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专利名称：一种用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属免疫学技术领域，涉及ー种用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒，该试剂盒可通过检测单核细胞分化能力，对脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的检测，用于判断所述疾病的转归。
背景技术：
严重脓毒血症(severe sepsis)和急性/慢加急性肝衰竭(acute/acute onchronic liver failure)属于危重症疾病范畴,其特点为疾病均存在至少ー个主要脏器的功能衰竭及严重的免疫系统紊乱，死亡率高。迄今为止，临床尚无能有效测定所述疾病转归的诊断试剂盒。医学上，严重脓毒血症的定义为在系统性全身炎症反应综合征(systeminflammatory response syndrome, SIRS)基础上出现第一个脏器功能衰竭48小时后的患者即为严重脓毒血症。急性(Acute liver failure, ALF) /慢加急(Acute on chronicliver failure, ACLF)肝衰竭的定义为原来无肝病(ALF)或原有慢性肝炎或肝硬化病变基础(ACLF)的患者，在短期内因严重肝细胞损害而导致肝功能衰竭井/或出现肝性脑病为特征的肝衰竭症候群；该疾病患者进展迅速，死亡率高达60 % -70 %以上。严重脓毒血症和急性/慢加急性肝衰竭进展期均存在持续性代偿性抗炎反应综合征(CARS)，机体免疫系统处于严重的抑制状态；持续高强度的CARS (免疫麻痹)是机体免疫功能紊乱的ー种病理状态，进入免疫麻痹状态后，患者易发生二次感染，加速病情恶化，并可导致多器官功能衰竭(MODS);因此，持续、严重的CARS是提示严重脓毒血症及肝衰竭患者转归不佳的关键因素。目前尚无能有效预测上述疾病转归的有效手段，但目前通常采用的寻找疾病转归标志方法，是通过免疫抑制严重程度(CARS严重度)的水平来反映疾病预后。作为先天性和适应性免疫门户的单核细胞(monocytes)是抑炎因子(IL-10)的主要靶细胞，CARS持续状态下单核细胞功能障碍是严重脓毒血症及急性/慢加急性肝衰竭患者免疫麻痹的重要特征。抗原提呈功能、细胞分化能力及分泌炎症因子(TNFa )能力为单核细胞主要的三种功能。有研究发现其抗原提呈功能的抑制程度具有预测严重脓毒血症及急性/慢加急性肝衰竭转归的能力。Antoniades等在分析50例急性药物性肝衰竭进展期患者后发现，当单核细胞HLA-DR表达下降至〈15% (健康者为70%左右)时患者预后不良的准确率高达98%。Wasmuth等对27例肝硬化(50%病因为酒精性)基础上发生的慢加急性肝衰竭进展期患者研究后也提示单核细胞HLA-DR表达持续下降是免疫抑制状态下疾病预后的有效指标。因此，在持续性CARS环境下研究单核细胞功能变化是探索急性/慢加急性肝衰竭进展期转归预测的重要方向。目前急需ー种通过检测单核细胞分化情况，对脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血进行检测，用于判断上述患者转归情况的检测试剂盒。

发明内容
本发明的目的是提供一种用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒，该试剂盒可通过检测单核细胞分化能力，对脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的检测，用于判断所述疾病的转归。尤其是，该试剂盒通过检测单核细胞分化情况，对脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血进行检测，用于判断上述患者转归不良(死亡)还是转归良好(存活)。本发明中，所述的严重脓毒血症的定义为在SIRS基础上出现第一个脏器功能衰竭48小时后的患者，第一个脏器可包括肺脏、肝脏、肾脏、脑、心等；本发明中的实施例中以肝脏或肺脏作为第一个累及脏器，但并不局限与肝脏或肺脏。具体而言，本发明的用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒，其特征在干，包括但不局限于以下组成
含枸櫞酸钠的抗凝管、红细胞裂解液、PBS溶液、CD45人单克隆抗体、CD14人单克隆抗体、CD16人单克隆抗体和I %多聚甲醛固定液；
所述的CD45、CD14、CD16人单克隆抗体的浓度范围为0. 00001 u g/ml — 100mg/ml ;在本发明的实施例中，所述的⑶45、⑶14、⑶16人单克隆抗体浓度优选为25 ii g/ml。本发明中，所述试剂盒的检测流程至少包括以下步骤
(1)采集3ml患者外周静脉血放入含枸櫞酸钾的抗凝管内，
本发明中优选是立即进入检测流程，若不能立即检测，室温保存应不超过4小时，保存期间避免剧烈震荡；
(2)取200微升上述全血种于外周血96孔板中的一孔，共6孔；
(3)置于37°C，5%C02的孵箱中孵育48小时；
(4)分别取0，12，24，32，36及48小时培养后的全血加入红细胞裂解液1ml，
本发明中优选取36小时培养后的全血加入红细胞裂解液；
(5)800g离心,弃上清；
(6)加入IxPBS洗涤后，再800g离心一次；
(7)加入2微升⑶45、2微升⑶14及3微升⑶16人单克隆抗体孵育15— 30分钟；
(8)离心，IxPBS洗涤一次；
(9)加入1%多聚甲醛固定；
(10)4°C保存，流式细胞仪上机检测，获得在⑶45+范围内⑶14highCD16 monoycte，CD14hlghCD16+monoycte 的流式图。本发明所述检测流程的步骤(I)中采集外周静脉血的方式选自首次或后续或动态采集外周血。本发明中，分化阻抑与分化成功的判断标准为所述的流式图中以CD14highCD161nonoycte 为 Mol, CD14highCD16+monoycte 为 Mo2，以培养 36 小时的外周血中M02/M01>1. 0为分化成功，以Mq2/Mq1〈1. 0为分化阻抑。采用本发明的检测试剂盒对收集的四十多例严重脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血进行检測，对所述的四十多例严重脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血单核细胞的抗原提呈能力与预后关系进行分析，还对单核细胞的分化功能及产生TNFd的分泌能力进行了全面的研究分析，结果表明，严重脓毒血症和急性/慢加急肝衰竭患者的单核细胞分化能力同样存在障碍；研究结果还显示，外周血单核细胞分化阻抑与疾病转归密切相关存在单核细胞分化阻抑的患者死亡率明显升高，而存在单核细胞分化阻抑的患者经治疗后，若出现分化阻抑消失则显示其转归可存活。研究分析结果表明，本发明的检测试剂盒可通过检测单核细胞体外分化情况预测所述疾病的转归，为进一步治疗方案的制定提供參考数据。本发明的检测试剂盒具有以下优点
(1)本检测试剂盒可检测严重脓毒血症疾病患者转归，其中，严重脓毒血症疾病患者的第一个脏器包括肺脏、肝脏、肾脏、脑、心脏、血管系统、胰腺等；
(2)本检测试剂盒检测严重脓毒血症疾病患者转归包括转归良好(存活)及转归不良(死亡)两类；
(3)本检测试剂盒可检测急性重症肝衰竭患者转归，包括急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭以及亚急性肝衰竭的转归；
(4)本检测试剂盒检测急性重症肝衰竭疾病转归分为转归良好(存活)及转归不良(死亡)两类；
(5)本检测试剂盒用于检测急性重症肝衰竭疾病转归预测时，当患者外周血单核细胞分化成功则预测患者可能转归良好(存活)，当患者外周血单核细胞出现分化阻抑，则预测患者可能转归不良(死亡);
(6)本检测试剂盒用于严重脓毒血症疾病转归预测时，当患者外周血单核细胞分化成功则预测患者可能转归良好(存活)；当患者外周血单核细胞出现分化阻抑，则预测患者可能转归不良(死亡)。本发明所述的检测试剂盒可用于预测严重脓毒血症及急性/慢加急性肝衰竭进展期患者的临床转归；当患者外周血单核细胞显示分化阻抑时(Mo2/Mol〈l. 0)预测患者死亡可能性大；当患者外周血单核细胞显示分化成功时(MW/XD1. 0)预测患者存活可能性大；当患者较早时的外周血单核细胞显示分化阻抑，但经治疗后单核细胞重新出现分化吋，表明预后良好，存活可能性明显增高。本发明的试剂盒为进ー步治疗方案的制定提供有积极意义的參考数据。本发明的诊断试剂盒还可用于制备预测严重脓毒血症疾病的转归的制剂，和用于制备预测急性重症肝衰竭的转归的制剂。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的用于严重脓毒血症及急性肝衰竭患者的检测试剂盒进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也納入本发明的范围内。


图1显示了实施例1的急性重症肝衰竭患者的体外单核细胞亚群分化阻抑图。图2显示了实施例3的严重脓毒血症患者的体外单核细胞亚群分化阻抑图。图3显示了实施例7的急性重症肝衰竭患者的体外单核细胞亚群分化阻抑发生后，单核细胞亚群的分化能力恢复，患者转归良好。图4显示了实施例8的严重脓毒血症患者的体外单核细胞亚群分化阻抑发生后，单核细胞亚群的分化能力恢复，患者转归良好。图广4中，I是患者入院首次采集外周血当日0小时的单核细胞亚群的流式图；2是该名患者首次采集的外周血在37°C，5%C02的孵箱中孵育24小时后单核细胞亚群的流式图；3是该名患者首次采集的外周血在37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后单核细胞亚群的流式图；4是该名患者入院第二次采集外周血当日O小时的单核细胞亚群的流式图；5是该名患者第二次采集的外周血在37°C，5%C02的孵箱中孵育24小时后单核细胞亚群的流式图；6是该名患者第二次采集的外周血在37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后单核细胞亚群的流式图。
具体实施例方式实施例1体外单核细胞亚群分化阻抑的急性重症肝衰竭患者预后不佳
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者1，男性，58岁，其单核细胞分化能力(如图1所示)，患者基本情况本次发病表现为乏力，纳差，尿黄I周，加重伴神志不清I天，既往无肝病史，凝血酶原活动度PTA为27%，符合急性重症肝衰竭诊断标准。该患者首次采集(入院后第一天)夕卜周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔,置于37°C, 5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(I)图，在全血样本孵育过程，取24小时，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(2)和(3)图，(3)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制；该患者第二次(入院第四天)采集外周血标本后，取200微升全血种于夕卜周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(4)图，在全血样本孵育过程，取24小时，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(5)和
(6)图，(6)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制。对于该患者分别在入院第一、四天动态进行外周血单核细胞分化实验检测均显示分化阻抑，分析结果显示预后不佳，最终该名患者死亡。
实施例2体外单核细胞亚群分化成功的急性重症肝衰竭患者预后良好(存活)
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者2，男性，45岁，患者基本情况本次发病表现为纳差伴尿色加深I周，20年前查出HBV阳性，凝血酶原活动度PTA为38%。经外周血37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后使用诊断试剂盒中组成试剂检测及流式细胞仪分析，显示单核细胞分化成功(Mo2/ Mol > 1)，分析结果显示预后良好，最终该患者经内科治疗后存活。
实施例3 体外单核细胞亚群分化阻抑的严重脓毒血症患者(肝脏为首先发生衰竭的脏器)预后不佳
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者3，男性，45岁，其单核细胞分化能力(如图2所示)，患者基本情况本次发病表现为纳差伴尿色加深3周，20年前查出HBV阳性，凝血酶原活动度PTA为34%，由于存在肝脏功能衰竭，符合严重脓毒血症标准。该名患者首次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(I)图，在全血样本孵育过程，取24小时，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体CD14FITC和⑶16 PE双染色，做出(2)和(3)图，(3)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制；该名患者第二次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(4)图，在全血样本孵育过程，取24小吋，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(5)和(6)图，(6)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制；分析结果显示预后不佳，该名患者死亡。
实施例4 体外单核细胞亚群分化成功的严重脓毒血症患者(肝脏为首先发生衰竭的脏器)预后良好(存活)
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者4，男性，33岁，患者基本情况本次发病表现为纳差伴尿色加深10天，10年前查出HBV阳性，凝血酶原活动度PTA为35%，由于存在肝脏功能衰竭，符合严重脓毒血症标准。经外周血37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后使用诊断试剂盒中组成试剂检测及流式细胞仪分析，显示单核细胞分化成功(Mo2/ Mol > 1)，分析结果显示预后良好，该患者经内科治疗后存活。
实施例5 体外单核细胞亚群分化阻抑的严重脓毒血症患者(肺脏为首先发生衰竭的脏器)预后不佳(死亡)
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者5，女性，58岁，患者基本情况本次发病表现胸闷、气促，两周前有肺部感染史。入院时PaO2为50%，提示存在呼吸衰竭，符合严重脓毒血症诊断标准。经外周血37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后使用诊断试剂盒中组成试剂检测及流式细胞仪分析，显示单核细胞分化阻抑(Mo2/ Mol < 1)，分析结果显示预后不佳，该患者经内科治疗最终死亡。

实施例6 体外单核细胞亚群分化成功的严重脓毒血症患者(肺脏为首先发生衰竭的脏器)预后良好(存活)
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者6，男性，28岁，患者基本情况本次发病表现胸闷、气促，一周前有肺部感染史。入院时PaO2为48%，提示存在呼吸衰竭，符合严重脓毒血症诊断标准。经外周血37°C，5%C02的孵箱中孵育36小时后使用诊断试剂盒中组成试剂检测及流式细胞仪分析，显示单核细胞分化成功(Mo2/ Mol > I)。分析结果显示预后良好，该患者经内科治疗最终存活。
实施例7 体外单核细胞亚群分化阻抑发生后，单核细胞亚群的分化能力恢复预测急性重症肝衰竭患者转归良好(存活)。采用本发明检测试剂盒，通过检测患者7，男性，48岁，其单核细胞分化能力(如图3所示)，患者基本情况本次发病表现为纳差，腹胀3天，神志欠清I天，既往无肝病史，凝血酶原活动度PTA为31%，符合急性重症肝衰竭诊断标准。该名患者首次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(I)图，在全血样本孵育过程，取24小吋，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(2)和(3)图，(3)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制；该名患者第二次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出
(4)图，在全血样本孵育过程，取24小时，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(5)和(6)图，(6)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力已经恢复；分析结果显示预后良好，最终该名患者存活。
实施例8 体外单核细胞亚群分化阻抑发生后，单核细胞亚群的分化能力恢复预测严重脓毒血症患者转归良好
采用本发明检测试剂盒，通过检测患者8，男性，41岁，其单核细胞分化能力(如图4所示)，患者基本情况本次发病表现为乏力，纳差伴尿色进行性加深近I月，凝血酶原活动度PTA为37%，由于存在肝脏功能衰竭，符合严重脓毒血症标准。该名患者首次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(I)图，在全血样本孵育过程，取24小吋，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体CD 14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(2)和(3)图，(3)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力受抑制；该名患者第二次采集外周血标本后，取200微升全血种于外周血96孔板中，共3孔，置于37°C，5%C02的孵箱中孵育，留取0小时的血样，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(4)图，在全血样本孵育过程，取24小时，36小时两个时间点，从96孔板中抽出全血样本，用流式抗体⑶14 FITC和⑶16 PE双染色，做出(5)和(6)图，(6)图表明体外的单核细胞Mol向Mo2分化的能力已经恢复；分析结果显示预后良好，最终该名患者存活。
权利要求
1.一种用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒，其特征在于，包括但不限于以下组成 红细胞裂解液、PBS溶液、CD45人单克隆抗体、CD 14人单克隆抗体、CD 16人单克隆抗体和1%多聚甲醛固定液。
2.按权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的CD45、CD14、CD16人单克隆抗体的浓度范围为 O. OOOOl μ g/ml 一 100mg/ml。
3.按权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的CD45、CD14、CD16人单克隆抗体的浓度为25 μ g/ml ο
4.一种检测脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血单核细胞分化能力的方法，其特征在于，采用权利要求1的检测试剂盒，至少包括以下步骤 (1)采集3ml患者外周静脉血放入含枸橼酸钾的抗凝管内； (2)取200微升上述全血种于外周血96孔板中的一孔，共6孔； (3)置于37°C，5%C02的孵箱中孵育48小时； (4)分别取0，12，24，32，36及48小时培养后的全血加入红细胞裂解液Iml； (5)800g离心,弃上清； (6)加入IxPBS洗涤后，再800g离心一次；(7)加入2微升⑶45、2微升⑶14及3微升⑶16人单克隆抗体孵育15— 30分钟； (8)离心，IxPBS洗涤一次； (9)加入1%多聚甲醛固定； (10)4°C保存，流式细胞仪上机检测，获得在⑶45+范围内⑶14highCD16_ monoycte，CD14hlghCD16+monoycte 分析结果流式图。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)的采集外周静脉血的方式选自首次或后续或动态采集外周血。
6.按权利要求4所述的试剂盒的检测流程，其特征在于，所述步骤(10)的CD14highCD16_monoycte 为 Mol, CD14hlghCD16+monoycte 为 Mo2。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的首次外周血检测单核细胞中M#/MQ1〈1.0为分化阻抑。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的首次外周血检测单核细胞中M02/M0I >1. O为分化成功。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的后续或动态检测外周血检测单核细胞中MJ/XKl. O为持续分化阻抑。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的后续或动态检测外周血单核细胞中Mq2/Mq1>1. O为分化阻抑消失。
11.权利要求1的检测试剂盒在制备预测严重脓毒血症疾病的转归的制剂中的用途。
12.权利要求1的检测试剂盒在制备预测急性重症肝衰竭的转归的制剂中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的急性重症肝衰竭包括急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭以及亚急性肝衰竭。
全文摘要
本发明属免疫学技术领域，涉及一种用于严重脓毒血症及急性肝衰竭的检测试剂盒。所述的检测试剂盒包括含枸橼酸钠的抗凝管、红细胞裂解液、PBS溶液、CD45人单克隆抗体、CD14人单克隆抗体、CD16人单克隆抗体和1％多聚甲醛固定液。本检测试剂盒可通过检测单核细胞分化能力，对脓毒血症及急性/慢加急肝衰竭患者外周血的检测，用于判断所述疾病的转归。检测结果表明，所述疾病的单核细胞分化能力同样存在障碍；外周血单核细胞分化阻抑与疾病转归密切相关存在单核细胞分化阻抑的患者死亡率明显升高，而存在单核细胞分化阻抑的患者经治疗后，若出现分化阻抑消失则显示其转归可存活。本检测试剂盒为进一步治疗方案的制定提供有积极意义的参考数据。
文档编号G01N33/577GK103033620SQ201110073938
公开日2013年4月10日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者李海 申请人:李海