专利名称：新的医学方法以及用于医学方法的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及局部肿瘤免疫疗法的剂量优化方法以及用于这种方法的药剂。尤其是，提供了在肿瘤的治疗中免疫调节剂的局部施用的方法，包括CTLA-4阻断剂的剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部调节T细胞数目增加的最大治疗剂量。
背景技术：
在发达国家中癌症占死亡的30%以上。虽然在某些肿瘤(霍奇金病、一些淋巴瘤/白血病、局部皮肤癌)的治疗中取得了很大进展，常规疗法比如手术、化疗和放射疗法在治疗播散性实体肿瘤中是无效的。癌症的免疫疗法(与生物疗法同义)具有很大的希望用于多种不同类型癌症的治疗，其中癌症是播散性、转移性肿瘤(Stagg等人，2007，ImmunolRev. 220:82-101, Melief,2008, Immunity. 29:372-383, Melero 等人，2007，Nat RevCancer. 7:95-106, ffaldmann, 2006, Annu. Rev Med. 57:65-81, Khawli 等人,2008，Handb. Exp. Pharmacol. 181:291-328,Berinstein, 2007, Vaccine.25Suppl 2:B72-B88,Mellor.和Munn, 2008, Nat Rev Immunol. 8:74-80)。其目的在于激活患者的免疫系统来对抗癌症并产生肿瘤细胞的长期消灭。癌症免疫疗法的不同方法，包括以下I)单克隆抗体(Mab)疗法可用于i)使用裸露的抗体或偶联至毒素的抗体来靶向癌症细胞(如利妥昔单抗)用于破坏，ii)来阻断生长因子受体(赫赛汀)或iii)来刺激免疫系统。2)癌症疫苗，包括肿瘤细胞疫苗(自体的或异体的)、抗原疫苗和树突细胞疫苗、DNA疫苗和基于载体的疫苗(如基于腺病毒的基因转移)。3 )非特异性免疫疗法和佐剂通过刺激免疫系统更广泛地发挥作用，从而激活被肿瘤环境抑制的肿瘤特异性免疫细胞。这可以通过刺激或激活免疫效应细胞对肿瘤产生免疫反应(如效应T细胞,或Trff细胞)或通过抑制或失活具有抑制表型的细胞(如调节T细胞，或Treg细胞)来实现。像这样的方法将包括活性分子如细胞因子、细菌佐剂以及靶向免疫调节受体(如CTLA-4和CD40)的药物(包括单克隆抗体)。其它方法包括过继性T细胞转移和Treg耗竭疗法，其或多或少介于后两组之间。恶性黑色素瘤和肾细胞癌已成为免疫疗法的焦点，因为其固有的免疫原性以及对常规治疗的反应不佳。然而，免疫治疗方法具有用于大量癌症形式(包括胰腺、胃肠道和膀胱癌8)的潜力。膀胱癌是免疫疗法的另一个有趣的适应症，其已经通过免疫疗法(BCG)治疗了多年，并且其相对容易划分(compartmentalise)这种疾病的治疗(Totterman, 2005, BJU. Int. 96:728-735)。目前的研究关注如何使用免疫疗法策略来复原免疫抑制肿瘤的微环境，免疫疗法策略旨在于I)激活专门的抗原递呈细胞(APC)比如树突细胞(DC)，通过如CD40、CD137或Toll样受体(TLR)，2)使用细胞因子，比如IL_2、IL-12和干扰素来刺激淋巴细胞，或3)通过靶向如细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)或抑制性受体程序性死亡I (H)-I)来阻断抑制T细胞激活的信号(Stagg等人，2007，ImmunolRev.220:82-101, Melief,2008, Immunity. 29:372-383, Melero 等人，2007，Nat RevCancer. 7:95-106, ffaldmann, 2006, Annu. Rev Med. 57:65-81, Khawli 等人,2008，Handb.Exp. Pharmacol. 181:291-328,Berinstein, 2007, Vaccine. 25Suppl 2:B72-B88,Mellor.和Munn, 2008, Nat Rev Immunol. 8:74-80)。然而，系统性免疫疗法与剂量限制性毒性副作用有关，比如对于CTLA-4阻断的自体免疫反应(结肠炎、皮炎等)以及对于CD40激动剂的细胞因子释放综合征。虽然这些副作用是可管理的，由于副作用的治疗，不得不观察患者的症状并可能需要住院。这可能会增加患者的不便、增加治疗费用和治疗效果的限制。一种将系统性副作用最小化却保持了系统性抗肿瘤作用的有前景方法是局部免疫疗法。与系统性治疗相比局部免疫疗法对于散播性肿瘤的治疗I)更安全(毒性更小)，2)可以在更低剂量时使用，3)并将产生相似的或改善的抗肿瘤反应，还是系统性的。评价了相对于系统性治疗的局部治疗(瘤旁的=近瘤的、瘤内的、病灶内的等)的临床研究主要基 于IL-2治疗(黑色素瘤和肾癌)。系统性IL-2 (15. 5kDatl/7-14分钟(初始阶段)，各85分钟(第二阶段)治疗与血管渗漏综合征有关，并且治疗窗小(Shaker&Younes，2009, J PharmSci. 98(7) :2268-98)。系统性施用IL-2是批准的施用途径，然而，临床前的和临床数据有力地表明局部施用方案更优选(Shaker&Younes, 2009，J Pharm Sci. 98 (7) : 2268-98，Den等人,2008，Cancer TmmunoI Immunother. 57:931-950)。主要原因是当局部施用时有效剂量更低，获得的毒性就更低。事实上，当肿瘤内施用时IL-2的治疗效果似乎更高。这可能是由于肿瘤中IL-2诱导的血管渗漏的诱导导致大量肿瘤坏死，并有临床前的数据(和一个小型临床研究)证明肿瘤内比瘤旁施用更有效。支持在IL-治疗之后产生系统性、转移性清除免疫力的临床前的数据(Shaker&Younes, 2009，J Pharm Sci. 98(7) :2268-98, Den等人，2008，Cancer TmmunoI Immunother. 57:931-950，DeGroot 等人，2002，Int. J Cancer98:134-140)是重要的。此外，局部施用可改善肿瘤淋巴结引流的通路。还有一个临床研究表明在人类中通过局部施用可以获得系统性转移清除作用(Shaker&Younes, 2009, J PharmSci. 98 (7) : 2268-98, Den 等人，2008, Cancer TmmunoI Immunother. 57:931-950)。Melief 等人的小组(van Mierlo 等人，2002，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 99:5561-5566, van Mierlo 等人，2004，J Immunol 173:6753-6759)已经证明尽管系统性抗CD40的治疗导致强效的抗CD40作用，这也导致副作用(休克综合征)。当抗CD40抗体肿瘤内注射时没有见到副作用，但是其产生与i.v治疗的小鼠相当的系统性抗肿瘤作用(van Mierlo 等人，2002，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:5561-5566)。在一侧肋腹肿瘤内治疗的小鼠能够清除对侧中的肿瘤(vanMierlo等人,2002, Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 99:5561-5566)。这种抗肿瘤作用取决于DC激活和CTL反应的随后激活(van Mierlo, G. J.等人，Activation of dendritic cells that cross-presenttumor-derived antigen licenses CD8+CTL to cause tumor eradication. J Immunol173, 6753-6759 (2004) ) 这些结果得到Jackaman等人的验证(Jackaman等人，2008, International immunology. 20, 1467-1479)。他们在恶性间皮瘤模型(C57BL/6J)中研究了抗CD40抗体单独或与IL-2组合的肿瘤内注射。在熟知的双信号模型中，T细胞需要连同I型MHC的TCR和抗原之间的相互作用，还需要⑶28和⑶80/86相互作用提供的共同刺激来进行激活。细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)，通常认为其对激活的CTL的负调节作用，在维持外周耐受中发挥重要作用。多种机制可以解释CTLA-4-⑶80/86相互作用诱导的抑制作用。⑶80/86的相对水平、CTLA-4和⑶80以及⑶28和⑶86的更强的亲和性、⑶28进入免疫突触的物理阻断以及导致更少的IL-2转录的细胞内信号都是CTLA-4抑制性质的一部分(Davis等人，2003，Nat Immunol. 4，217-224，Lee 等人，1998，Science 282,2263-2266)。由于其在许多实验性肿瘤模型中有效的抗肿瘤作用，使用单克隆抗体阻断这种分子已被广泛应用(Kwon 等人，1997，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 94，8099-8103，Tuve 等人，2007，CancerRes.67,5929-5939, Van Horssen 等人，2006，Oncologist. 11，397-408，van Herpen, C等人，2008，Int. J Cancer 123,2354-2361, vanHerpen 等人，2003，Clin CancerRes9，2950-2956，Johnson 等人，2008，Cancer Immunol Immunother. 57, 1891-1902)。反应已被记录在患有转移性黑色素瘤和肾、前列腺癌和卵巢癌的患者中。到目前为止，系统性CTLA-4疗法与自体免疫性事件如肾炎、结肠炎、皮疹和甲状腺炎有关。使用原发肿瘤切除之后施用的抗CTLA-4抗体来阻断CTLA-4降低在小鼠模型系统 中的转移复发(Kwon 等人，1997，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 94，8099-8103)。此外，Tuve等人(Tuve等人，2007, CancerRes. 67，5929-5939 )已证明具有TC-I肿瘤的小鼠的抗CTLA-4治疗，其中肿瘤其自身表达抗CLA-4抗体，其表现出强效的抗肿瘤作用而没有自体免疫的诱导。小鼠还受保护免于肿瘤的再处理。在这种模型下，系统性抗CTLA抗体导致自体免疫，但没有抗肿瘤作用。TNF-apha治疗临床试验分离的肢体灌注是临床批准的治疗的另一个实例，其中当系统性施用时具有不能接受的毒性谱的疗法可安全用于肉瘤的局部癌症治疗(欧洲批准)(Van Horssen 等人，2006，Oncologist. 11，397-408，van Herpen, C 等人，2008，Int. JCancer 123，2354-2361，van Herpen 等人，2003，Clin Cancer Res 9，2950-2956)已证明在人类中在头和颈的鳞状细胞癌中肿瘤内施用IL-12是安全的并诱导相关免疫反应。肿瘤内注射比静脉注射的优势已由Johnson等人证明(Johnson等人,2008，Cancer Immunol Immunother. 57，1891-1902)。他们研究了免疫细胞因子的施用(革巴向肿瘤的偶联至IL-2的抗体)。与IV相比，他们使用更少的免疫细胞因子IT获得更强效的作用，并且还对远端肿瘤有效。正如通过对肿瘤再处理的排斥(rejection)所证明的，抗肿瘤作用是系统性的并产生记忆反应。临床数据证明，癌症的局部IL-2治疗，以更低的剂量，产生相似的或改善的疗效，也潜在地清除转移，与更低的毒性有关。此外，来自AdCD40L研究的临床数据表明这种局部的方法是安全的并且不产生细胞因子释放综合征和肝毒性。然而，仍然存在着对改善的肿瘤疗法的需求。
发明内容
本发明的第一方面提供一种免疫调节剂，其能够抑制细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4 ;也称为CD152、CELIAC3、GSE和IDDM12)的活性，用于患者中肿瘤的局部治疗，其中治疗包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化，来鉴别在患者中不诱导局部调节T细胞(Treg细胞)数目增加的最大治疗剂量。
通过肿瘤的“局部”治疗，我们的意思是免疫调节剂在肿瘤的附近施用，例如直接至肿瘤中或在肿瘤的位置。在一个实施方式中，肿瘤是实体肿瘤。在一个实施方式中，肿瘤是播散性的(即转移的)。例如，肿瘤可以选自胰腺、膀胱、皮肤(如黑色素瘤)、肾、前列腺、乳腺、淋巴结、卵巢、肺、脑、头、颈、血和骨髓(如白血病)和消化道(胃、结肠、直肠)的肿瘤。在一个实施方式中，肿瘤的治疗包括免疫调节剂的注射。例如,注射可能是肿瘤内的、瘤旁的、近瘤的、病灶内的和/或肿瘤引流淋巴结中。通过“能够抑制细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)活性的免疫调节剂”我们意思是能够抑制，至少部分，CTLA-4诱导的T细胞抑制的药剂。尤其是，我们包括能够体内阻断CTLA-4与B7-1 (CD80)和/或B7-2 (CD86)相互作用的药剂。例如，免疫调节剂能够 体内结合CTLA-4、B7-1和/或B7-2，从而抑制(至少部分)这些免疫调节分子之间的相互作用。因此，与不存在免疫调节剂时的活性相比，免疫调节剂可能抑制CTLA-4活性的至少10 %，例如至少20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。有利地，免疫调节剂完全抑制CTLA-4的活性。本领域技术人员应当理解能够体内抑制CTLA-4活性的任何药剂可用于本发明。使用本领域熟知的方法可鉴别这种药剂，比如(a)通过确定受试药剂对CTLA_4mRNA表达水平的作用，例如通过Southern印迹或相关杂交技术；(b)通过确定受试药剂对CTLA-4蛋白质水平的作用，例如通过使用抗CTLA-4抗体的免疫分析；以及(c)通过确定受试药剂对CTLA-4活性的功能性标志物的作用，例如其结合B7_l(CD80)和 / 或 B7-2 (CD86)的能力。在本发明的一个实施方式中，药剂是CTLA-4表达(即转录和/或翻译)的抑制剂。因此，药剂可能是短的干扰RNA (siRNA)分子或反义寡核苷酸。例如，药剂可能包括或由短的核苷酸序列(10至30个核苷酸)组成，短的核苷酸序列互补于编码人CTLA-4的mRNA区域(见 GenBank 登录号 L15006. I)。在本发明的另一个实施方式中，药剂是CTLA-4结合性质的抑制剂。例如，药剂可干扰CTLA-4和内源性配体/受体(比如B7-1 (⑶80)和/或B7-2 (⑶86))的结合。这可能通过药剂结合CTLA-4从而抑制或防止其结合至B7-1 (⑶80)和/或B7-2 (⑶86)来实现。或者，药剂可能结合B7-1 (⑶80)和/或B7-2 (⑶86)从而抑制或防止结合至CTLA-4。天然配体(B7-1和B7-2)与CTLA-4的结合诱导免疫抑制(inhibitory)/抑制(suppressive)作用，从而它们结合的阻断抑制(inhibits)抑制性(suppressive)事件。在本发明的另一个实施方式中，药剂可能通过调节(例如，降低)CTLA-4或其mRNA的稳定性来抑制CTLA-4的生物活性。有利地，药剂能够选择性地抑制CTLA-4的生物活性。通过“选择性地”我们的意思是与药剂在癌细胞中调节其它蛋白质的活性相比，药剂抑制CTLA-4的生物活性到达了更大的程度。优�。┘两鲆种艭TLA-4的生物活性，尽管如此应当理解为癌细胞中的其它蛋白质的表达和活性可能作为CTLA-4的选择性抑制的下游结果而发生变化。因此，我们排除对基因表达和/或癌细胞生长有非特异性作用的药剂。本领域技术人员应当理解，通过本发明药剂对CTLA-4生物活性的抑制可能是完全的或部分的。例如，与细胞中未暴露于药剂的CTLA-4的生物活性相比，药剂可能抑制CTLA-4生物活性的至少10%，优选至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，最优选100%。在一个优选实施方式中，与细胞中未暴露于药剂的CTLA-4的生物活性相比，药剂能够抑制CTLA-4生物活性的50%或以上。有利地，免疫调节剂包括或由多肽组成。在一个实施方式中，免疫调节剂不是抗体或抗原结合片段或其衍生物。例如，免疫调节剂可能是可溶性的配体(比如修饰的B7-1或B7-2，工程化的CTLA-4天然配体；分别见NCBI序列号NM_005191. 3和GenBank号U04343. I)。与细胞表面结合的配体相反，这种可溶性配体不形成受体/配体多聚体复合物，并且这样发挥作用来抑制CTLA-4介导的信号途
径。 在一个可替代的实施方式中，免疫调节剂包括或由抗体或抗原结合片段或其衍生物组成。通过“抗体”我们包括基本上完整的抗体分子、以及嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体(相对于天然发生的人类抗体而言，其中至少一个氨基酸是突变的)、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、以及抗原结合片段及其衍生物。通过“抗原结合片段”我们意思是能够结合相同抗原的抗体功能片段。优选,抗原结合片段选自Fv片段(如单链Fv和二硫键结合的Fv)、Fab_样片段(如Fab片段、Fab’片段和F (ab) 2片段)、单可变结构域(如Vh和\结构域)和结构域抗体(dAbs，包括单和双格式[即dAb-接头-dAb])。使用抗体片段的优势是使用完整抗体的数倍。片段更小的尺寸导致改善的药理性质，比如更好的实体组织的渗透。此外，抗原结合片段比如Fab、Fv、ScFv和dAb抗体片段可表达于和分泌自大肠杆菌(E. coli),从而允许大量所述片段的方便生产。本发明的范围内还包括抗体及其抗原结合片段的修饰形式，如通过聚乙二醇或其它合适聚合物的共价附着修饰。抗体和抗体片段的产生方法是本领域熟知的。例如，可通过多种方法中的任意一种产生抗体，其中方法采用诱导抗体分子的体内生产、筛选免疫球蛋白文库(Orlandi等人，1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:3833-3837; Winter 等人,1991, Nature349:293-299)或通过培养基中的细胞系生产单克隆抗体分子。这些包括，但不限于，杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和Epstein-Barr病毒(EBV)杂交瘤技术(Kohler等人，1975.Nature 256:4950497; Kozbor 等人,1985. J. TmmunoI. Methods 81:31-42; Cote 等人,1983.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole 等人，1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120)。可通过已知技术制备适于所选抗原的单克隆抗体，例如那些“MonoclonalAntibodies:A manual of techniques”，H Zola(CRC Press,1988)和“MonoclonalHybridoma Antibodies : Techniques and Appl ications，，，J G R Hurrel I (CRCPress, 1982)中所公开的。使用本领域熟知的方法可以获得抗体片段(见，例如Harlow&Lane, 1988, “Antibodies: A Laboratory Manual，，，Cold Spring HarborLaboratory, New York)。例如,可以通过抗体的蛋白水解或通过在编码片段的DNA的大肠杆菌或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞培养或其它蛋白质表达系统)中表达而制备本发明的抗体片段。或者，可以通过常规方法经由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来获得抗体片段。本领域技术人员应当理解对于人类的疗法或诊断，优选使用人源化抗体。非人(如，鼠的)抗体的人源化形式是具有优选源自非人抗体的最小部分的遗传工程化的嵌合抗体或抗体片段。人源化抗体包括这样的抗体，其中人抗体(受体抗体)的互补决定区被来自具有所需功能性的非人物种(供体抗体)(比如小鼠、大鼠或兔子)的互补决定区的残基替换。在某些情况下，人抗体的Fv框架残基被相应的非人残基替换。人源化抗体还可包括既不在受体抗体中也不在引入的互补决定区或框架序列中发现的残基。一般情况下，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个、和典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有互补决定区对应着非人抗体的那些，以及所有、或基本上所有框架区对应着有关的人一致序列的那些。人源化抗体任选地还包括至少一部分抗体恒定区，比如Fe区，典型地源自人抗体(见，例如 Jones 等人，1986. Nature 321:522-525; Riechmann 等人，1988，Nature332:323 -329;Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596)。用于非人抗体的人源化的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有来自非人来源的一个或更多个引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基，通常被称为引入的残基，典型地取自引入的可变区。基本上按照所描述的(见，例如Jones等人,1986. Nature321:522-525; Reichmann 等人，1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen 等人，1988, Science239:1534-15361;US 4，816，567)通过用相应的啮齿类互补决定区取代人互补决定区可以进行人源化。因此，这种人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上比完整的人可变结构域更少的被来自非人物种的相应序列所取代。实践中，人源化抗体典型地可以是人抗体，其中一些互补决定区残基以及可能地一些框架残基被来自啮齿类抗体的类似位点的残基所取代。还可以使用本领域已知的各种技术鉴别人抗体，包括噬菌体展示文库(见，例如，Hoogenboom&Winter, 1991，J. Mol. Biol. 227 : 381; Marks 等人，1991，J. Mol.Biol. 222:581; Cole 等人，1985，参见Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, pp. 77;Boerner 等人，1991. J. Immunol. 147:86-95)。一旦获得合适的抗体，例如通过ELISA测试它们的活性。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段或其衍生物是人的或人源化的。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段或其衍生物缺少功能性Fe部分。在一个实施方式中，免疫调节剂能够结合CTLA-4。例如，免疫调节剂可包括或由具有CTLA-4拮抗剂活性(如伊匹单抗(ipilimumab),BMS/Medarex)的抗CTLA-4抗体、或抗原结合片段或其衍生物组成。在一个实施方式中，免疫调节剂是非天然发生的。在一个实施方式中，免疫调节剂是体外蛋白质优化的直接或间接产物(如使用在WO 02/48351 和 WO 03/097834 中所述的 Alligator Bioscience AB 的f]NDk■技术)。在一个实施方式中，本发明第一方面的免疫调节剂(此处称为“第一免疫调节剂”)用来和第二活性剂组合使用。第二活性剂可能是第二免疫调节剂。例如，第二活性剂可能能够体内结合免疫细胞辅助受体(co-receptor)。在一个实施方式中，(第一)免疫调节剂是免疫系统的直接激活因子，而第二免疫调节剂是免疫抑制细胞或事件的抑制剂，或反之亦然。在一个实施方式中，(第一)免疫调节剂是CTLA-4抑制剂而第二免疫调节剂是细胞因子。例如，(第一)免疫调节剂可能是具有CTLA-4拮抗剂活性的抗CTLA-4抗体或抗原结合片段或其衍生物，而第二免疫调节剂可能是IL-2。 或者，(第一)免疫调节剂是CTLA-4抑制剂而第二免疫调节剂是⑶40激动剂。例如，(第一)免疫调节剂可能是具有CTLA-4拮抗剂活性的抗CTLA-4抗体或抗原结合片段或其衍生物，而第二免疫调节剂可能是具有CD40激动剂活性的抗CD40抗体或抗原结合片段或其衍生物。在另一个实施方式中，第二活性剂是常规的抗癌治疗。例如，抗癌治疗可能选自化疗剂(比如吉西他滨、多西紫杉醇)、放射疗法、手术、癌症疫苗(比如BCG、Melacine )、过继性T细胞转移和Tms细胞耗竭疗法。在另一个实施方式中，第一免疫调节剂是为了在一段较长时间内连续释放，而第二次免疫调节剂是为了在短的间歇脉冲内释放，或反之亦然。本发明第一方面的免疫调节剂的基本特征在于它们在患者中肿瘤的局部治疗中的用途，其中治疗方案包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部调节T细胞(TMg细胞)数目增加的最大治疗剂量。通过“剂量的患者特异性优化”我们意思是免疫调节剂的剂量针对各患者单独进行优化。在一个实施方式中，剂量的患者特异性优化包括以不同的剂量向患者局部施用免疫调节剂，在各剂量之后，测量局部Tms细胞的数目和/或局部Treg细胞对局部T6ff细胞的比例。通过“调节性T细胞”或“T,eg细胞”我们意思是通常通过抑制它们的活性来调节其它T细胞和/或其它免疫细胞活性的T细胞(T淋巴细胞)。在一个实施方式中，Treg细胞是⑶4+、⑶25+、FoxP3+T细胞(但是本领域技术人员应当理解I；eg细胞不完全限于这种表型)。通过“效应T细胞”或“Teff细胞”我们意思是执行免疫反应功能(比如杀伤肿瘤细胞和/或激活抗肿瘤免疫反应，其可导致肿瘤细胞从身体中清除)的T细胞(T淋巴细胞)。在一个实施方式中，Teff细胞是带有⑶4+或⑶8+的⑶3+。Teff细胞可分泌、包含或表达效应标志物比如IFNgamma、颗粒酶B和ICOS (但是本领域技术人员应当理解Trff细胞不完全限于这种表型)。通过“局部”我们意思是TMg细胞和T6ff细胞在肿瘤的附近，即在肿瘤的位置。在一个实施方式中，按照从最低到最高剂量的顺序，施用免疫调节剂的不同剂量。当然，应当理解各剂量的作用的评价可涉及，在测试下一剂量之前，该剂量的重复施用，任选地持续数天。在一个实施方式中，在患者中不诱导局部TMg细胞数目增加的最大治疗剂量鉴别为与局部Tms细胞对局部Trff细胞的最低比例有关的剂量。如上述，免疫调节剂剂量的患者特异性优化之后，然后在治疗期间向患者施用最大治疗剂量。然而，应当理解一旦治疗开始剂量将随着时间的推移而降低来获得所需的治疗作用。典型情况下，人类患者中免疫调节剂的最大治疗剂量在每次施用0. I至10mg/kg的范围内。例如，最大治疗剂量可能在0. I和5mg/kg之间或I和5mg/kg之间或0. I和2mg/kg之间。应当理解这种剂量可以不同的间隔施用，如通过肿瘤科医生/医师所确定的；例如，可每日、每周两次、每周、双周或每月施用剂量。
在一个实施方式中，免疫调节剂的最大治疗剂量是低剂量。例如，本发明中待局部施用的剂量可能在需要产生治疗作用的相同药剂典型系统性剂量的25%以下。在一个实施方式中，剂量小于或等于每次施用Img,例如小于或等于每次施用500 ii g、400 ii g、300 ii g、200 ii g、IOOii g、50ii g、30ii g、20ii g、IOii g、5ii g或 Iii g。应当理解这种剂量随着时间的
推移可向患者重复施用，例如每天两次、每天一次、隔日一次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次等。在一个实施方式中，免疫调节剂以每次施用IOii g至50ii g的剂量使用。例如，免疫调节剂以每次施用20ii g至40ii g的剂量使用，例如每次施用30ii g。在一个实施方式中，免疫调节剂表现出反向(inverse)剂量治疗作用反应。在一个实施方式中，免疫调节剂能够提供系统性的抗肿瘤作用。在一个实施方式中，免疫调节剂能够提供效应和抑制细胞之间比例和/或机制的变化。可通过流式细胞术(基于⑶25和Foxp3、⑶4阳性)在不同部分(比如脾、肿瘤引流淋巴结、血)中测量不同抑制细胞类型的相对数目，如Treg细胞。可通过不同抑制细胞类型的流式细胞分析测量效应细胞的相对数目，如可以通过流式细胞术(基于如CD8、CD107、IFNgamma阳性)在不同部分(比如脾、肿瘤引流淋巴结、血和肿瘤)中测量Teff细胞。本领域技术人员应当理解TMg细胞和/或Teff细胞的数目可在免疫调节剂施用之后的不同时间点进行测量。例如，Tms细胞和/或T6ff细胞的数目可在免疫调节剂施用同一天和/或免疫调节剂施用之后数周(如2、3、4、5、6、7或甚至8周)进行测量。典型地，Treg细胞和/或Teff细胞的数目在免疫调节剂施用后一到七天进行测量。因此，在一个实施方式中，最大治疗剂量确定为施用后1、2、3、4、5、6和/或7天在患者中不诱导局部Tms细胞数目增加的最大局部剂量。在一个实施方式中，免疫调节剂能够提供效应或抑制细胞数目和/或这些亚组之间比例的变化，其中变化与抗肿瘤作用有关。在一个实施方式中，免疫调节剂对于CTLA-4的阻断表现出有利的副作用谱，如降低或没有自体免疫反应(肠炎、皮炎)。在一个实施方式中，其中相对于免疫调节剂的高剂量应用免疫调节剂表现出降低的副作用谱。在一个实施方式中，相对于免疫调节剂的系统性施用，免疫调节剂表现出降低的副作用谱(以提供等价治疗作用的剂量)。本领域技术人员应当理解本发明的免疫调节剂将以药物组合物的形式施用，药物组合物包括有效量的此处定义的药剂和可药用稀释剂、载体或赋形剂。如此处所用，“药物组合物”是指本发明的治疗有效的制剂。如此处所用“治疗有效量”或“有效量”或“治疗有效”涉及针对给定的情况和施用方案提供治疗作用的量。这是一种经计算与需要的添加剂和稀释剂即载体(carrier)或施用载体(vehicle)结合来产生所需的治疗作用的活性物质预先确定的量。此外，其意图表示足以降低或预防临床上显著的活性、功能和宿主反应的不足(deficit)的量。或者，治疗有效量是足以在宿主中引起临床上显著的情况的改善的量。本领域技术人员应当理解，化合物的量可取决于其特定的活性而变化。合适的剂量数量可含有经计算与需要的稀释剂结合来产生所需的治疗作用的活性组合物的预先确定的量。在用于制造本发明组合物的方法和用途中，提供了活性成分的治疗有效量。基于患者特征(比如本领域熟知的年龄、重量、性别、情况、并发症、其它疾病等)通过普通的有技术的医疗人员或兽医工作者可以确定治疗有效量。
本发明的药剂可使用可注射的持续释放的药物递送系统进行递送。这些是专门设计用来降低注射的频率。这种系统的实例是Nutropin Depot,其在可生物降解的微球中包囊重组人生长激素(rhGH)，一经注射，在持续的一段时间缓慢释放rhGH。优�。∪饽�(i. m.)和/或皮下(s. c.)和/或静脉内(i. V)进行递送。可以通过将药物直接释放至需要的位点的外科植入装置来施用本发明的药剂。例如,Vitrasert将更昔洛韦(ganciclovir)直接释放至眼睛中来治疗CMV视网膜炎。这种毒性剂直接应用至疾病位点获得有效的疗法而没有药物显著的系统性副作用。然而，本发明的药剂将典型地，以包含活性成分的药物组合物的形式、任选地以无毒的有机或无机的酸或碱加成的盐的形式、以可药用的剂型形式通过注射来局部施用于肿瘤的位置或肿瘤附近。取决于待治疗的疾病和患者，以及施用途径，可以不同的剂量施用组合物。在人类治疗中，本发明的药剂可以单独施用，但通常将与根据预期的施用途径和标准的药物操作所选择的合适的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。适于通过注射施用的药物和药物组合物包括水和非水无菌注射溶液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂以及使得制剂与预期受体的血等渗的溶质；以及水和非水无菌混悬液，其可包括混悬剂和增稠剂。药物和药物组合物可出现在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可存储在只需在使用前即刻添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)情况中。可从之前描述的那种无菌粉、颗�：推林票讣从眯妥⑸淙芤汉突煨�。对于兽医用途，本发明的药剂作为合适的可接受的制剂根据正常的兽医操作进行施用，并且兽医外科医将确定最适合特定动物的给药方案和施用途径。可以各种浓度配制本发明的药剂，这取决于正在使用的化合物的疗效/毒性，例如，随附实施例中所述的。对于体外应用，制剂可包括更低的浓度的本发明化合物。在一个实施方式中，免疫调节剂以缓释组合物的形式提供。使用用于肿瘤内递送的缓释基质可提供一个或更多个如下优点 疗效改进 组织保留时间提高
靶组织中恒定的浓度 和系统性施用相比，局部作用所需的mAb/配体的量降低 给药频率降低 (由于给药频率降低)患者方便性提高；和/或 系统性渗漏风险降低，从而系统性副作用减低。此外，如果ADC固定在颗粒表面，载体颗�？墒沟么碳ば允芴�(如CD40)的更高级别的交联。还有如通过特定的细胞或仅在低PH值时增强生物分布和颗粒吸收的潜能。缓释颗粒的实例包括
纳米颗粒(如聚gammaPGA颗粒) 微颗粒(如交联葡聚糖微球,如来自OctoPlus Inc的OctaDex) Montanid Matrigel在一个实施方式中，免疫调节剂以pH稳定的组合物的形式提供。在一个实施方式中，其中免疫调节剂是用于通过瘤旁注射的慢性施用的具有CTLA-4拮抗剂活性的抗CTLA-4抗体或抗原结合片段或其衍生物。本发明的第二方面提供如以上所定义的免疫调节剂在制备用于肿瘤局部治疗的药物中的用途，其中治疗包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部Tms细胞数目上的增加的最大治疗剂量。本发明的第三方面提供用于在患者中治疗肿瘤的方法，包括向患者施用如上定义的免疫调节剂的步骤，其中在肿瘤的位置或附近局部施用免疫调节剂，其中方法包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部Tms细胞数目上的增加的最大治疗剂量。本发明的第四方面提供用于确定患者中肿瘤局部治疗的免疫调节剂最佳剂量的方法，包括(a)提供来自患者的细胞样本，其中患者已接受测试剂量下的免疫调节剂的肿瘤局部治疗；(b)测量细胞样本中的TMg细胞数目；(C)必要时，在不同的免疫调节剂测试剂量下重复步骤(a)及(b)来确定在样本中不诱导Tms细胞数目增加的免疫调节剂的最大剂量。其中最佳剂量确定为不诱导TMg细胞数目的增加的免疫调节剂的最大剂量。在这方面，本领域技术人员应当理解(如此处所用)表述“不诱导TMg细胞数目的增加”旨在包括这样的剂量，其在样本中可能在一定程度上增加Tms细胞的数目，但不足以对患者对肿瘤细胞的免疫反应具有实质上的抑制作用。在一个实施方式中，细胞样本选自血液样本、肿瘤活检和肿瘤引流淋巴结活检。因此，方法可能包括确定免疫调节剂测试剂量对局部Treg细胞(即在肿瘤的位置或附近)的作用。在一个实施方式中，方法还包括测量步骤(b)中的细胞样本中效应细胞的数目，其中最佳剂量确定为在样本中诱导效应细胞数目最大程度的增加而不诱导Tms细胞数目增加的免疫调节剂的剂量。
在一个实施方式中，在患者中不诱导局部TMg细胞数目增加的最大治疗剂量鉴别为与局部Tms细胞相对于局部T6ff细胞的最低比例有关的剂量。在一个实施方式中，方法还包括，步骤(a)之前，确定施用任意剂量的免疫调节剂之前来自患者的细胞样本中Tms细胞和/或Trff细胞的基线测量。在另一个实施方式中，免疫调节剂是如上述所定义的。本发明的第五方面提供TMg细胞作为患者中使用了免疫调节剂的肿瘤治疗疗效标志物的用途。本发明的第六方面提供Tms细胞和T效应细胞之间的比例、或介导免疫激活的分子和抑制的分子之间的比例作为患者中使用了免疫调节剂的肿瘤局部治疗疗效标志物的用途。
在本发明的第五和第六方面的实施方式中，肿瘤的治疗包括CTLA-4抑制剂(在肿瘤的位置或附近)的局部施用。在另一个实施方式中，免疫调节剂是如上述所定义的。如此处所用，除非上下文明确指明，否则单数形式“一”、“一个”和“这个”包括复数指代。因此，例如，参考“一个抗体”包括多个这种抗体，并参考“这种剂量”包括一种或更多种剂量及其本领域技术人员已知的等价形式，等。本说明书中明显的在先发表的文件的列表或讨论不应当一定视为承认这些文件是本领域状态的一部分或是一般常识。
本发明的示例性实施方式在如下非限制性实施例中进行描述，并参考如下附图图I :为了阐明体内局部施用的aCTLA-4的最佳浓度，我们使用(A) 3XPBS、(B) 3X30 iig、(C) 3X60 iig和(D) 3X90 iig建立了一个剂量反应实验。疗法发生于2. 5X 105Panc02 细胞皮下接种后 d5、d8 和 dll。CR=完全消失(complete regression)、p. t.=瘤旁。图2 :用30 ii g或90 ii g局部aCTLA-4在肿瘤接种后d5和d8对动物治疗两次。(A)通过FACS分析于dll对脾中Tms细胞⑶4+、⑶25+、FoxP3+)的量进行定量，在接受更高剂量aCTLA-4 (平均值*P〈0. 05)的小鼠这一群体中有显著的增加。(B)为了测试其功能性，于dll从脾分离Treg细胞(⑶4+⑶25+)按照相对于应答细胞(⑶4+⑶25-)的不同比例混合两天。所有治疗组中的Tms细胞显示应答细胞增殖的剂量依赖性抑制。数据代表了两个3只小鼠/组的代表性实验中的一个(平均值土SEM)。图3 :小鼠于d0天接受2. 5X105Panc02细胞的皮下注射，并用aCTLA-4，200 ii g/剂量i. p.和30 u g/剂量p. t.于d5、d8和dll进行治疗。在携带实验性胰腺肿瘤的动物中，甚至在比系统性注射剂量低七倍的剂量时，延长生存。数据代表来自两个单独实验的累计结果(p〈0. OOOli. p.或 p. t. aCTLA-4 与 PBS 对照比较)。图4:局部aCTLA-4诱导系统性抗肿瘤作用。建立双肿瘤模型，其中(A)
2.5X105Panc02细胞或(B)3 X 105MB49细胞接种于动物的各侧肋腹。在Panc02模型中d5、d8和dll以及MB49模型中d8、dll和dl4用局部(30 u g) aCTLA-4进行治疗。 图5 :在用3 X 200 ii g系统性和3 X 30 ii g的aCTLA-4疗法的局部施用注射的具有Panc02肿瘤的小鼠中评价多种自体免疫性副作用。用2. 5X105Panc02的肿瘤接种始于dO，并且疗法于d5、d8和dll。(A)于dl5从小鼠取血浆，通过ELISA测量抗核抗体(ANA)。(B)在最后的治疗后四天记录脾的重量(dl4) (C)代表性的胃肠组织切片。1)PBS处理的小鼠的正常的胃黏膜。2)接受系统性aCTLA-4疗法的动物。前胃(左)是正常的，但是邻近限制脊(limiting ridge)的腺黏膜显著增厚，表现出黏膜肥大和增生的斑块样变化(箭头)。黏膜和病灶下黏膜下层的基底部分被白细胞局部地浸润(星号)。比较斑块中和正常胃黏膜的黏膜厚度(右)。3)在2)中斑块样变化的细节(星号)。腺体基底的固有层和黏膜下层表现出众多浸润的白细胞，主要是中性粒细胞。4)在2)中斑块样变化的细节。腺颈在原位看起来组织凌乱，表现出散在的有丝分裂(箭头)。i.p.组中五只动物中的四只、P. t.组的五分之一以及对照组的五分之一经历急性胃炎(n=5)。图6.用2. 5X105Panc02细胞处理动物，并用30 ii g的aCTLA-4和/或30 ii g的a41BB于第5、8和11天局部注射进行治疗。(A)在不同治疗组中的平均肿瘤生长。(B)生
存。 图7.在(A和B) TDLN和(C和D)肿瘤中T效应细胞和Tms细胞之间的比例。显示CD4 (A和C)与CD8 (B和D)效应细胞。图8.在(A)TDLN和(B)肿瘤中MdSC的定量。(C)不同的疗法后TOL-I在CD45细胞(主要是肿瘤细胞)上的表达。图9.系统性施用增加剂量的CTLA-4阻断剂之后，抗肿瘤作用、Treg细胞/Teff细胞比例和毒性作用(irAE)之间的关系。图10.局部施用增加剂量的CTLA-4阻断剂之后，抗肿瘤作用、TMg细胞/Trff细胞比例和毒性作用(irAE)之间的关系。
具体实施例方式实施例A材料和方法细胞系Panc02 细胞(鼠管腺癌)由 R. Heuchel 博士友情提供(Karolinska UniversityHospital, Sweden)。细胞培养于补充有10%FBS、ImM丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素(GibcoWADMEM+GlutaMax中，并在37 °C下5%C02中孵育。于1984年通过将带有3-甲基-胆蒽的棉线植入雌性C57BL/6小鼠的胰腺组织通过化学诱导建立Panc02细胞系。这对广泛的细胞毒性剂高度不敏感从而模拟其人类的对应体。除了 0. ImM丙酮酸钠和7% 二氧化碳外，鼠膀胱癌的细胞系MB49 (小鼠膀胱-49 ；K. Esuvaranathan博士馈赠，NationalUniversity of Singapore, Singapore)在相似条件下培养。MB49 是来自 C57BL/6 雄性小鼠的致癌诱导的移行细胞癌。动物雌性C57B1/6 小鼠获自 Scanbur B&K (SoIlentuna, Sweden),实验起始时重18-20go在Rudbeck Animal Facility饲养动物并由工作人员根据当地规定照顾动物。所有动物实验得到当地动物伦理委员会的批准(Dnr: C91/8, C163/8)。治疗剂
拮抗性鼠-抗-鼠CTLA-4抗体(克隆9D9)购自BioXCell (WestLebanon，NH，USA)。抗体用PBS稀释成比有效剂量高十倍的储备液；2mg/ml用于腹腔内(i.p.)注射，0. 3mg/ml、0. 6mg/ml 或 0. 9mg/ml 用于瘤旁(p. t.)注射。在组合疗法实验中，使用如下治疗剂大鼠IgG (BioLegend, San Diego, CA，USA)、仓鼠-a -小鼠 CTLA-4,克隆9H10 (BioLegend, San Diego, CA, USA)和大鼠-a -小鼠4-1BB,克隆3H3 (R Mittler 友情提供，Yerkes Research Center, Atlanta, GA, USA)0体内实验设计为了在小鼠模型中模拟PDAC，在雌性C57BL/6小鼠右后腿中于第0天皮下(s. c)接种2. 5X105Panc02细胞。在研究相同肿瘤远端作用的实验中，2. 5X105Panc02或3X105MB49细胞分别注射于各动物的右侧肋腹和左侧肋腹。以三天的间隔，施用100 ill抗体储备液/剂量(i.p. :200 ug, p. t. :30^，60^或90^每小鼠)三或六次。对于Panc02模型肿瘤注射后于第5天起始疗法，而对于MB49模型于第8天。在研究对无关肿瘤的远端作用的实验中，相同数目的细胞2. 5X105Panc02细胞和MB49接种于相同动物的 各侧肋腹。对于这种肿瘤模型，疗法起始于第5天，否则使用如前面所述的相同剂量计划。整个实验过程监测肿瘤生长和生存。用卡尺测量肿瘤体积，并通过椭球体积公式进行计算=4/3* ii *a (长)*b (宽)*c (深)。对于再处理实验，用2. 5 X 105Panc02细胞在初始生长位置的对侧肋腹注射小鼠并观察一段时间。如果肿瘤超过Icm3或如果发生溃疡，则处死小鼠。对于组合疗法，在第0天s. c注射2. 5X105Panc02细胞来建立肿瘤处理。用30 ii gaCTLA-4 (⑶152)阻断抗体和/或30 y g a41BB (⑶137)激动抗体每三天(6天和9天)进行局部治疗。在第13天处死动物，并分离血、肿瘤引流淋巴结(TDLN)和肿瘤。FACS 分析为了定量脾和肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的Tms细胞，根据制造商的操作，针对表面受体⑶4 (BioLegend)和CD25 (BD Bioscience)对细胞进行染色以及对于FoxP3(BioLegend)对细胞进行细胞内染色。用FACSCalibur或LSRII (BDBiosciences)流式细胞仪分析样本。用FlowJo软件(TreeStar)进行数据分析。 功能性Tms细胞抑制分析动物经历在肿瘤接种后第5天和第8天瘤旁aCTLA-4的两次治疗。最后一次治疗后三天(dll)，在如下组中小鼠实施安乐死并从动物中分离脾PBS、30ii g和90ii gaCTLA-4。通过MESH膜(70 iim，BD Bioscience)对脾过滤两次来分离脾细胞。用PBS洗涤膜，并在收集的单细胞混悬液中裂解红细胞(Pharm Lyse, BDBioscience Pharmingen)。根据制造商的操作，通过CD4+细胞(MACS，Milteny)的第一负筛选和CD25+细胞(MACS，Milteny)的随后正筛选来纯化调节性T细胞(TMg细胞)。当对⑶4和⑶25染色时，富集的Treg细胞群含有39-55%之间的T,eg细胞。85-95%的这些T,eg细胞是FoxP3+。从三只动物中分离的Treg细胞进行合并来获得足够的材料。按照上述分离来自首次接受试验的小鼠的CD4+CD25脾细胞(应答细胞)，并根据制造商的操作用5 ii M CFSE标记。对于96孔板中不同的治疗组设置三个不同的Tms细胞对应答细胞(Tmsp)的比例。FACS分析之前，在补充有I U g/mlaCD3 (Pharmingen，克隆17A2)和 g/ml aCD28 (BioLegend，克隆E18)的 RlO 培养基(RPMI 1640、100U/ml 青霉素和 100U/ml 链霉素、10mMHEPES、50 y MP -巯基乙醇(Gibco)和10%FBS)中在37°C下和5% 二氧化碳中孵育细胞2天。针对⑶3表达对细胞进行染色并确定增殖的CD3+细胞的百分比。自体免疫时间的研究根据制造商的操作，用ANA ELISA试剂盒(USBiological, Swampscott, MA)检测血浆中的抗核抗体(ANA)。通过尾静脉切口或通过心穿刺术将血收集于含有肝素的管中。血浆保存于_80°C。样本按双份进行，如果水平是首次接受实验的对照的两倍，则ANA水平被认为是阳性的。石蜡包埋之前，分离靶器官并用4%甲醛固定。用H&E对切片(5-10 ym)进行染色，并由有经验的病理学医师评价白细胞浸润。为了最佳的客观性，所有样品是盲法的。使用Nikon E600显微镜和Nikon数字相机DXM 1200 (Japan)拍照片。统计分析(使用GraphPad prism4. 03 版本软件(GraphPad Software, Inc.，CA, USA)进行统计分析)MS 局部aCTLA-4是有效的，但是提高的剂量不改善疗法抗CTLA-4 (aCTLA-4)疗法大多通过i. v或i. p.注射进行系统性地应用，使用局部的aCTLA-4疗法的两种发表的研究是表达aCTLA-4抗体的细胞系结合Treg细胞抑制19或结合GM-CSF表达肿瘤24的实验。aCTLA-4的单次高剂量局部施用被报道无效19。我们假设局部aCTLA-4可能有一个常规的剂量反应曲线，并用已建立的Panc02肿瘤设置实验，用aCTLA-4的三种不同剂量治疗Panc02肿瘤。起始于第5天，每三天p. t.注射30 u g、60 u g或90 yg的aCTLA-4，重复总共三次。如图I中所说明的，局部疗法没有见到明确的剂量反应曲线。相反地，抗体的最高剂量(90 ii g)显示出没有30ii g的最低剂量有效。在接受更高剂量的局部aCTLA-4的小鼠中Treg细胞水平进一步提高为什么更高剂量的aCTLA-4对于疗法没有更多的益处的一个假设可能是90 ii g的aCTLA-4刚好在诱导局部TMg细胞的阈值之上。为了测试这一点，我们从分别接受30 u g和90iig aCTLA-4疗法的两种剂量的小鼠的脾中分离TMg细胞。离体研究TMg细胞的数目以及功能。如图2A所描述的，随着提高的aCTLA-4剂量，Treg细胞有显著的提高(平均值*p〈0. 05)。T,eg细胞抑制应答细胞(来自首次接受实验的小鼠的CD4+CD25脾细胞)的能力在所有治疗组中同等有效(图2B，平均值土SEM)。还研究了对照细胞(来自治疗的动物的CD4+CD25-)的抑制能力，但是没有展示任何应答细胞的增殖抑制(数据未显示)。因此，更高剂量的局部aCTLA-4在这一实验模型中诱导功能性TMg细胞。因此，从治疗角度以及成本效益角度来看30 ii g aCTLA-4显得最佳。局部和系统性aCTLA-4疗法的比较由于aCTLA-4的最低剂量是治疗有效的，我们进一步比较了 30yg局部注射的aCTLA-4和之前证明有效的200 u g aCTLA-4的系统性剂量(Mangsbo等人，2010，J.Immunother. 33(3) :225-235)。隔三天进行注射，于肿瘤接种后的d5、d8和dll。与PBS治疗的动物(未显示)相比，系统性和局部施用都产生了有效的抗肿瘤作用。长期生存与来自肿瘤测量的结果平行，局部以及系统性aCTLA-4疗法均延长了生存(图3，***P〈0. OOOli.p.或p. t. aCTLA-4与PBS对照组相比)。为了研究是否与治疗途径无关的治愈小鼠表现出肿瘤免疫，我们对小鼠进行再处理，并观察到完全的Panc02肿瘤排斥。因此，系统性和局部aCTLA-4施用之后均证明了肿瘤免疫(数据未显示)。
局部aCTLA-4疗法对远端肿瘤产生抗肿瘤作用由于在用局部aCTLA-4治疗的小鼠中再处理证明了肿瘤免疫，我们假设局部疗法诱导系统性抗肿瘤作用。为了研究这一点，建立了肿瘤模型，其中肿瘤生长于个体小鼠的右侧肋腹和左侧肋腹。使用了两个不同的实验模型；在每个小鼠上两个Panc02肿瘤或两MB49肿瘤，只有右侧的肿瘤经受P. t. aCTLA-4注射。给药方案与Panc02模型先前实验的相同，其中MB49模型的治疗发生于d8、dll和dl4。局部治疗后，对相同小鼠的两个肿瘤测量肿瘤大小并观察肿瘤的缩小(MB49模型中最突出)，如图4所示。在另一个2-肿瘤模型中，两个不同类型的肿瘤接种于相同的动物。因此，Panc02细胞注射到右侧肋腹，而MB49细胞生长于左侧肋腹。如材料和方法章节中所述，采用相同的给药方案。有趣的是，右侧Panc02肿瘤的局部aCTLA-4治疗显著减少了左侧MB49肿瘤的肿瘤生长(d25*P〈0. 05，与PBS相比，MB49肿瘤的局部治疗，**P〈0. 01与PBS相比，对侧Panc02肿瘤的治疗)。 用局部CTLA-4阻断减少的自体免疫事件当使用aCTLA-4疗法干扰T细胞耐受时，以自体免疫形式的不利副作用是常见的。由于两种不同的治疗方案都诱导系统性抗肿瘤作用，重要的是研究与维持的抗肿瘤作用的系统性注射相比，局部注射是否可减少副作用。为此，先用30 y g局部aCTLA-4注射或200 ii g系统性aCTLA-4施用以三天的间隔对小鼠进行三次治疗。最后的治疗之后四天处死动物，进行各种分析ANA、靶器官的免疫组织化学、ALAT水平以及脾、TDLN和胸腺的重量。如果是首次接受实验的对照小鼠的两倍，则ANA水平被认为是阳性的。图5A说明用系统性aCTLA-4治疗的10只小鼠中的5只显示阳性ANA水平，而局部治疗的10只小鼠中只有2只显示阳性AM。在PBS对照组中，没有动物有阳性ANA (P〈0. 05，所有组的卡方检验、列联表；ANA相对于无ANA)。与对照组相比，在用系统性注射治疗的组中脾重量增加(*P〈0. 05,非配对t检验，n=4)图5B。这种重量的增加不存在于用低剂量局部aCTLA-4治疗的小鼠中(P>0. 1，非配对t检验)。在i.p.组中5只小鼠中的4只、在局部aCTLA-4组中五分之一以及对照组中五分之一表现出胃炎图5C。这种胃炎的病因尚未确定，但“自发性”胃炎在小鼠中是不常见的。组合疗法不幸的是，剂量反应实验限制了进一步提高aCTLA-4剂量的任何尝试，但是为进行包括低剂量aCTLA-4计划的组合疗法打开了机会。肿瘤生长和生存在这些实验中，拮抗性(aCTLA-4)和激动性(a_4_lBB)抗体用于已确立的Panc02肿瘤的治疗。4-1BB (⑶137)属于TNFR超家族，由激活的T细胞、NK细胞和DCs表达。其配体4-1BBL (⑶137L)出现在激活的APC和组织中。我们假设使用刺激T效应细胞以及阻断抑制性检查点(checkpoints)的抗体组合将进一步增强抗肿瘤疗法。图6显示与任何个体治疗相比，用激动剂加上拮抗剂的组合进行治疗，肿瘤负担的减少以及整体存活的提高。T效应细胞和Treg细胞的比例肿瘤免疫疗法的目的是使抑制机制的优势(TMg细胞、IL-10、TGFb等)向效应机制(如CD8、IFNg等)倾斜。这有希望通过提高效应细胞类型/分子的水平和/或降低抑制细胞/分子的水平来实现。通过研究肿瘤、TDLN、脾和血中这种效应细胞/抑制细胞比例，有可能客观地显现不同治疗的免疫作用并预测肿瘤结果。图7显示当在这种肿瘤模型中组合刺激性和阻断性抗体时，TDLN和肿瘤中清晰的免疫激活趋势。这组实验所用的治疗是大鼠 IgG (BioLegend, San Diego, CA，USA)、小鼠-a -小鼠 CTLA-4，克隆9D9(BioXCell, West Lebanon, NH, USA)和大鼠-a -小鼠 4-1BB，克隆3H3 (R Mittler 友情提供，Yerkes Research Center, Atlanta, GA, USA)。对其它抑制细胞类型的作用胰腺癌中发现的一种常见抑制细胞类型是髓源性抑制细胞(MdSC)，此处定义为⑶llb+Gr-1+。通过分泌抑制性细胞因子(如IL 10、TGFP )、T细胞的代谢剥夺(如精氨酸酶-I、NOS、ID0)以及其它抑制性细胞类型的刺激(如Treg细胞、Thl7)，MdSC可诱导肿瘤内的抑制性微环境。图8显示在(A) TDLN和(B)肿瘤中MdSC的定量。其显示含有a41BB±aCTLA4的方案提高LN中MdSC，而aCTLA4单独不显示提高。相反，组合的抗体方案不将肿瘤中MdSC数目提高到PBS对照以上。 PD-Ll是外周耐受的重要调节因子并表达于免疫细胞、非造血细胞以及很多肿瘤上。PD-Li结合至T细胞上的ro-i，从而递送负信号。据信，实体肿瘤利用ro-Li作为逃逸机制，并且这种分子受IFN Y刺激的向上调节。图SC证明不同疗法之后在⑶45-细胞(主要是肿瘤细胞)上的ro-Ll表达。事实上，最强的抗肿瘤组合a41BB+aCTLA4产生⑶45-(上皮，肿瘤)细胞上的I3D-Ll最高表达，可能通过激活的T细胞影响IFNg的局部释放。讨论之前发现抗CTLA-4疗法在不同的鼠肿瘤模型中是有效的。然而，对由这种重要的免疫检查点的局部瘤旁抑制所诱导的系统性作用的更深层研究尚未进行。因此，我们决定在集中于实验性胰腺肿瘤模型的两个不同肿瘤模型中评价局部aCTLA-4疗法的作用。令人惊讶的是，我们发现，提高的aCTLA-4的量产生反向剂量反应曲线。当评价用30 y g或90 y gaCTLA-4治疗的动物的脾中的TMg细胞时，我们在更高的剂量之后发现这种类型的更加功能性细胞。Kavanagh等人报道系统性aCTLA_4的施用以剂量依赖性的方式在人当中导致提高的Tms细胞水平25。这种数据可有助于解释图I中我们的剂量和肿瘤生长曲线之间的反向相关以及增加的Treg细胞群(图2)。因此局部阻断在肿瘤区域可导致高浓度的aCTLA-4，并作为结果导致局部Tms细胞的堆积。反向或J形剂量反应曲线确实存在，放射疗法是一个实例。低剂量放射主要消除抑制细胞，而高剂量导致系统性免疫抑制，并可能导致肿瘤发展。由于施用三次每次剂量30 ii g aCTLA-4导致明显的抗肿瘤反应，这种疗法与系统性施用aCTLA-4的已知有效剂量进行比较(Mangsbo等人，提交的稿件)。局部施用与系统性aCTLA-4疗法在肿瘤降低和生存方面是同等强效的，但是剂量低七倍(图3)。不幸的是，剂量反应实验限制了进一步提高aCTLA-4剂量的任何尝试，但是为进行包括低剂量aCTLA-4计划的组合疗法打开了机会。为了评价局部疗法是否对远端肿瘤具有作用，我们检测了两个不同的双肿瘤模型，其中在小鼠的每侧肋腹接种一个肿瘤。在第一个实验中，我们使小鼠各携带两个Panc02肿瘤或两个MB49肿瘤，并评价i. p.相对于p. t. aCTLA-4疗法的作用。由于用局部疗法证明了系统性作用，我们进而分析局部或系统性aCTLA-4疗法可能的不利作用。在人当中抗CTLA-4的施用揭示了患者可能经历自体免疫的副作用。治疗后检测到抗核抗体。自体免疫的不利事件似乎与改善的整体生存有关，但这目前仍是争议的问题26。由于我们已经用局部aCTLA-4疗法建立了抗肿瘤作用，我们力求阐明与系统性治疗相比毒性是否减弱。事实上，局部aCTLA-4疗法之后我们并没有观察到脾肿大也没有观察到增加的ANA水平，系统性疗法之后检测两者(图5)。此外，与PBS和局部治疗组中的5只小鼠中的I只相反，在用系统性aCTLA-4疗法治疗的5只小鼠中的4只中表现出急性胃炎。用局部CTLA-4阻断治疗的小鼠具有减少的副作用的事实还由Simmons和同事们显示24,然而使用的是肿瘤分泌aCTLA-4抗体。两个不同的组评价了使用表达CTLA-4抗体的肿瘤细胞的可能性。Tuve等人19描述了来自杂交瘤UC10-4F10-11 (生产仓鼠aCTLA-4抗体的杂交瘤)的重和轻链的克隆并证明对于有效的疗法和持久的抗肿瘤记忆对aCTLA-4的局部连续生产的需求。他们还系统性地以及局部地施用了仓鼠aCTLA-4但是声称没有对肿瘤生长的显著作用。这与我们目前的数据完全相反，其显示系统性和局部aCTLA-4疗法后强烈的治疗作用。可能解释这些差异 结果的因素是肿瘤模型、治疗计划、给药和抗体克隆。仓鼠抗体的系统性长期(29天期间10次，150 u g每次)施用可能允许中和抗反仓鼠抗体的产生和药物消除。此外，在肿瘤区中高剂量200 u g的aCTLA-4可能不是最佳的给药，如图I证明提高的局部剂量导致差的抗肿瘤作用。Simmons等人24采用与我们所用的相同的克隆(克隆9D9，小鼠抗小鼠CTLA-4抗体)，并证明用两种aCTLA-4剂量组合放射的GM-CSF-表达肿瘤细胞进行局部治疗后明显的抗肿瘤作用。然而，他们没有研究低局部剂量aCTLA-4单独是如何影响肿瘤生长的。我们的数据证明在两个不同肿瘤模型中有可能以低的剂量瘤旁采用aCTLA-4抗体，具有较少的副作用但是有系统性抗肿瘤作用。目前的观察强调在临床中针对这种类型疗法确认最佳给药计划的重要性，因为我们的数据表明一种复杂的剂量反应关系。抑制性肿瘤环境的逆转可导致效应细胞(主要是细胞毒性T淋巴细胞)的增加，以及抑制性免疫细胞(如Tms细胞)的降低。有趣的是我们发现在脾中Treg细胞在T细胞群中的比例，在局部低剂量治疗组中比在局部更高剂量治疗的组中更低(图2)。因此，更低的局部施用的剂量导致的更低的Tms细胞百分比与更好的抗肿瘤作用相关(图I)。这种施用的局部剂量和生物标志物(Treg细胞比例)之间的关系以及随之(相反地)与发现的整体生存 (抗肿瘤疗效)的相关性可能是非常重要的。首先，这对于确定局部抗肿瘤治疗方法的最佳剂量方案可能是有价值的。并且，其可能还用作动态生物标志物(和临床试验中的替代终点)来监测局部免疫疗法干预/过程/方法的治疗疗效。打破肿瘤耐受和转换抑制性肿瘤环境可能需要一种以上免疫检查点调节因子的免疫调节。最近已证明使用系统性的不同免疫调节剂的组合，高剂量治疗比相应的单一疗法更有效(综述3'27'28)。与免疫调节剂疗法组合的试验包括I)与已建立的疗法的组合，以及2)不同免疫调节剂靶之间的组合。然而，当涉及到局部免疫调剂治疗时，在局部情况(setting)中只评价了极少数的组合(Jackaman等人和Simmons)。我们假设,使用了含阻断免疫检查点调节因子的蛋白质药物的低剂量方案与免疫刺激分子组合的治疗将导致改善的患者益处(更高的抗肿瘤疗效和更低的毒性)。当阻断分子和免疫刺激分子靶向共同受体时，这可能是特别有效的，之前在局部免疫疗法情况中没有评价过。可以想象，如此处所述，缓释基质和/或载体颗粒将进一步改善组合的低剂量局部抗肿瘤免疫疗法。事实上，由于治疗分子受控浓度的延长的时间，缓释基质和/或载体颗粒特别适合局部低剂量免疫疗法的治疗并可能改善疗效。这可能减少给药的频率，从而增加患者的方便，此外还将系统性泄漏风险降到最小从而系统性副作用降到最小。此外，如果治疗性蛋白质固定在颗粒的表面，载体颗�？墒沟么碳ば允芴�(如CD40)的更高级别的交联。还有例如通过特定细胞或仅在特定的PH时增强生物分布和颗粒吸收的潜能。纳米颗粒，即具有直径约IOOnm的颗粒，是免疫疗法领域中具有巨大潜力的新型工具。它们可以被用来作为高效的蛋白质转运体，附着于表面或包囊在颗粒中。对于所载生物分子的持续释放以及对于抗原呈递细胞的激活来诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应
(29)，不同的纳米颗粒变体已经显示了巨大的潜力。最近，已经开发了一种基于自我组装的两亲性聚合的聚(Y-谷氨酸)(Y-PGA)颗粒的新型蛋白质递送系统。相比以前开发的纳米颗粒，它们有高包囊疗效，它们是稳定的(可冷冻干燥储存)，并且这些纳米颗粒对于此处所述的免疫疗法治疗可提供优良的载体。参考文献 I. Stagg, J. , Johnstone, R. W. , &Smyth, M. J. From cancer immunosurvei I lance tocancer immunotherapy. Immunol Rev. 220:82-101. , 82-101 (2007).2. Me I i e f , C. J. Cancer immunotherapy by dendritic cells.Immunity. 29，372—383(2008).3. Melero, I.，Hervas-Stubbs, S.，Glennie, M.，Pardoll, D. M.，&Chen，L.Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy.Nat RevCancer. 7，95-106 (2007).4. Waldmann, T. A. Effective cancer therapy through immunomodulation. Annu.Rev Med. 57:65-81.，65-81 (2006).5. Kh aw Ii，L. A.，Hu，P.，&Epstein，A. L. Cytokine, chemokine，andco-stimulatory fusion proteins for the immunotherapy of solid tumours. Handb.Exp. Pharmacol. 181:291-328(2008).6. Berinstein, N. L. Enhancing cancer vaccines with immunomodulators.Vaccine. 25 Suppl 2:B72_88.，B72-B88(2007).7. Mellor，A. L. &Munn，D. H. Creating immune privilege:activelocal suppression that benefits friends,but protects foes.Nat RevImmunol. 8，74-80 (2008) 8. Totterman, T. H. , Loskog, A. , &Essand, M. The immunotherapy of prostate andbladder cancer. BJU. Int. 96，728-735 (2005).9. Waldmann, T. A. Effective cancer therapy through immunomodulation. Annu.Rev Med 57，65-81 (2006).10. Shaker, M. A. &Younes，H. M. Interleukin-2 : Evaluation of routes ofadministration and current delivery systems in cancer therapy. J PharmSci. 98(7) :2268-98(2009).11. Den, 0. W.等人 Local therapy of cancer with free IL-2. Cancer ImmunolImmunother. 57，931—950(2008).
12. De Groot, C. J.，Cadee，J. A.，Koten，J. W.，Hennink，W. E.，&Den，0.W. Therapeutic efficacy of IL-2—loaded hydrogels in a mouse tumour model. Int. JCancer. 98，134-140(2002).13. van Mierlo, G. J.等人 CD40 stimulation leads to effective therapy ofCD40 (-)tumours through induction of strong systemic cytotoxic T lymphocyteimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99，5561-5566 (2002) 14. van Mierlo, G. J.等人Activation of dendritic cells that cross-presenttumor-derived antigen licenses CD8+CTL to cause tumour eradication. J Immunol173，6753-6759(2004).15. Jackaman，C.等人 Deliberately provoking local inflammation drivestumours to become their own protective vaccine site. Internationalimmunology. 20，1467-1479(2008).
16. Davis, S. J.等人 The nature of molecular recognition by T cells. NatImmunol. 4，217-224(2003).17. Lee, K. M.等人 Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4.Science282，2263-2266(1998) 18. Kwonj E. D.等人 Manipulation of T cell costimulatory andinhibitory signals for immunotherapy of prostate cancer. Proc. Natl. Acad. SciU. S. A. 94，8099-8103(1997).19. Tuvej S.等人 Combination of tumour site-located CTL-associatedantigen_4blockade and systemic regulatory T—cell depletion inducestumor-destructive immune responses. Cancer Res. 67, 5929-5939 (2007).20. van Horssen，R.，Ten Hagen, T. L，&Eggermont，A. M. TNF-alpha in cancertreatment:molecular insights,antitumour effects,and clinical utility.Oncologist. 11，397-408(2006).21. van Herpen, C. M.等人 Intratumoral rhIL-12 administration in head andneck squamous cell carcinoma patients induces B cell activation. Int. J Cancer123，2354-2361(2008).22. van Herpen, C. M.等人 Pharmacokinetics and immunological aspectsof aphase Ib study with intratumoral administration of recombinant humaninterleukin-12 in patients with head and neck squamous cell carcinoma:adecrease of T-bet in peripheral blood mononuclear cells.Clin Cancer Res9，2950-2956(2003).23. Johnson, E. E.等人 Intratumoral immunocytokine treatment results inenhanced antitumour effects. Cancer Immunol Immunother. 57,1891-1902(2008).24. Simmons, A. D.等人 Local secretion of anti-CTLA_4enhances thetherapeutic efficacy of a cancer immunotherapy with reduced evidence ofsystemic autoimmunity. Cancer Immunol Immunother 57，1263-1270 (2008) 25. Kavanagh, B.等人 CTLA4 blockade expands FoxP3+regulatoryand activated effector CD4+T cells in a dose-dependent fashion.Blood112， 1175-1183(2008).26. Yang, J. C.等人 Ipilimumab (anti_CTLA4 antibody) causes regression ofmetastatic renal cell cancer associated with enteritis and hypophysitis. JImmunother 30，825-830(2007) 27. Melero, I.等人Palettes of vaccines and immunostimulatory monoclonalantibodies for combination. Clin Cancer Res 15, 1507-1509(2009).28. Zhang, T. &Herlyn, D. Combination of active specific immunotherapyor adoptive antibody or lymphocyte immunotherapy with chemotherapy in thetreatment of cancer. Cancer Immunol Immunother 58, 475-492 (2009).29. Akagi, T. , Wang, X. , Uto, T. , Baba, M. , Mkashi, M. Protein direct deliveryto dendritic cells using nanoparticles based on amphiphilic poly (amino acid) derivatives. Biomaterials 28,3427-3436(2007).实施例B介绍恶性黑色素瘤和肾细胞癌已经成文免疫疗法的焦点，因为其固有的免疫原性以及对常规治疗的反应不佳。目前的研究关注如何逆转免疫抑制性的肿瘤微环境，使用免疫治疗策略目的在于I)激活专门的抗原递呈细胞(APC)比如树突细胞(DC)，通过如⑶40、⑶137或Toll 样受体(TLR)，2)使用细胞因子，比如IL-2、IL-12和干扰素来刺激淋巴细胞，或3)通过靶向如细胞毒性T-淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)或抑制性受体程序性死亡I(PD-I)来阻断抑制T细胞激活的信号1A通过结合CTLA-4和阻断其与B7_l/B7_2的相互作用，通常使T细胞失活的信号途径被阻断。从而，肿瘤特异性T细胞保持激活/被激活。通过使用局部免疫疗法，位于肿瘤区域(如肿瘤、邻近组织和肿瘤引流淋巴结)的占绝大多数的肿瘤特异性T细胞被激活。局部施用激活更低数目的T细胞,但是激活的T细胞与肿瘤细胞消除更加相关。众所周知，T细胞一旦充分激活可以巡查整个身体，消除展示特定抗原的细胞，在这种情况下只有肿瘤细胞共有的特定抗原。众所周知，这种激活的T细胞导致记忆性T细胞的产生，从而产生可以防止肿瘤复发的长期记忆(Janeway' s “ Immunobiology” Seventh edition, GarlandScience).因此局部CTLA-4拮抗剂治疗的结果是肿瘤特异性T细胞的激活，肿瘤特异性T细胞可以杀灭治疗的肿瘤以及远端的转移、还防止复发9_n。局部施用方案，其中最佳剂量是由TMg细胞和Teff细胞的比例所指导的，提供最佳的抗肿瘤作用，并允许施用这样的总剂量，其远远低于系统性治疗患者时给出的总剂量，从而降低免疫相关不良事件的风险(irAE)。然而，使用此处所述的局部治疗方法，在肿瘤区域的CTLA-4拮抗剂的浓度可以，高于系统性给出的浓度。这种剂量受到所诱导的irAE的限制。因此，与CTLA-4拮抗剂的系统性施用相比，我们可以更强地激活位于肿瘤区域中的肿瘤特异性Trff细胞。
系统性抗CTLA-4治疗是由毒性副作用(irAE)所限制的剂量。CTLA-4拮抗剂的系统性治疗与irAE、腹泻、肠炎、皮炎等有关，其影响60%的治疗的患者9、13-17，并致死约1%。这要求对患者症状进行密切观察，并且由于副作用的治疗可能需要住院9。这对于患者是不方便的、增加治疗费用并限制治疗疗效。从抗肿瘤的角度看，这意味着最大有效剂量可能要更高，但系统性治疗受限于产生的系统性毒性。一个将系统性副作用降到最低却保持或甚至改善系统性抗肿瘤作用的有前景方法是使用CTLA-4阻断剂的局部施用。局部治疗将导致更少数目的T细胞将被激活，但是激活的T细胞主要是暴露于并因此与肿瘤细胞抗原反应的T细胞。这种方法允许产生更高局部浓度却仍然产生更低系统性毒性的剂量。系统性CTLA-4治疗的抗肿瘤作用的开始被延迟，并且标准的反应准则比如实体肿瘤的反应评价准则，RECIST，在预测这种类型免疫疗法的结果时不是非常有效。RECIST准则开发用来评价有直接的抗肿瘤作用的药物，不适合免疫疗法的治疗操作。直接的反应模式并不少见；然而，初步进展后往往有延迟反应。目前还缺乏有效地预测对CTLA-4治疗反应的生物标志物。 此处所述的本发明提供一种确定局部CTLA-4阻断剂最佳剂量的方法，当在癌症免疫疗法中产生高度有效的抗肿瘤反应时是安全的。方法设计个性化最大有效剂量方案的方法最佳有效剂量可能是个体的，并因此在患者间不同，例如由于基因型、治疗前的情况(如之前的无关治疗)、免疫状况、年龄以及肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分期和其它肿瘤特异性特征的差异。最佳剂量还可能在个体内不同，如由于靶的向上/向下调节、治疗诱导的耐受、免疫状况、年龄以及与肿瘤位置、肿瘤大小及肿瘤分期。实验操作I.治疗前从符合条件的患者中取血样和/或肿瘤活检和/或肿瘤引流淋巴结活检
来建立基线TMg/Teff比例。2.通过流式细胞分析和或组织化学测量T,eg/Teff比例。i.通过标志物比如但不限于⑶25、⑶4、⑶3和FoxP3来鉴别和定量Treg细胞。ii.通过标志物比如但不限于⑶3、⑶4、⑶8、IFNgamma、颗粒酶B、ICOS来鉴别和
定量Trff细胞。iii.使用标准操作监测免疫相关的不良事件如肠炎、皮炎等。3.用免疫调节剂肿瘤内治疗患者(优选CTLA-4-阻断剂单独地或与直接免疫激活齐IJ(比如⑶40激动剂或IL2、或IL-15)组合)。根据临床前和/或临床研究确定免疫调节剂的初始剂量。4.治疗后4周取血样和/或肿瘤活检和/或肿瘤引流淋巴结活检(可以想象，从几天到几个月)。5.如第2部分所述，通过流式细胞分析和或组织化学测量T,eg/Teff比例。6.与之前的测量相比，如果UTeff比例降低，并且没有严重的免疫相关的不良事件，免疫调节剂的剂量(按mg/kg)提高I. 5至3倍(或更多)。如果TMg/I；ff提高了，免疫调节剂的剂量(按mg/kg)(优选CTLA-4-阻断剂单独地或与直接免疫激活剂(比如⑶40激动剂或IL2、或11-15)组合)降低I. 5至3倍(或更多)。7.每四周重复步骤5-7 (可以想象，从几天到几个月)。8.通过RECIST准则和/或免疫相关反应准则监测治疗的进展(Wolchok等人，2009Clin Cancer Res; 15 (23) : 7412-742)、和/或生存、和/或无进展生存等。重复治疗周期直至已建立最佳的治疗剂量或已取得完全的反应。随着肿瘤治疗的进展，最佳剂量可能增加或减少，操作将继续用以确保剂量水平是优化的。上述治疗操作/设计的目的是i.确定个体患者的最佳剂量。 ii.监测个体患者随时间的治疗。由于最佳剂量可能会随时间变化(上面指出的原因)这对于局部治疗尤其重要。结果与讨论效应T细胞和调节性T细胞之间比例的测量在确定癌症免疫疗法的治疗中CTLA-4拮抗剂局部施用的最佳剂量方面具有多种意想不到的好处。最佳剂量可确定为在患者中不诱导局部Treg细胞数目上的增加的CTLA-4阻断剂的最大剂量。使用CTLA-4拮抗剂的系统性施用的之前的研究证明常规的剂量反应关系，其中增加的剂量导致增加的抗肿瘤作用，但也增加免疫相关的不良事件(图9)。出乎意料的是，局部CTLA-4-阻断疗法揭示了反向剂量反应关系。局部CTLA-4的阻断导致在肿瘤区域抗CTLA-4药剂的高浓度，结果导致TMg细胞的堆积。局部治疗后1；68细胞的增加可能会抵消T6ff细胞的正向作用。由此可见，最佳剂量对于有效的疗法是关键的，此处显示的数据证明T效应和T调节性细胞之间的比例可用于这一目的。局部施用，其中最佳剂量是由TMg/Trff细胞比例所指导的，提供最佳的抗肿瘤作用，并允许施用这样的总剂量，其远远低于系统性治疗患者时给出的总剂量，从而降低免疫相关不良事件的风险(图10)。参考文献I. Waldmann, T. A. Effective cancer therapy through immunomodulation. Annu.Rev Med 57，65-81 (2006).2. Stagg, J. , Johnstone, R. W. , &Smyth, M. J. From cancer immunosurvei I lance tocancer immunotherapy. Immunol Rev. 220:82-101. , 82-101 (2007).3. Me I i e f , C. J. Cancer immunotherapy by dendritic cells.Immunity. 29，372—383(2008).4. Melero, I.，Hervas-Stubbs, S.，Glennie, M.，Pardol I, D. M.，&Chen，L.Immunostimulatory monoclonal antibodies for cancer therapy.Nat RevCancer. 7，95-106 (2007).5. Waldmann, T. A. Effective cancer therapy through immunomodulation. Annu.Rev Med. 57:65-81.，65-81 (2006).6. Kh aw Ii，L. A.，Hu，P.，&Epstein，A. L. Cytokine, chemokine，andco-stimulatory fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Handb. Exp.Pharmacol. 291-328 (2008).7. Berinstein, N. L. Enhancing cancer vaccines with immunomodulators.Vaccine. 25Suppl 2:B72_88.，B72—B88 (2007) 8. Mellor，A. L. &Munn，D. H. Creating immune privilege:activelocal suppression that benefits friends,but protects foes.Nat RevImmunol. 8，74-80 (2008) 9. Loskog, A. S.，Fransson, M. E.，&Totterman, T. T. AdCD40L gene therapycounteracts T regulatory cells and cures aggressive tumors in an orthotopicbladder cancer model. Clin. Cancer Res. 11，8816-8821 (2005).10. van Mierlo, G. J.等人 CD40 stimulation leads to effective therapy of CD40(-)tumors through induction of strong systemic cytotoxic T lymphocyteimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99，5561-5566 (2002) 11. von Euler, H.等人Efficient adenovector CD40 ligand immunotherapy ofcanine malignant melanoma. J Immunother 31, 377-384(2008).12. Hodij F. S.等人 Improved Survival with Ipilimumab in Patients withMetastatic Melanoma. N. Engl. J Med (2010).13. Ribas, A. Overcoming immunologic tolerance to melanoma:targetingCTLA~4with tremelimumab(CP-675, 206). Oncologist. 13 Suppl 4:10-5. ,10-15 (2008).14. Ribas, A.等人 Tremelimumab (CP-675，206)，a cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development forpatients with cancer. Oncologist. 12，873-883(2007).15. 0，Day, S. J.，Hamid, 0.，&Urba, W. J. Targeting cytotoxic T-Iymphocyteantigen-4(CTLA-4): a novel strategy for the treatment of melanoma and othermalignancies. Cancer. 110，2614-2627(2007).16. Weber, J. S.等人 Phase I/II Study of Ipilimumab for Patients WithMetastatic Melanoma. J Cln Oncol. (2008).I 7. Weber, J. Review: anti-CTLA-4 antibody ip i I imumab : casestudies of clinical response and immune-re Iated adverse events.Oncologist. 12，864-872(2007).
权利要求
1.一种用于确定患者中肿瘤局部治疗的免疫调节剂最佳剂量的方法，包括 Ca)提供来自患者的细胞样本，其中患者已接受测试剂量下的免疫调节剂的肿瘤的局部治疗； (b)测量细胞样本中的TMg细胞数目； (C)必要时，在不同的免疫调节剂测试剂量下重复步骤(a)及(b)来确定在样本中不诱导TMg细胞数目增加的免疫调节剂的最大剂量， 其中最佳剂量确定为不诱导Ireg细胞数目的增加的免疫调节剂的最大剂量。
2.根据权利要求I所述的方法，其中细胞样本选自血液样本、肿瘤活检和肿瘤引流淋巴结活检。
3.根据权利要求I或2所述的方法，还包括测量步骤(b)中的细胞样本中效应细胞的数目，其中最佳剂量确定为在样本中诱导效应细胞数目最大程度的增加而不诱导TMg细胞数目增加的免疫调节剂的剂量。
4.根据权利要求I至3任一项所述的方法，其中最大治疗剂量确定为在样本中与最低的TMg细胞对Trff细胞的比相关的剂量。
5.根据权利要求I至4任一项所述的方法，还包括在步骤(a)之前确定施用任意剂量的免疫调节剂之前来自患者的细胞样本中TMg细胞和/或Trff细胞的基线测量。
6.根据权利要求I至5任一项所述的方法，其中免疫调节剂如权利要求7至48任一项所定义的。
7.一种免疫调节剂，其能够抑制细胞毒性T淋巴细胞抗原4 (CTLA-4)的活性用于患者中肿瘤的局部治疗，其中治疗包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部调节T细胞(TMg细胞)数目增加的最大治疗剂量。
8.根据权利要求7所述的免疫调节剂，其中肿瘤是实体的。
9.根据权利要求7或8所述的免疫调节剂，其中肿瘤是播散性的(即转移的)。
10.根据权利要求7至9任一项所述的免疫调节剂，其中肿瘤选自胰腺、膀胱、皮肤、肾、前列腺、乳腺、淋巴结、卵巢、肺、脑、头、颈、血、骨髓和消化道(胃、结肠、直肠)的肿瘤。
11.根据权利要求10所述的免疫调节剂，其中肿瘤在胰腺、膀胱或皮肤中。
12.根据权利要求7至11任一项所述的免疫调节剂，其中肿瘤的治疗包括免疫调节剂的注射。
13.根据权利要求12所述的免疫调节剂，其中注射是肿瘤内的、瘤旁的、近瘤的、病灶内的和/或肿瘤引流淋巴结中。
14.根据权利要求7至13任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂能够体内结合CTLA-4。
15.根据权利要求7至14任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂包括或由多肽或编码多肽的多聚核苷酸组成。
16.根据权利要求7至15任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂包括或由抗体或抗原结合片段或其衍生物组成。
17.根据权利要求16所述的免疫调节剂，其中抗原结合片段或其衍生物选自Fv片段(如单链Fv、二硫键结合的Fv和结构域抗体)和Fab样片段(如Fab片段、Fab’片段和F (ab) 2片段)。
18.根据权利要求16或17所述的免疫调节剂，其中抗体是单克隆抗体。
19.根据权利要求7至15任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂不是抗体或抗原结合片段或其衍生物。
20.根据权利要求16至18任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂包括或由具有CTLA-4拮抗剂活性的抗CTLA-4抗体、或抗原结合片段或其衍生物组成。
21.根据权利要求7至20任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂是体外蛋白质优化的直接或间接产物。
22.根据权利要求7至21任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂与第二活性剂组合使用。
23.根据权利要求22所述的免疫调节剂，其中第二活性剂是第二免疫调节剂。
24.根据权利要求23所述的免疫调节剂，其中第二活性剂能够体内结合免疫细胞辅助受体。
25.根据权利要求23或24所述的免疫调节剂，其中(第一)免疫调节剂是免疫系统的直接激活因子，而第二免疫调节剂是免疫抑制细胞或事件的抑制剂，反之亦然。
26.根据权利要求25所述的免疫调节剂，其中(第一)免疫调节剂是CTLA-4抑制剂而第二免疫调节剂是细胞因子。
27.根据权利要求22至26任一项所述的免疫调节剂，其中第二免疫调节剂是IL-2。
28.根据权利要求22至25任一项所述的免疫调节剂，其中(第一)免疫调节剂是CTLA-4抑制剂而第二免疫调节剂是CD40激动剂。
29.根据权利要求28所述的免疫调节剂，其中CD40激动剂是具有CD40激动剂活性的抗CD40抗体或抗原结合片段或其衍生物。
30.根据权利要求22至25任一项所述的免疫调节剂，其中第二活性剂是常规的抗癌治疗。
31.根据权利要求30所述的免疫调节剂，其中常规的抗癌治疗选自化疗剂(比如吉西他滨、多西紫杉醇)、放射疗法、手术、癌症疫苗(比如BCG.Melacine )、过继性T细胞转移和Ireg细胞耗竭疗法。
32.根据权利要求7至31任一项所述的免疫调节剂，其中第一免疫调节剂是为了在一段较长的期间内连续释放，而第二次免疫调节剂是为了在短的间歇脉冲内释放，反之亦然。
33.根据权利要求7至32任一项所述的免疫调节剂，其中剂量的患者特异性优化包括以不同的剂量向患者局部施用免疫调节剂，在各剂量之后，测量局部TMg细胞的数目和/或局部TMg细胞对局部效应T细胞(Teff细胞)的比例。
34.根据权利要求33所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂的不同的剂量按照从最低到最闻剂量的顺序施用。
35.根据权利要求33或34所述的免疫调节剂，其中在患者中不诱导局部Ireg细胞数目增加的最大治疗剂量鉴别为与局部TMg细胞对局部Trff细胞的最低比例有关的剂量。
36.根据权利要求7至35任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂剂量的患者特异 性优化之后，然后在治疗期间向患者施用最大治疗剂量。
37.根据权利要求7至36任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂的最大治疗剂量是每次施用O. lmg/kg至10mg/kg。
38.根据权利要求37所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂的最大治疗剂量是每次施用O.lmg/kg 至 5mg/kg,例如每次施用 lmg/kg。
39.根据权利要求7至38任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂表现出反向剂量治疗作用反应。
40.根据权利要求7至39任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂能够提供系统性的抗肿瘤作用。
41.根据权利要求7至40任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂能够提供效应细胞和抑制细胞之间比例和/或机制的变化。
42.根据权利要求7至41任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂能够提供效应细胞或抑制细胞和/或这些亚组之间比例的变化，其中变化与抗肿瘤作用有关。
43.根据权利要求7至42任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂表现出有利的副作用谱。
44.根据权利要求7至43任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂，相对于免疫调节剂的高剂量应用，表现出降低的副作用谱。
45.根据权利要求7至44任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂，相对于免疫调节剂的系统性施用，表现出降低的副作用谱(以提供等价治疗作用的剂量)。
46.根据权利要求7至45任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂以缓释组合物的形式提供。
47.根据权利要求7至46任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂以pH稳定的组合物的形式提供。
48.根据权利要求7至47任一项所述的免疫调节剂，其中免疫调节剂是用于通过瘤旁注射的慢性施用的具有CTLA-4拮抗剂活性的抗CTLA-4抗体或抗原结合片段或其衍生物。
49.权利要求7至48任一项所定义的免疫调节剂在制备用于肿瘤局部治疗的药物中的用途，其中治疗包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部Ireg细胞数目上的增加的最大治疗剂量。
50.一种用于在患者中治疗肿瘤的方法，其包括向患者施用权利要求7至48任一项所定义的免疫调节剂的步骤，其中在肿瘤的位置或附近局部施用免疫调节剂，其中方法包括免疫调节剂剂量的患者特异性优化来鉴别在患者中不诱导局部TMg细胞数目上的增加的最大治疗剂量。
51.Treg细胞作为在患者中使用免疫调节剂的肿瘤治疗疗效标志物的用途。
52.Treg细胞和Trff细胞之间的比例、或介导免疫激活的分子和抑制的分子之间的比例作为患者中使用了免疫调节剂的肿瘤治疗疗效标志物的用途。
53.根据权利要求51或52所述的用途，其中TMg细胞和/或Trff细胞对于肿瘤是局部的。
54.根据权利要求51至53任一项所述的用途，其中治疗包括免疫调节剂的局部施用。
55.根据权利要求51至54任一项所述的用途，其中免疫调节剂如权利要求7至48任一 项所定义。
56.一种剂量优化的方法，其参考说明书基本上如此处所述。
57.一种免疫调节剂，其参考说明书基本上如此处所述。
58.一种治疗方法，其参考说明书基本上如此处所述。
59.Treg细胞的用途，其参考说明书基本上如此处所述。
60.Treg细胞和Trff细胞的比例的用途，其参考说明书基本上如此处所述。
全文摘要
本发明提供一种用于肿瘤局部治疗的免疫调节剂，其中治疗包括免疫调节剂剂量的患者-特异性优化，来鉴别在患者中不诱导局部调节T细胞(Treg细胞)数目上的增加的最大治疗剂量。本发明还提供肿瘤局部治疗的方法及其优化治疗的方法。
文档编号G01N33/50GK102803961SQ201080060677
公开日2012年11月28日 申请日期2010年11月17日 优先权日2009年11月19日
发明者T·托特曼, L·森丁, A·洛斯克哥, S·芒斯保, P·埃尔马克 申请人:鳄鱼生物科学公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
