的量效曲线；图4是阴性药盐酸环丙沙星的量效曲线。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :(I)细胞培养稳定表达了 hERG通道的CHO细胞株(现有技术中已有)接种于HamsF-12培养基中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。
(2)种板取状态良好，聚合度达到90%的细胞株以每孔50000个的密度种于96孔板中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。(3)固定Rb+ :待细胞长至覆盖孔底90%左右，弃孔中培养基，加200 ii L的固定缓冲液，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中孵育2. 5h。(4)药物处理弃各孔中的固定缓冲液，加入用固定缓冲液配置的待检药物，孵育30mino(5)洗涤弃各孔中含待检药物的固定缓冲液，加200 U L的洗涤缓冲液于96孔板各孔洗掉残留Rb+，重复三次。(6)通道激活加200 u L离子通道开放缓冲液于各孔，孵育lOmin，将细胞上清液移至另一全新96孔板。(7)细胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解细胞20min，得细胞裂解液。 (8) ICR8000样品分析用ICR8000分别测定细胞上清液及细胞裂解液中Rb+浓度。上清液及细胞裂解液中Rb+浓度分别为[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一种原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测Rb+的浓度。(9)数据处理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。将得到的不同的浓度梯度(至少5个浓度)待检药物和[Rb+]流量值输入到Original 6 (Sigmaplot)数据处理软件中利用逻辑斯蒂方程拟合IC5tl曲线，获得待检药物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于lOOOumol/L就认为该药物对hERG通道具有一定的阻滞作用。IC5tl值越�。得鞲靡┪锒詇ERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。(10)各种试剂配方和配置方法待检药物浓度梯度设置为:10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3X10_7、10_7、3X10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定缓冲液配置的待检药物，是在固定缓冲液中加入待检药物，使其浓度为上面的梯度浓度。然后按照上述方法进行重复实验。固定缓冲液RbCl5. 4mM, NaCl 150mM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2ImM,glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。每升固定缓冲液的配置方法为在水中加入RbCl
5.4mmol, NaCl 150mmol，CaCl2 2mmol，NaH2PO4 0.8mmol, MgCl2 lmmol, glucose 5mmol，HEPES 25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290-320 mOsm。洗涤缓冲液KC15. 4mM, NaCl 150mM, CaCl22mM, NaH2PO4O. 8mM, MgCl2ImM, glucose5mM、HEPES 25mM，余量为水。每升洗涤缓冲液的配置方法为在水中加入KCl 5. 4mmol,NaCl 1 SOmmoI , CaCl2 2mmoI, NaH2PO4 0. 8mmol, MgCl2 lmmol, glucose 5mmol、HEPES25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。离子通道开放缓冲液KC150mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。每升离子通道开放缓冲液的配置方法为，在水中加入 KCl SOmmoI, NaCl IOOmmol, CaCl2 2mmol, NaH2PO4 0. 8mmol, MgCl2 lmmol, glucose5mmol, HEPES 25mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。
裂解液l%Triton X_100，溶剂为离子通道开放缓冲液。其配置方法为在每IOOml离子通道开放缓冲液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，过滤分装，4度保存待用。本实施例的待检药物为对hERG通道呈阳性的阳性药Terfenadine、verapamil和多潘立酮，以及对hERG通道呈阴性的阴性药盐酸环丙沙星，按照上述方法进行实验，设置的待测药物浓度梯度如图中的横坐标所示，其结果如图所示，图I是阳性药Terfenadine的量效曲线；图2是阳性药verapamil的量效曲线；图3是阳性药多潘立酮的量效曲线；图4是阴性药盐酸环丙沙星的量效曲线。由图中可以看出，Terfenadine的IC5tl为67. 3 y mol/L,verapamil 的 IC50 ^ 25. 8 u mol/L、多潘立酮的 IC50 ^ 86. 5 u mol/L,这三个药物 IC50 都小于IOOOii mol/L，判断这些药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，并且远远小于IOOOumol/L，说明该药物对hERG通道的抑制作用很大，心肌毒性的风险很大，这与现有技术中对这三种药物的心肌毒性的评定的结论一致，而盐酸环丙沙星的IC5tl为3902. 8 u mol/L,远远大于1000umol/L,判断其对hERG通道不具有阻滞作用，无心肌毒性，这与现有技术中对这种药物的心肌毒性的评定的结论也是一致的，由此可见，利用本发明的高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法评价待检药物对心肌的毒性是可行的。实施例2 (I)细胞培养稳定表达了 hERG通道的CHO细胞株(现有技术中已有)接种于HamsF-12培养基中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。(2)种板取状态良好，聚合度达到90%的细胞株以每孔50000个的密度种于96孔板中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。(3)固定Rb+ :待细胞长至覆盖孔底90%左右，弃孔中培养基，加200 ii L的固定缓冲液，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中孵育lh。(4)药物处理弃各孔中的固定缓冲液，加入用固定缓冲液配置的待检药物，孵育40mino(5)洗涤弃各孔中含待检药物的固定缓冲液，加200 u L的洗涤缓冲液于96孔板各孔洗掉残留Rb+，重复三次。(6)通道激活加200 y L离子通道开放缓冲液于各孔，孵育5min，将细胞上清液移至另一全新96孔板。(7)细胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解细胞20min，得细胞裂解液。(8) ICR8000样品分析用ICR8000分别测定细胞上清液及细胞裂解液中Rb+浓度。上清液及细胞裂解液中Rb+浓度分别为[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一种原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测Rb+的浓度。(9)数据处理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。将得到的不同的浓度梯度(至少5个浓度)待检药物和[Rb+]流量值输入到Original 6 (或者Sigmaplot)数据处理软件中利用逻辑斯蒂方程拟合IC5tl曲线，获得待检药物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于1000 u mol/L就认为该药物对hERG通道具有一定的阻滞作用。IC5tl值越小，说明该药物对hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。( 10)各种试剂配方和配置方法
待检药物浓度梯度设置为:10_4、3X10_5、10_5、3X10_6、10_6、3X10_7、10_7、3X10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定缓冲液配置的待检药物，是在固定缓冲液中加入待检药物，使其浓度为上面的梯度浓度。然后按照上述方法进行重复实验。固定缓冲液RbCl2mM, NaCl 180mM, CaCl2 ImM, NaH2PO4 I. 2mM, MgCl2 0. 8mM,glucose 7mM, HEPES 20mM，余量为水。每升固定缓冲液的配置方法为在水中加入RbCl2mmol，NaCl 180mmol，CaCl2 lmmol, NaH2PO4 I. 2mmol, MgCl2 0. 8mmol, glucose 7mmol，HEPES 20mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。洗涤缓冲液KCl2mM, NaCl 180mM, CaCl2 ImM, NaH2PO4 I. 2mM, MgCl2 0. 8mM,glucose 7mM、HEPES 20mM，余量为水。每升洗涤缓冲液的配置方法为在水中加入KCl2mmol, NaCl 180mmo1’ CaCl2 lmmol, NaH2PO4 I. 2mmol, MgCl2 0. 8mmol, glucose 7mmo1’ HEPES 20mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290-320m0sm。离子通道开放缓冲液KC120mM, NaCl 130mM, CaCl2ImM, NaH2PO4L 2mM,MgCl2O. 8mM, glucose 7mM, HEPES 20mM，余量为水。每升离子通道开放缓冲液的配置方法为，在水中加入 KCl 20mmol, NaCl 130mmol, CaCl2Immol, NaH2PO4L 2mmoI, MgCl2O. 8mmol,glucose 7mmol, HEPES 20mmol,待溶解完全后定容至1L, PH用NaOH调至7. 4,过滤分装,4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。裂解液l%Triton X-100，溶剂为离子通道开放缓冲液。其配置方法为在每IOOml离子通道开放缓冲液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，过滤分装，4度保存待用。利用本实施例的评价方法能够高效评估药物对hERG通道的安全性，具有高通量、自动化、高效率、操作简单等优点。实施例3 (I)细胞培养稳定表达了 hERG通道的CHO细胞株(现有技术中已有)接种于HamsF-12培养基中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。(2)种板取状态良好，聚合度达到90%的细胞株以每孔50000个的密度种于96孔板中，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中常规培养。(3)固定Rb+ :待细胞长至覆盖孔底90%左右，弃孔中培养基，加200 ii L的固定缓冲液，于37°C、饱和空气湿度、95%空气+5%C02的条件下在CO2培养箱中孵育4h。(4)药物处理弃各孔中的固定缓冲液，加入用固定缓冲液配置的待检药物，孵育5min。(5)洗涤弃各孔中含待检药物的固定缓冲液，加200 u L的洗涤缓冲液于96孔板各孔洗掉残留Rb+，重复三次。(6)通道激活加200 u L离子通道开放缓冲液于各孔，孵育20min，将细胞上清液移至另一全新96孔板。(7)细胞裂解加200 u L裂解液于各孔，裂解细胞20min，得细胞裂解液。(8) ICR8000样品分析用ICR8000分别测定细胞上清液及细胞裂解液中Rb+浓度。上清液及细胞裂解液中Rb+浓度分别为[Rb+]e、[Rb+]i。ICR8000是一种原子吸收分光光度法，一般遵循分光光度法的吸收定律，通常借比较对照品溶液和供试品溶液的吸光度，求得供试品中待测Rb+的浓度。(9)数据处理:用[Rb+]e、[Rb+]i，求得[Rb+]流量，[Rb+]流量=([Rb+]e/([Rb+]e+[Rb+]i))。将得到的不同的浓度梯度(至少5个浓度)待检药物和[Rb+]流量值输入到Original 6 (或者Sigmaplot)数据处理软件中利用逻辑斯蒂方程拟合IC5tl曲线，获得待检药物的IC5tl值。一般IC5tl值小于等于lOOOumol/L就认为该药物对hERG通道具有一定的阻滞作用。IC5tl值越�。得鞲靡┪锒詇ERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的风险越大。( 10)各种试剂配方和配置方法待检药物浓度梯度设置为:10_4、3X10_5、10_5、3X 10_6、10_6、3X 10_7、10_7、3X 10_8、Io-8Jxio-9Uo-9Jxio-iqUo-iqM等等。用固定缓冲液配置的待检药物，是在固定缓冲液中加入待检药物，使其浓度为上面的梯度浓度。然后按照上述方法进行重复实验。
固定缓冲液RbClIOmM, NaCl 120mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2L 2mM,glucose 3mM, HEPES 30mM，余量为水。每升固定缓冲液的配置方法为在水中加入RbCllOmmol, NaCl 120mmol，CaCl2 3mmol，NaH2PO4 0. 4mmol, MgCl2 I. 2mmol, glucose 3mmol，HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。洗涤缓冲液KC1IOmM, NaCl 120mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2 I. 2mM,glucose 3mM, HEPES 30mM，余量为水。每升洗涤缓冲液的配置方法为在水中加入KClIOmmol, NaCl 120mmol, CaCl2 3mmol, NaH2PO4 0. 4mmo1, MgCl2 I. 2mmol, glucose 3mmol,HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290 - 320m0sm。离子通道开放缓冲液KC180mM, NaCl 70mM, CaCl2 3mM, NaH2PO4 0. 4mM, MgCl2I. 2mM, glucose 3mM, HEPES 30mM，余量为水。每升离子通道开放缓冲液的配置方法为，在水中加入 KCl 80mmoI, NaCl 70mmol, CaCl2 3mmoI, NaH2PO4 0. 4mmo1, MgCl2 I. 2mmol, glucose3mmol, HEPES 30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH调至7. 4，过滤分装，4度保存待用。用渗透压仪调节渗透压在生理盐水和人体的正常渗透压范围，290-320m0sm。裂解液l%Triton X-100，溶剂为离子通道开放缓冲液。其配置方法为在每IOOml离子通道开放缓冲液中加入Iml的Triton X-100，溶解完全后，过滤分装，4度保存待用。利用本实施例的评价方法能够高效评估药物对hERG通道的安全性，具有高通量、自动化、高效率、操作简单等优点。
权利要求
1.一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法，其特征在于，包括以下步骤常规培养表达hERG通道的细胞株，然后弃去其培养基，将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下孵育l_4h，然后弃去固定缓冲液，再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育5-40min，再弃去含待检药物的固定缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉残留Rb+，然后再加入离子通道开放缓冲液，孵育5-20min，移去细胞上清液，将细胞株裂解得细胞裂解液，分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度；再将上述含待检药物的固定缓冲液中的待检药物设定为其他不同浓度，按照上述方法重复测定，根据不同浓度的待检药物的测定所得的数据，得到该待检药物的IC5tl值，如果IC5tl值< 1000 u mol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC5tl值越�。得鞲靡┪锒詇ERG通道的抑制作用越大,心肌毒性的风险越大；所述的固定缓冲液RbCl 2-10mM, NaCl 120-180mM, CaCl2 I_3mM，NaH2PO4 0. 4-1. 2mM,MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水；所述的洗涤缓冲液KCl 2-10mM, NaCl 120-180mM, CaCl2 l-3mM, NaH2PO4 bO. 4-1. 2mM,MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水；所述的离子通道开放缓冲液KC1 20-80mM, NaCl 70-130mM, CaCl2 l_3mM，NaH2PO4O. 4-1. 2mM, MgCl2 0. 8-1. 2mM, glucose 3_7mM、HEPES 20_30mM，余量为水。
2.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的表达hERG通道的细胞株为表达 hERG通道的CHO细胞株或HEK 293细胞株。
3.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的常规培养表达hERG通道的细胞株是常规培养表达hERG通道的细胞株直至聚合度为80 90%。
4.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下，孵育时间为2. 5h，所述的再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育时间为30min，所述的再加入离子通道开放缓冲液，孵育时间为lOmin。
5.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的固定缓冲液为RbCl5. 4mM,NaCl150mM，CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。
6.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的洗涤缓冲液为KCl5. 4mM,NaCl150mM，CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。
7.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的离子通道开放缓冲液为KC150mM, NaCl IOOmM, CaCl2 2mM, NaH2PO4 0. 8mM, MgCl2 ImM, glucose 5mM, HEPES 25mM，余量为水。
8.根据权利要求1、5、6或7所述的评价方法，其特征在于，所述的固定缓冲液、洗涤缓冲液和离子通道开放缓冲液的PH值为7. 4。
9.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的将细胞株裂解得细胞裂解液是用裂解液裂解细胞20min得细胞裂解液，每IOOml裂解液为每IOOml的离子通道开放缓冲液中含有Iml Triton X-100。
10.根据权利要求I所述的评价方法，其特征在于，所述的分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度是利用ICR 8000离子通道阅读器测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+ 浓度。
全文摘要
本发明公开一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法。它是先常规培养表达hERG通道的细胞株然后弃去其培养基将细胞株加入到固定缓冲液中，在细胞株的常规培养条件下孵育1-4h，弃去固定缓冲液，再加入含待检药物的固定缓冲液，孵育5-40min，再弃去含待检药物的固定缓冲液，用洗涤缓冲液洗涤细胞株，洗掉残留Rb+，再加入离子通道开放缓冲液孵育5-20min，移去细胞上清液，将细胞株裂解得细胞裂解液，分别测定细胞上清液和细胞裂解液中的Rb+浓度；再设置含待检药物的固定缓冲液中的待检药物为不同浓度重复测定，根据不同浓度的待检药物的测定所得的数据得到IC50值，如果IC50值≤1000μmol/L就认为该待检药物对hERG通道具有一定的阻滞作用，IC50值越小抑制作用越大心肌毒性的风险越大。
文档编号G01N21/31GK102747129SQ201210201680
公开日2012年10月24日申请日期2012年6月18日优先权日2012年6月18日
发明者徐慧娟, 李志远, 梁洞泉, 程娜申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院

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一种高效评估药物对hERG通道安全性的评价方法