专利名称：一种间接测定Fenton反应产生的羟基自由基的方法
技术领域：
本发明涉及Vc等抗氧化剂对羟基自由基清除率的检测分析。在技术上涉及光分析化学等领域。
背景技术：
机体代谢过程中活性氧物种(ROS)不断通过非酶促反应和酶促反应产生，在正常生理情况下，ROS的生成与清除处于动态平衡，可维持有利无害的极低水平。由于内源性或外源性刺激使机体代谢异常而产生大量R0S，或机体抗氧化剂不足，则使机体处于氧化应急状态，导致细胞和组织损伤，引起各种疾病。羟基自由基(·0Η)是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、�：ψ畲蟮囊恢肿杂苫ｔ腔杂苫斡氲母髦址从σ殉晌镅�、生物化学和生物医学等领域中的重要研究课题。
动物体在生命活动过程中，伴随着活性氧自由基的生成与存在，生物体在进化过程中也逐渐形成了“抗活性氧的防御系统”。动物体内自由基清除剂是抗自由基防御系统清除自由基作用的物质基�。谔迥谧橹拖赴械暮烤龆ㄗ趴棺杂苫低车那宄杂苫芰ΑＨ颂迥诘乃苄孕》肿涌寡趸涟ǹ够笛�、谷胱甘肽、尿酸、色氨酸和半胱氨酸等。除抗坏血酸主要通过食物摄入外，其它几种都是体内的代谢产物。准确检测体内各种抗氧化剂对羟基自由基的清除能力，对相关疾病的诊断和药物的开发具有重要的意义。
目前，离体检测这些抗氧化剂对羟基自由基清除率的方法主要有电子共振自旋捕集法、化学发光法、高效液相色谱法、气相色谱法、荧光法等。电子自旋共振法和色谱法操作复杂，需要先采用特殊的捕捉试剂对产生的羟基自由基进行捕捉，且这两种方法仪器昂贵； 化学发光法虽然操作简便，测定快速，但其仪器普及不广。分光光度法因具有仪器简单廉价、操作方便、分析速度快、灵敏度较高的特点，在自由基清除率的测定中发挥了极大的作用。
本发明通过!^nton反应产生羟基自由基，催化邻苯二胺的显色反应。Vc等抗氧化剂对羟基自由基有显著的清除作用，并且抗氧化剂的浓度与吸光度的降低成正比，建立了一种间接测定羟基自由基的可见光分光光度法。发明内容
本发明的目的是提供一种分析成本低、操作方便、灵敏度高、重现性好的分光光度法间接检测抗氧化剂对羟基自由基的清除率。
为此，我们以过氧化氢和亚铁离子构建i^enton体系，产生羟基自由基。在酸性介质中，在具有强氧化性的羟基自由基的作用下，无色的邻苯二胺迅速被氧化为橙红色产物， 该产物于450nm处有最大吸收。抗氧化剂对该反应有显著的抑制效应。通过对比加入抗氧化剂前后产物的吸光度变化，可间接求出抗氧化剂对羟基自由基的清除率。
本发明的技术方案如下
1.邻苯二胺的氧化
于容量瓶中依次加入一定浓度的HC1、邻苯二胺、FeSO4和双氧水溶液各若干毫升， 加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间，邻苯二胺被氧化为稳定的橙红色产物。
2.产物吸收光谱的测量
反应结束后，以去离子水为参比，用Icm比色皿，用紫外可见分光光度计测量产物的吸收光谱(见附
图1)，获得最大吸收波长为450nm。
3.产物吸光度的测量
以去离子水为参比，用Icm比色皿，以450nm为分析波长，用紫外可见分光光度计测量产物的吸光度kQO
4.抗氧化剂对邻苯二胺氧化反应的抑制
于容量瓶中依次加入一定浓度的HC1、邻苯二胺、FeSO4、抗氧化剂、双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间后，测量产物的吸光度A1。由于抗氧化剂对氧化反应的抑制效应，在其余实验条件相同的情况下，无抗氧化剂存在的产物的吸光度Atl大于抗氧化剂存在的产物的吸光度A1。
本发明的原理是
酸性条件下，过氧化氢单独存在时，氧化邻苯二胺的速度非常缓慢，而在反应介质中加入亚铁离子，亚铁离子与过氧化氢构成i^nton体系，产生强氧化性的羟基自由基，使邻苯二胺迅速发生氧化反应，并生成稳定的橙红色产物。当在体系中加入抗氧化剂时，具有还原性的抗氧化剂能清除体系中的羟基自由基，抑制了邻苯二胺的氧化，导致产物的吸光度降低。通过
权利要求
1.一种间接测定i^enton反应产生的羟基自由基的方法。其特征在于测定过程包括以下步骤(1)邻苯二胺的氧化于容量瓶中依次加入一定浓度的HC1、邻苯二胺、FeSO4和双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间，邻苯二胺被氧化为稳定的橙红色产物。(2)产物吸收光谱的测量反应结束后，以去离子水为参比，用Icm比色皿，用紫外可见分光光度计测量产物的吸收光谱(见附图1)，获得最大吸收波长为450nm。(3)产物吸光度的测量以去离子水为参比，用Icm比色皿，以450nm为分析波长，用紫外可见分光光度计测量产物的吸光度Atl。(4抗氧化剂对邻苯二胺氧化反应的抑制于容量瓶中依次加入一定浓度的HC1、邻苯二胺、FeSO4、抗氧化剂、双氧水溶液各若干毫升后，加水定容。将混合液置于一定温度的恒温水浴中反应一定时间后，测量产物的吸光度~。由于抗氧化剂对氧化反应的抑制效应，在其余实验条件相同的情况下，无抗氧化剂存在的产物的吸光度Atl大于抗氧化剂存在的产物的吸光度A1。(3)羟基自由基清除率的计算按照公式风％) =χ 100计算抗氧化剂对羟基自由基的清除率。Ao
2.据权利要求1所述的间接测定!^nton反应产生的羟基自由基的方法，其特征在于对于0. lOmmol/L的三种抗氧化剂Vc的抗氧化性最佳，清除率为59. 6% ；硫脲的清除率为 52.4% ；苯甲酸的清除率为51.0%。
全文摘要
以Fe(II)为催化剂、双氧水为氧化剂，在酸性介质中将无色的邻苯二胺溶液迅速氧化成橙红色溶液，该产物于450nm波长处有最大吸收。抗氧化剂能清除Fenton反应产生的羟基自由基，对该反应有显著抑制作用。当抗氧化剂加入到反应体系中时，产物的吸光度明显下降，产物的吸光度随着加入到体系中的抗氧化剂浓度的增加而线性降低，通过对比加入抗氧化剂前后产物的吸光度可计算抗氧化剂对自由基的清除率。方法操作简单，实验成本低，灵敏度高。
文档编号G01N21/33GK102495015SQ201110409958
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月12日 优先权日2011年12月12日
发明者刘瑛, 朱逸雯, 江子卿, 陈新 申请人:江南大学
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