专利名称：在复杂生物液中的蛋白质的快速表征的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于快速筛选候选蛋白质治疗剂的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于测定在复杂生物液中的候选蛋白质治疗剂的行为和用于鉴定在这些液体中展示期望的药代动力学性质的候选蛋白质治疗剂的组合 物和方法。
背景技术：
在开发用于治疗应用的生物制剂中，在早期阶段能够评估候选化合物的稳定性和活性是非常重要的。当需要测定许多候选物时，体内评估是不切实际的。因此，开发了体外分析技术以提供初步的稳定性和活性数据。然而，这些技术一般使用标准缓冲液和定义明确的条件进行，这些缓冲液和条件接近，但可能截然不同于使候选化合物稳定和有活性从而在治疗上有效的复杂生物液的环境。在过去几年中日益明显的是，当在血液循环后恢复时，蛋白质治疗剂，例如抗体和其他重组表达的多肽展示改变的生理化学特征，包括减少的效能。因此，应用标准缓冲液和条件的要求快速评估和选择候选蛋白质治疗剂的目前的药物开发方案可能不能提供足够的数据用于准确评估临床有效性和稳定性。特别地，常规测定不能区分在复杂生物液中的稳定和显示期望药代动力学(“PK”)性质的候选蛋白质治疗剂与不稳定和表现不佳的候选蛋白质治疗剂。在一个这样的常规分析技术的例子中，Chen等人，Glycobiology, 19(3) : 240-249(2009)描述了在人血清中存在的单克隆抗体的电泳分析。Chen等人应用的分析技术要求在电泳分离目的抗体以鉴定特定的生理化学特性以前，首先通过亲和分离从血清样品中移取这些抗体和然后在标准磷酸缓冲液(“PBS”)溶液中重悬。因此，此技术不能分离暴露于人血清对生理化学特性的特定贡献与亲和分离和在PBS中的重悬的贡献。此外，亲和分离和重悬步骤使抗体表征技术增加了大量时间和成本。能够快速、精确和灵敏地分析在复杂生物液，例如血液、血清、血浆、淋巴液(lymph)、尿液和唾液中的候选蛋白质治疗剂的高通量技术不仅可降低开发成本，而且可便于有效筛选大量候选分子。本发明满足了这些需求。发明概述
在某些实施方案中，本发明涉及分析候选蛋白质治疗剂的生理化学性质的方法，其中所述候选蛋白质治疗剂首先被标记，然后暴露于复杂生物液，其后基于候选蛋白质治疗剂的物理属性得到和分离包含标记的候选蛋白质治疗剂的复杂生物液样品，其中检测所述标记物以测定候选蛋白质治疗剂的生理化学性质。在某些实施方案中，在候选蛋白质治疗剂上的标记物是荧光标记物。在某些实施方案中，在候选蛋白质治疗剂上的荧光标记物是Pico Protein 染料(Caliper Life Sciences, Inc. , Hopkinton, MA)。在本发明的某些实施方案中，候选蛋白质治疗剂选自抗体、抗体类似物(例如免疫粘附分子)、酶、细胞因子、细胞因子受体、淋巴因子、淋巴因子受体和激素。在某些实施方案中，待测定的生理化学性质选自(a)候选蛋白质治疗剂的片段化情况；(b)候选蛋白质治疗剂的聚集倾向；(c)候选蛋白质治疗剂的失活倾向；和(d)候选蛋白质治疗剂的另一种药代动力学特征。在某些实施方案中，待测定的生理化学性质是候选蛋白质治疗剂的药代动力学特征，其选自候选蛋白质治疗剂的吸收速率、分布速率、代谢速率、排泄速率、吸收程度、分布程度、代谢程度和排泄程度。在本发明的某些实施方案中，候选蛋白质治疗剂暴露的复杂生物液选自血液、血浆、血清、淋巴液、尿液和唾液。 在某些实施方案中，包含候选蛋白质治疗剂的复杂生物液的分离是电泳分离。在某些实施方案中，电泳分离是毛细管电泳，例如使用LabChip GXII仪器(Caliper Life Sciences, Inc. , Hopkinton, MA)进行的毛细管电泳。附图
简述
图 I 描述了电泳图的编绘(a compilation of electropherograms),分别说明了 mAb-1样品在5°C下和在25°C和40°C加热6和3个月后的蛋白质组成。“LC”指轻链；“HC”指重链；“Fab”指Fab片段，如在发明详述中更详细概述的，其包括抗体的抗原结合区jP“Fc”指Fe片段，如在发明详述中更详细概述的，其包括抗体的恒定区；和“聚集物”指抗体的聚集。图2描述了电泳图的编绘，说明在全血中孵育4和24小时后得到的mAb-1数据的精度(η=3) ο图3(A)_3(B)描述了电泳图的编绘，其为在全血中孵育T= O小时，T= 4小时和T= 24小时后得到的(A) DVD-I和(B) mAb-1分子。发明详述
本发明涉及用于快速筛选候选蛋白质治疗剂的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于测定在复杂生物液中的候选蛋白质治疗剂的行为和用于鉴定在这些液体中展示期望的PK性质的候选蛋白质治疗剂的组合物和方法。为了明确且不用于限制，此详述分为以下子部分
1.定义；
2.待分析的性质,和
3.分析方法。I.定义
为了可以更容易地理解本发明，首先定义一些术语。 术语“蛋白质”，如本文使用的，旨在指包含通过肽键连接的氨基酸残基的组合物。术语蛋白质，如本文使用的，可与术语“多肽”同义，或可另外指2种或多种多肽的复合物，例如包含通过二硫键结合在一起的重链和轻链多肽分子二者的抗体。术语“抗体”，如本文使用的，旨在指包含免疫球蛋白的分子。免疫球蛋白包含4条多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链，重链和轻链之间通过二硫键连接。每条重链包含重链可变区(本文中简称为HCVR或Vh)和重链恒定区(Ch)。重链恒定区包含3个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中简称为LCVR或')和轻链恒定区。轻链恒定区包含I个结构域，Q。Vh和' 区可被进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区和穿插在高变区中的被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个Vh和' 由3个CDR和4个FR组成，从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。有5种免疫球蛋白，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，基于其重链恒定区的结构鉴定每一种类。IgA、IgD和IgG的重链恒定区每个具有3个Ig结构域和提供灵活性的铰链区；而IgE和IgM的恒定区具有4个Ig结构域。 IgA和IgG种类分别被进一步分为2和4种单独的同种型(IgAl 和 IgA2 ;IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4)。本文中描述了包含抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)的某些抗体片段。这些片段包含抗体保留特异性结合抗原的能力的部分。术语抗体的“抗原结合部分”中包含的抗原结合片段的实例包括(i) Fab片段，包含'、Vh、(^和Chi结构域的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含2个Fab片段的二价片段，所述2个Fab片段通过在铰链区的二硫键连接；(iii)包含Vi^PChi结构域的Fd片段；(iv)包含抗体单臂的Vlj和Vh结构域的Fv片段，(V) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546，将其全部教导引入本文作为参考)，其包含Vh结构域；和(vi)分离的互补决定区(⑶R)。此外，尽管Fv片段的2个结构域，Vl和Vh，是由单独的基因编码，使用重组方法，通过能够使它们成为单条蛋白质链的合成接头可将它们连接，其中 '和Vh区配对从而形成单价分子(被称为单链Fv (scFv)；见，例如，Bird 等人(1988) Science 242:423-426;和 Huston 等人(1988) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85:5879-5883，将其全部教导引入本文作为参考)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在包括这样的单链抗体。也包括单链抗体的其他形式，例如双抗体。双抗体是二价的双特异性抗体，其中％和\结构域在单条多肽链上表达，但使用太短以至于不允许同一链上的2个结构域之间配对的接头，因此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生2个抗原结合位点(见,例如，Holliger, P.，等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R. J.,等人(1994) Structure 2:1121-1123，将其全部教导引入本文作为参考)。此外，双可变结构域抗体(DVD-IgG)是双特异性的四价免疫球蛋白G (IgG)样分子，其可从任意2种单克隆抗体改造而成，同时保留亲本抗体的活性(见，例如，Wu 等人，(2007) Nature Biotechnology 25,1290 - 1297)。此外，抗体或其抗原结合部分可为更大的免疫粘附分子的一部分，所述免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价连接形成。这样的免疫粘附分子的实例包括使用链霉抗生物素核心区制备四聚scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.,等人(1995) Human Antibodiesand Hybridomas 6:93-101,将其全部教导引入本文作为参考)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-端多聚组氨酸标记以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov, S. Μ.，等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058，将其全部教导引入本文作为参考)。可使用常规技术，例如全抗体的分别的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化从全抗体制备抗体部分，例如Fab和F(ab’)2片段。此外，可使用标准重组DNA技术得到抗体、抗体部分和免疫粘附分子。本文讨论的某些抗体片段不保留抗体结合能力，包括但不限于，Fe抗体片段。术语“Fe片段”，如本文使用的，指当用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白分子时产生的抗体片段，和指排除轻链的可变区(')和恒定区以及重链的可变区(Vh)和恒定区I (Chi)的免疫球蛋白分子的区域。术语“复杂生物液”，如本文使用的，旨在指在受试者中发现的任意循环或非循环的生物液，包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液和唾液。在分离分析前可最低限度地处理复杂生物液；例如，可通过离心(低速或高速)或过滤或沉淀去除细胞和/或粗颗粒成分，或可使用本领域已知的标准缓冲液稀释所述液体。甚至在这样的处理以后，在本文中仍然将其称为“复杂生物液”。术语“全血”，如本文使用的，旨在指在脊椎动物的心脏、动脉、毛细血管和静脉中循环的携带营养和氧气至身体所有部分并带走废产物的液体，其包含多种类型的细胞、蛋白质和盐Issaq等人，Chem Rev 107(8) :3601-3620 (2007)。当从此液体中去除细胞而不凝血，则剩下的液体部分为“血浆”;然而，如果在无抗凝血剂的情况下去除细胞，则液体部分被称为“血清”。血清与血浆的区别在于，去除了纤维蛋白以及与纤维蛋白相关的蛋白质；估计血清比血浆少约3-4%的蛋白质。血浆一般包含约22种蛋白质，它们构成99%的总蛋白质含量——这22种蛋白质包括白蛋白、总IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、总IgA、α-2-巨球蛋白、总IgM、α-I-抗胰蛋白酶、C3补体、结合珠蛋白(haptoglobulin)、α-I-酸性糖蛋白、 载脂蛋白-B、载脂蛋白-Al、脂蛋白(a)、因子H、血楽;铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、C4补体、补体因子B、前白蛋白、C9补体、Clq补体和C8补体。Anderson等人，MoI Cell Proteomics3(4) :311-326 (2004)和Anderson等人，Mol Cell Proteomics 1(11) :845-867 (2002)。血衆的其余1%由数百种微丰度(micro-abundant)蛋白质组成。因此,血清蛋白质展示了极度“拥挤的”环境，其中排除体积导致抗体治疗剂采用紧密的结构以及在血清中显示与抗原的结合增强。Demeule等人，Anal Biochem 388(2) :279-287 (2009)。此外，高水平的白蛋白、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽、高半胱氨酸和其他小硫醇也提供了便于从血清中恢复的抗体治疗剂中的二硫键重排的“氧化还原”环境。Summa等人，Proteins 69(2) :369-378 (2007)；Soriani 等人,Arch Biochem Biophys 312 (I) : 180-188 (1994) ;Mills 等人,J Lab ClinMed 135(5) :396-401 (2000) ;HiIdebrandt 等人，Mech Ageing Dev 123(9) :1269-1281(2002) ；Fiskerstrand 等人，Clin Chem 39(2) :263-271 (1993) ；Di Giuseppe 等人，JLab Clin Med 142(1) :21-28 (2003);和 Andersson 等人，Clin Chem 39(8) :1590-1597(1993)。术语“药代动力学性质”或“PK性质”，如本文使用的，旨在指描述候选蛋白质治疗剂在受试者中倾向(disposition )的参数。代表性药代动力学性质包括但不限于,候选蛋白质治疗剂在受试者中的吸收、分布、代谢和排泄的程度或速率(“ADME特征”)。术语“电泳”，如本文使用的，旨在指通过基质，优选通过聚合基质溶液使用电动势(“EMF”)推动或拉动分子的技术。将分子常规地引入基质，在应用电流后，分子将以不同的速率朝正极(如果分子带负电)或朝负极(如果分子带正电)移动通过基质。电泳基质的实例包括如在SDS-PAGE分离中通常使用的聚丙烯酰胺，以及用于微流体电泳分离，例如LabChip GXIII仪器应用的毛细管电泳分离的具有低粘度的聚合物溶液。术语“受试者”，如本文使用的，旨在指任意动物，包括人和非人动物二者。术语“约”，如本文使用的，旨在指高于或低于参考值约10-20%的范围。在某些情况下，本领域技术人员将承认，由于参考值的性质，术语“约”可表示多于或少于该值的10-20%的偏差。
2.待分析的性质
本发明的分析技术可用于测定候选蛋白质治疗剂在复杂生物液中的行为，以及鉴定候选蛋白质治疗剂的一种或多种PK性质。例如，但不以限制的方式，本发明的分析技术可用于测定通过暴露于复杂生物液而引起的某些分子行为，包括但不限于，候选蛋白质治疗剂在这些液体中的片段化情况，以及候选治疗剂在这些液体中形成聚集物的倾向。可使用本发明的分析技术评估的PK性质包括但不限于，候选蛋白质治疗剂的吸收、分布、代谢和排泄特征。在本发明的某些实施方案中，可同时或连续测定2种或多种这样的片段化、聚集和ADME特征。在某些实施方案中，本发明的分析技术用于测定候选蛋白质治疗剂在复杂生物液中的片段化情况(fragmentation prof iIe)。在某些实施方案中，片段化情况可包括有关分子间片段化的信息，例如抗体中的重链和轻链多肽的分离。在某些实施方案中，片段化情况可包括有关分子内片段化的信息，例如抗体被蛋白酶切割以释放Fc、Fv、Fab和/或F(ab’)2片段，或小于完整抗体，小于完整的单链免疫球蛋白，小于完整的Fc、Fv、Fab或F(ab’)2片 段等等的亚片段。在某些实施方案中，片段化情况可包括有关分子间和分子内片段化二者的信息。此外，在某些实施方案中，本发明的分析技术允许比较候选蛋白质治疗剂暴露于相同类型的复杂生物液的不同样品导致产生的片段化情况，以及基于候选蛋白质治疗剂暴露于这些液体的时间长度(the length)比较片段化情况。在某些实施方案中，本发明的分析技术用于测定特定候选蛋白质治疗剂在存在复杂生物液时聚集的倾向。此外，在某些实施方案中，本发明的分析技术允许比较候选蛋白质治疗剂暴露于特定复杂生物液导致的特定候选蛋白质治疗剂的聚集倾向，以及基于候选蛋白质治疗剂暴露于这些液体的时间长度的比较。在某些实施方案中，本发明的分析技术用于测定候选蛋白质治疗剂的吸收、分布、代谢和排泄的程度或速率。此外，在某些实施方案中，本发明的分析技术允许比较候选蛋白质治疗剂暴露于特定复杂生物液导致的特定候选蛋白质治疗剂的吸收、分布、代谢和排泄的程度或速率，以及基于候选蛋白质治疗剂暴露于这些液体的时间长度的比较。3.分析方法
本发明的某些实施方案涉及用于测定已暴露于复杂生物液的候选蛋白质治疗剂的生理化学特征的方法。如下详细概述地，这些方法包括用于测定生理化学特征的多种技术，例如，但不限于，电泳分离、大小排阻层析和亲和层析，并可包括候选蛋白质治疗剂在体外或体内暴露于复杂生物液。在某些实施方案中，在暴露于复杂生物液以前标记目的候选蛋白质治疗剂。在其他实施方案中，在暴露于复杂生物液以后，和任选地在电泳如或后标记候选蛋白质治疗剂。在特别的实施方案中，标记物为荧光染料，例如Pico Protein 染料。在其他实施方案中，候选蛋白质治疗剂被放射性标记或化学标记或酶标记或免疫标记。在某些实施方案中，候选蛋白质治疗剂不被标记，而是通过足以鉴定目的候选蛋白质治疗剂的免疫相互作用相互作用(例如，抗体与候选蛋白质治疗剂的特异性结合)、受体/配体相互作用、酶相互作用，或任意其他蛋白质蛋白质或化学相互作用检测。在某些实施方案中，标记的候选蛋白质治疗剂通过在体外直接掺入(spiking)所述液体的样品暴露于复杂生物液。在某些实施方案中，复杂生物液是血液、血浆、血清、淋巴液、尿液或唾液。在这样的实施方案中，可在本领域技术人员有利确定的特定条件，例如温度、压力等下孵育样品特定的时间。在这样的直接掺入后，在本领域技术人员有利确定的一个或多个时间点上取出包含在复杂生物液中的候选蛋白质治疗剂的样品的一个或多个等分试样。在某些实施方案中，然后基于等分试样的成分的特定物理特征，分离这些成分。在特别的实施方案中，分离是基于电荷，而在其他实施方案中，分离是基于可选的物理特征，例如大小、PH或对特定层析底物的亲和力。在分离是基于电荷的实施方案中，可通过应用电泳步骤完成分离。在特别的实施方案中，应用毛细管电泳通过电荷分离等分试样的成分。在某些实施方案中，通过检测在暴露于复杂生物液以前与蛋白质结合的标记物实现目的候选蛋白质，包括其片段和聚集物的分离分析。在某些实施方案中，对受试者(可为人或非人受试者)施用候选蛋白质治疗剂以将候选蛋白质治疗剂体内暴露于复杂生物液。可对受试者施用任意的多种形式的候选蛋白质 治疗剂。这包括,但不限于,液体、半固体和固体剂量形式,例如液体溶液(例如,可注射和可输注的溶液)、分散剂或悬浮剂、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。剂量形式依赖于例如，预期的施用模式和计划的治疗应用。一般的组合物是可注射或可输注的溶液形式，例如类似用于抗体的受试者被动免疫的组合物。一种施用模式是胃肠外的(例如，静脉内，皮下，腹膜内，肌肉内)。在一个方面，通过静脉内输注或注射施用候选蛋白质治疗剂。在另一个方面，通过肌肉内或皮下注射施用候选蛋白质治疗剂。在对受试者施用候选蛋白质治疗剂后，可在一个或多个时间点从受试者处米样用于分析。基于特定的目的候选蛋白质治疗剂，本领域技术人员可测定采集的样品，例如血液、淋巴液、尿液或唾液。在某些实施方案中，采集的样品是血液样品。在特别的实施方案中，采集的血液将被进一步加工为血浆样品。在可选的实施方案中，采集的血液将被进一步加工为血清样品。此外，基于目的候选蛋白质治疗剂以及待采样的复杂生物液的已知特征，本领域技术人员可确定这样的采样的时机。在某些实施方案中，这样的采样将以每小时、每12小时或每天的基础进行。在某些实施方案中，在施用候选蛋白质治疗剂后采集的样品将基于该样品的成分的物理特征直接用于分析。在可选的实施方案中，在这样的分析前，样品将被进一步加工。例如，但不通过限制的方式，可使用本领域已知的标准缓冲液稀释样品。也可，或可选地离心样品，例如，以约2，000 rpm离心5分钟血液样品以产生血清上清。在这样的分析前，也可，或可选地将样品暴露于中和化合物，例如，蛋白酶抑制剂，以抑制蛋白质降解。在某些实施方案中，通过基于特定物理特征分离样品成分分析这些成分。在特别的实施方案中，分离是基于电荷，而在其他实施方案中，分离是基于可选的物理特征，例如大小、pH或对特定层析底物的亲和力。在分离是基于电荷的实施方案中，可通过应用电泳步骤完成分离。在特别的实施方案中，应用毛细管电泳通过电荷分离样品的成分。在某些实施方案中，通过检测在暴露于复杂生物液以前与蛋白质结合的标记物实现目的候选蛋白质，包括其片段和聚集物的分离分析。在某些实施方案中，上述分析允许比较2种或多种候选蛋白质治疗剂在一种或多种复杂生物液中的行为，以及比较候选蛋白质治疗剂在这些液体中的一种或多种PK性质。在特别的实施方案中，这样的比较允许分级多种候选蛋白质治疗剂，包括，但不限于不同单克隆抗体克隆或DVD-IgG分子。
在某些实施方案中，本发明允许同时分析2种或多种候选蛋白质治疗剂。在本发明的特别的实施方案中，候选蛋白质治疗剂具有允许同时分析多种候选治疗剂的不同的物理特征，例如，但不限于，电荷或大小。在可选的实施方案中，候选蛋白质治疗剂具有允许同时分析多种候选治疗剂的不同的标记物。例如，但不通过限制的方式，可用在第一波长处发射的第一荧光标记物标记第一候选蛋白质治疗剂，同时可用在第二波长处发射的第二荧光标记物标记第二候选蛋白质治疗剂。在某些实施方案中，本发明允许分析特定候选蛋白质治疗剂的降解途径和代谢物。在特别的实施方案中，体外或体内标记特定候选蛋白质治疗剂的特定代谢物并暴露于复杂生物液。包含特定候选蛋白质治疗剂的特定代谢物的复杂生物液样品的分析可提供有关在一种或多种复杂生物液中的候选蛋白质治疗剂的代谢物的行为的信息，以及候选蛋白质治疗剂的代谢物在这样的液体中的一种或多种PK性质。在某些实施方案中，使用LabChip GXII仪器或等同的设备进行分析。在进行其分析中，LabChip GXII仪器应用芯片形式的传统凝胶电泳原理。然而，芯片形式大大降低了分离时间并以数字格式提供自动化大小分类和定量信息。芯片包含连接分离通道的连通的微通道组，其包括分离基质和缓冲孔。一个微通道与从芯片底部以90度角延伸的短毛细管连接。在测定时，此毛细管从微板的孔中吸取样品。
—旦充满通道，芯片行使集成电路的功能以实现样品的电泳分离。通过电极盒中的不同电极驱动电路，当芯片支架关闭时电极接触芯片孔中的溶液。将充满测定通道的聚合物基质设计为当通过电泳驱使蛋白质通过基质时，通过大小过滤蛋白质，类似于使用聚丙烯酰胺凝胶。然后，包含候选蛋白质治疗剂的复杂生物液样品电泳移动进测定通道。当片段在测定通道中向下移动时，它们通过大小分离，最后经过激发与候选蛋白质治疗剂结合的荧光染料的激光。软件将荧光强度对时间作图并产生每个样品的电泳图。
实施例I.全血中的蛋白质的分析
此实施例描述了使用LabChip GXII仪器分析直接从全血中回收的预标记的mAb和DVD-IgG分子。LabChip GXII具有从约14至约200 kDa的大小范围和约土 10%的大小分辨率。测定具有从约50 pg/ μ L至约100 ng/ μ L的约4 log的线性范围。如下详述地，使用制造商提供的Pico Protein 染料进行目的分子的标记。将标记的抗体掺入全血，在分析以前离心血液并收集上清用于在LabChip GXII上分析。将等分试样的上清电动上样至毛细管中并在包含具有低粘度的聚合物溶液的14 mm长的分离通道中分离。在约40秒中进行每种样品的分析；直接在96或384孔板上进行。此研究证明了此测定的高精度，以及此方法的分辨率和卓越的灵敏度。如制造商描述地制备染料溶液，Pico Protein 染料和蛋白梯。使用的标记缓冲液是O. 5M碳酸氢钠(pH 8. O)。在此研究中使用2种不同的分子，mAb-Ι ( 一种单克隆抗体)和DVD-I ( 一种双可变结构域抗体)。在标记缓冲液中将抗体稀释为2mg/mL，然后将8 μ g抗体与40 μ M工作染料溶液孵育(抗体的终浓度为O. 8 mg/mL)。允许标记反应进行I小时，然后使用在O. IM Tris (pH 7. O)中的IM乙醇胺猝灭反应。然后将每种分子掺入人血(抗体的终浓度为约O. I mg/mL)并在5°C孵育不同时间(至多24小时)。然后以2000 rpm离心等分试样的血液5分钟并收集5μ L血清，使用制造商提供的样品缓冲液稀释至O. 01 mg/mL。在LabChip GXII上分析以前,将样品加热至75 °C，持续5分钟。图I中分别显示了在5°C以及在25°C和40°C加热6和3个月后的mAb-Ι的分析。得到的电泳图与在其他仪器上通过CE-SDS (使用变性的十二烷基硫酸钠的毛细管电泳)分析的片段可比较。LabChip GXII显示了在热应激后得到的所有已知片段，还显示了 mAb-Ι的聚集。图2中显示了在全血中经过4和24小时后得到的mAb-Ι的精确数据(n=3)。从3次单独的分析中得到电泳图，并证明了此测定的卓越的可重复性。图3A和3B中显示了在全血中孵育T= O小时，T= 4小时和T= 24小时后得到的DVD-I和mAb-Ι分子的电泳图。DVD-I分子较大，并具有与mAb-Ι不同的迁移时间。2种分子在全血中都显示了不同水平的片段和聚集物形成。2.对动物施用的蛋白质的分析
此实施例描述了在对动物受试者施用后，使用LabChip GXII仪器分析直接从全血中回收的预标记的mAb和DVD-IgG分子。使用制造商提供的Pico Protein 染料进行目的分子的标记。对动物受试者施用标记的抗体并在这样的施用以后的不同时间点得到全血。在分析以前离心血液并收集上清用于在LabChip GXII上分析。将等分试样的上清电动上样至毛细管中并在包含具有低粘度的聚合物溶液的14 mm长的分离通道中分离。在约40秒中进行每种样品的分析；直接在96或384孔板上进行。如制造商描述地制备染料溶液，Pico Protein 染料和蛋白梯。使用的标记缓冲液是O. 5M碳酸氢钠(pH 8. O)。在此研究中使用2种不同的分子，mAb-Ι ( 一种单克隆抗体)和DVD-I ( 一种双可变结构域抗体)。在标记缓冲液中将抗体稀释为2mg/mL，然后将8 μ g抗体与40 μ M工作染料溶液孵育(抗体的终浓度为O. 8 mg/mL)。允许标记反应进行I小时，然后使用在O. IM Tris (pH 7. O)中的IM乙醇胺猝灭反应。然后对小鼠施用每种分子(抗体的终浓度为约O. I mg/mL)。每天从小鼠中采集血样，持续14天。然后以2000 rpm离心等分试样的每种血液样品5分钟并收集5μ L血清，使用制造商提供的样品缓冲液稀释至O. 01 mg/mL。在LabChip GXII上分析以前,将每种样品加热至75 °C，持续5分钟。
本文引用了多个出版物，其内容在此以其整体引入作为参考。
权利要求
1.一种用于分析候选蛋白质治疗剂的生理化学性质的方法，其包括 (a)标记所述候选蛋白质治疗剂； (b)将所述标记的候选蛋白质治疗剂暴露于复杂生物液； (b)得到包含所述标记的候选蛋白质治疗剂的所述复杂生物液的样品；(c)基于所述候选蛋白质治疗剂的物理属性在微流体设备中分离所述样品的成分；和 (d)检测所述标记物以测定在被分离的样品中的所述候选蛋白质治疗剂的生理化学性质。
2.权利要求I的方法，其中所述标记物是荧光标记物。
3.权利要求I的方法，其中所述突光标记物是PicoProtein染料。
4.权利要求I的方法，其中所述候选蛋白质治疗剂选自抗体、抗体类似物、酶、细胞因子、细胞因子受体、淋巴因子、淋巴因子受体和激素。
5.权利要求I的方法，其中所述性质选自(a)所述候选蛋白质治疗剂的片段化情况；(b)所述候选蛋白质治疗剂的聚集倾向；(c)所述候选蛋白质治疗剂的失活倾向，和(d)所述候选蛋白质治疗剂的另一种药代动力学特征。
6.权利要求5的方法，其中所述性质是所述候选蛋白质治疗剂的片段化情况。
7.权利要求5的方法，其中所述性质是所述候选蛋白质治疗剂的聚集倾向。
8.权利要求5的方法，其中所述性质是所述候选蛋白质治疗剂的另一种药代动力学特征。
9.权利要求8的方法，其中所述药代动力学特征选自候选蛋白质治疗剂的吸收速率、分布速率、代谢速率、排泄速率、吸收程度、分布程度、代谢程度和排泄程度。
10.权利要求I的方法，其中所述复杂生物液选自血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、脑脊液和唾液。
11.权利要求5的方法，其中所述复杂生物液是血清。
12.权利要求I的方法，其中所述分离是电泳分离。
13.权利要求12的方法，其中所述电泳分离是毛细管电泳。
14.权利要求13的方法，其中所述毛细管电泳是使用LabChip GXII仪器进行的。
全文摘要
本文公开了用于快速筛选候选蛋白质治疗剂的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于测定在复杂生物液中的候选蛋白质治疗剂的行为和用于鉴定在这些液体中展示期望的药代动力学性质的候选蛋白质治疗剂的组合物和方法。
文档编号G01N33/58GK102713635SQ201180006970
公开日2012年10月3日 申请日期2011年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者I.R.科雷亚 申请人:雅培制药有限公司
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