专利名称：一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法
一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法
技术领域：
本发明属于中药质量标准技术领域，具体是用于预测蜂胶样品抗氧化活性以评价其质量的一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法。
背景技术：
蜂胶是工蜂从植物新生枝芽或树枝上采集的树脂，并混入蜜蜂上颚腺分泌物和蜂蜡等加工而成的具有芳香粘性的固体胶状物。蜂胶含有黄酮类、萜烯类、酚类及酯类等生物活性物质，其中黄酮类化合物具有显著的抗氧化活性。在2011年国家食品药品监督管理局新批准的以蜂产品为原料的62个保健食品中，以蜂胶为原料的保健品有57个，占所有蜂
产品保健食品的91. 94%。蜂胶保健食品在我国蜂产品保健食品，乃至所有保健食品中的地位可见一斑(胡福良.2011-2012年我国蜂胶市场的回顾与展望[J].中国蜂业，2012，Zl 27-30.)。但是，目前市场上的蜂胶质量层次不齐，导致蜂胶产品的质量及药效显著下降，现行蜂胶质量标准往往难以科学地评价蜂胶质量的优劣。
发明内容本发明的目的在于针对以上所述现有技术存在的不足，提供借助化学计量学方法，将蜂胶的指纹图谱与抗氧化活性进行谱效相关性研究以获得预测其抗氧化活性判断蜂胶质量优劣的一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法。本发明建立直接判断蜂胶抗氧化作用强弱的谱效数学模型，仅根据指纹图谱的特征峰和谱特征峰组，通过本谱效数学模型，不用做抗氧化试验即可直接判断蜂胶抗氧化作用的强弱。为了实现上述目的，本发明是这样实现的一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，通过建立蜂胶HPLC指纹图谱，仅根据HPLC指纹图谱的特征峰和特征峰组识别，通过谱效数学模型直接判断蜂胶抗氧化作用的强弱。一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其步骤如下I、建立蜂胶HPLC (高效液相色谱)指纹图谱供试品溶液取蜂胶药材粉末，精密称定约1. OOOOg，置于索氏提取器中，以IOOmL丙酮索氏提取至无色，提取液水浴蒸干，残渣以甲醇溶解，置于IOOmL量瓶中，用甲醇定容至IOOmL刻度。色谱条件为色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为A:甲醇，B :体积比浓度为0. 4%的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式0min— lOmin —20min —30min — 38min —56min —67min —72min —79min —90min —98min— 105min— 109min— 113min— 120min,甲酉享35% — 35% — 45% — 45% — 50% — 55% — 55% — 58% — 60% — 65% — 69% — 76% — 87% — 98% — 98%,体积比浓度为 0. 4% 的磷酸溶液65% — 65% — 55% — 55% — 50% — 45% — 45% — 42% — 40% — 35% —31%— 24%— 13%—2%—2% ;流速lmL/min，检测器二极管阵列检测器；检测波长283nm ;柱温250C ;进样量15uL0
2、提取特征色谱峰和特征峰组根据蜂胶的HPLC指纹图谱，识别特征峰，特征峰保留时间分别为3. 7min、8. lmin>13. 9min>15.2min、17. lmin、24. 2min>35. 5min>36. 7min、40. 2min>46. 3min、58.9min、69.8min>71.9min>73. 3min>74. 5min>75. 9min>78. 2min、81. 5min、84. 7min、91. 9min、93. 5min、99. lmin、102. 4min、103. 3min、104. 3min25 个特征峰,特征峰光谱图见说明书附图2-26 ;特征峰组5个，分别的保留时间分别为46. 3-58. 9min、58. 9-69. 8min、84. 7-91. 9min、93. 5-99. lmin、99. 1-102. 4min。
3、将所识别特征峰和特征峰组的峰面积代入通过多远回归构建的谱效数学模型X1代表I号(即保留时间为3. 7min)色谱峰峰面积，X2代表2号(即保留时间为8.1min)色谱峰峰面积，X2代表2号色谱峰峰面积，Xn代表n号色谱峰峰面积，n位自然数；Z为所有共有特征峰和特征峰组峰面积之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……X3tl ；高锰酸钾褪色时间与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型Yg=Z/(-9253990+2. 06612X2+4. 38622X3_11. 63460X4-3. 54643X6+1. 54046X7-25. 78 130X8-2. 6246lX9+0. 41935X12+1. 69078X13+5. 07524X14_0. 18923X15+0. 41898X16_1. 06670X17+3. 32966X18+4.26400X19-1. 31022X21-0. 34674X22+2. 00745X23+10. 47970X24-2. 54667X26+0. 64201X27+5. 41115X29);其中，-9253990为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2. 06612为XjfYe产生的贡献，+4. 38622为X3对Ys产生的贡献，……+5.41115为X29对Ys产生的贡献，其中X1的显著性检验P值大于0. 05，所以Xl的色谱峰被剔除。磷钥酸结合率与各共有特征峰和特征峰组)峰面积的数学模型Yf(3852360+2. 35563Xr0. 96533Xs-2. 76869X4-0. 65365X7+0. 52339X9+1. 88828Xn+0. 31946X12+2.28396X14-0. 40311X15+0. 17496X16+0. 58855Xlg+l. 33864X21_1. 13913X22+0. 584843X24+0. 81001X25+1. 87709X27+0. 14703X28+3. 20671X29-3. 89578X3(i)*1(T5 ;其中，3852360 为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2. 35563为X1对产生的贡献，-0. 96533为X3对产生的贡献，……-3. 89578为X3tl对\产生的贡献。羟基自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型Yq=(2594840+0. 7737(^+0. 52682X2_0. 66321Xs+0. 29189X5_0. 42388X6+0. 35545X9+0. 25710Xn+0.068273X12+0. 20390X13+0. 66739X14-0. 19164X16-0. 089679X17-0. 40292X19-0. 69228X20+0. 50906X21-0. 036671X22+1. 04316X23+0. 24692X24+0. 25121X25+0. 21718X26+0. 29829X27+0. 30746X28-1. 21455X29-1. 37137X30) *10_5 ;其中，2594840为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+0. 77370为X1对Yq产生的贡献，+0. 52682为X2对Yq产生的贡献，……-1. 37137为X3t^fYe产生的贡献。DPPH自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型Yd=Z/179117_
0.1889(^+0. 27095X3-0. 46197X4_0. 11349X5+0. 29916X6_0. 83315X8+0. 030917X9+0. 028327X12-0. 048098X13-0. 0026432X15+0. 065066Xie+0. 0070715X18+0. 0040330X19-0. 039620X21+0. 035916X23+0. 24007X24-0. 058539X25+0. 063668X26+0. 0065765X27_0. 027835X28+0. 21152X29_0. 00054146X30)。其中，179117为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，-0. 18890为X1对Yd产生的贡献，+0. 27095为X3对Yd产生的贡献，……-0. 00054146为X3tl对Yd产生的贡献。4、根据预测结果判定蜂胶质量优劣。高锰酸钾褪色时间Yg为负数或大于25s则此蜂胶样品为不合格品。高锰酸钾褪色时间Ytj大于15s的为劣质品，高锰酸钾褪色时间Ytj小于15s的为优质品以数值较小者为佳；或对于合格样品磷钥酸结合率Yl小于60(%)的为劣质品，磷钥酸结合率Yl大于60(%)的为优质品以数值较大者为佳；或对于合格样品羟基自由基清除率Yq小于40 (%)的为劣质品，羟基自由基清除率Yq大于40 (%)的为优质品以数值较大者为佳；或对于合格样品DPPH自由基清除率Yd小于65 (%)的为劣质品，DPPH自由基清除率Yd大于65 (%)的为优质品以数值较大者为佳。本发明的有益之处采用蜂胶HPLC (高效液相色谱)指纹图谱可以通过色谱峰的保留时间及光谱特征对共有特征峰和特征峰组进行识别，从而保证了共有峰识别的准确性与重复性；可直接通过蜂胶纹图谱预测其四种抗氧化活性，对蜂胶的优劣进行评价；且判别方法采用指纹图谱与数学模型结合的方法可避免人为因素造成的干扰。
图1为本发明所提供的蜂胶HPLC-DAD指纹图谱；图2为3. 7min色谱峰光谱图；图3为8.1min色谱峰光谱图；图4为13. 9min色谱峰光谱图；图5为15. 2min色谱峰光谱图；图6为17.1min色谱峰光谱图；图7为24. 2min色谱峰光谱图；图8为35. 5min色谱峰光谱图；图9为36. 7min色谱峰光谱图；图10为40. 2min色谱峰光谱图；图11为46. 3min色谱峰光谱图；图12为58. 9min色谱峰光谱图；图13为69. 8min色谱峰光谱图；图14为71. 9min色谱峰光谱图；图15为73. 3min色谱峰光谱图；图16为74. 5min色谱峰光谱图；图17为75. 9min色谱峰光谱图；图18为78. 2min色谱峰光谱图；图19为81. 5min色谱峰光谱图；图20为84. 7min色谱峰光谱图；图21为91. 9min色谱峰光谱图；图22为93. 5min色谱峰光谱图；图23为99.1min色谱峰光谱图；图24为102. 4min色谱峰光谱图；图25为103. 3min色谱峰光谱图；图26为104. 3min色谱峰光谱图。
具体实施方式下面将通过实施例对本发明做进一步描述，但本发明并不限于实施例所述范围。
谱效数学模型的建立采用高锰酸钾氧化法、磷钥酸法、DPPH自由基清除测定法、羟基自由基清除率测定法对蜂胶抗氧化活性进行评价。高锰酸钾氧化法依中国药典高锰酸钾氧化法进行，精密量取样品液0.1mL蒸馏水定容至10mL，倒入锥形瓶中，精密加入20%硫酸溶液2mL，振摇lmin，精密加入0. 02mol/L高锰酸钾溶液0. 10mL，记录溶液红色完全消失时间，即为样品液的氧化时间。根据氧化时间的长短评价其抗氧化活性。磷钥酸法精密量取样品液ImL蒸馏水稀释至IOml,精密量取稀释后样品液lmL、20%硫酸溶液lmL、1%磷钥酸溶液ImL置于5mL量瓶中，蒸馏水定容至刻度。95°C恒温水浴30min，取出放至室温后，测其在619nm波长处的吸光度。根据抗氧化活性物质与磷钥酸的结合强度评价其抗氧化活性强弱。磷钥酸结合强度计算公式见式3。
d ( % ) = (A 样品—A 空白)/A 空白 X 100 式(3 )DPPH自由基清除测定法精密称取0. 015gDPPH置于250mL量瓶中，以95%乙醇定容至刻度。精密量取ImL样品液置IOmL量瓶中，蒸馏水定容。精密移取稀释后样品液ImUDPPH溶液5mL于试管中，避光保存待测，Ih后测定其在515nm波长处的吸光度，计算清除率。DPPH自由基清除率(％ ) = (A空白_A样品)/A空白X 100羟基自由基清除率测定法精密量取ImL样品液置IOmL量瓶中，蒸馏水定容。精确移取0. 2mL18mmol/L邻二氮菲溶液置于IOmL量瓶中，混勻后加入0. lmL7. 5mmol/L的FeSO4溶液，充分混匀后加入0. 25mL0. 2% H2O2溶液，pH7. 4的PBS溶液定容，37°C下反应30min，测其在510nm波长处吸光度A1。同上法，加入稀释后样品液0. 5mL后再加H2O2O. 25mL，测得A2 ；同上法，不加H2O2和样品液测得A3。羟基自由基清除率(％) =A「(A2-A3) /A1X 100高锰酸钾褪色时间为\，X1代表I号色谱峰峰面积，X2代表2号色谱峰峰面积，Xn代表n号色谱峰峰面积，n为自然数。Z为所有共有峰面积之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……Xn。根据高锰酸钾抗氧化实验结果及色谱峰及色谱峰组识别结果，构建矩阵乘法，建立多元回归模型。
Arfii
Ki 1 2 -* 30 �- e:: = ] . +
讀JUJ U,此矩阵可简记为Z/%=C X+e,构建为有n个含有30个组分的样本，即得到实验数据矩阵Y，共有峰及共有峰组面积矩阵X，共有峰及共有峰面积对Y的系数矩阵B，同时随机误差产生矩阵E。则得到该组分模型为Yn=X3tixnB3JE3tl通过最小二乘法对矩阵进行求解。采用显著性检验，对其中c值所对应的P值大于0. 05的X的色谱峰或色谱峰组剔除，得到高锰酸钾褪色时间的多元回归预测方程。磷钥酸结合率为X1代表I号色谱峰峰面积，X2代表2号色谱峰峰面积，Xn代表n号色谱峰峰面积，n为自然数。根据磷钥酸结合率实验结果及色谱峰及色谱峰组识别结果，构建矩阵乘法，建立多元回归模型。
权利要求
1.一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，通过建立蜂胶HPLC指纹图谱，根据HPLC指纹图谱特征峰识别，通过谱效数学模型直接判断蜂胶抗氧化作用的强弱。
2.根据权利要求I所述一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，其步骤如下 1、建立蜂胶HPLC指纹图谱； 2、提取特征色谱峰； 3、将2步骤所识别特征峰和谱特征峰组峰面积代入谱效数学模型； 4、根据预测结果判定蜂胶质量优劣。
3.根据权利要求I所述一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，建立蜂胶HPLC指纹图谱的条件 供试品溶液取蜂胶药材粉末，精密称定约l.OOOOg，置于索氏提取器中，以IOOmL丙酮索氏提取至无色，提取液水浴蒸干，残渣以甲醇溶解，置于IOOmL量瓶中，用甲醇定容至IOOmL刻度。
色谱条件为色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相为A:甲醇，B :体积比浓度为0. 4%的磷酸溶液；采用梯度洗脱方式0min—lOmin —20min —30min —38min —56min —67min —72min —79min —90min —98min— 105min— 109min— 113min— 120min,甲酉享35% — 35% — 45% — 45% — 50% — 55% — 55% — 58% — 60% — 65% — 69% — 76% — 87% — 98% — 98%,体积比浓度为0. 4%的磷酸溶液65%一 65%— 55%— 55%— 50% — 45% — 45% — 42% — 40% — 35% — 31%— 24%— 13%—2% —2% ;流速lmL/min，检测器二极管阵列检测器；检测波长283nm ;柱温250C ;进样量15uL0
4.根据权利要求I所述一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，提取特征色谱峰的特征峰保留时间分别为3. 7min、8. lmin、13. 9min、15. 2min、17. lmin、24. 2min、35. 5min、36. 7min、40. 2min、46. 3min、58. 9min、698min、719min、733min、745min、759min、782min、815min、847min、91. 9min、93. 5min、99. Imin^102. 4min、103. 3min、104. 3min25个特征峰，特征峰组保留时间分别为46. 3-58. 9min、58. 9-69. 8min、84. 7-91. 9min、93. 5-99. lmin、99. 1-102. 4min5 个特征峰组。
5.根据权利要求I所述一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，X1代表I号色谱峰峰面积，X2代表2号色谱峰峰面积，Xn代表n号色谱峰峰面积，n位自然数；Z为所有共有特征峰和特征峰组峰面积之和，即Z=Xi+X2+X3+X4+X5……X3tl ； 高锰酸钾褪色时间与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型Ytj=Z/(-9253990+2. 06612X2+4. 38622X3_11. 63460X4-3. 54643X6+1. 54046X7-25. 78130Xg-2. 6246IX9+0. 41935X12+1. 69078X13+5. 07524X14_0. 18923X15+0. 41898X16_1. 06670X17+3. 32966X18+4. 2640OX19-L 31022X21-0. 34674X22+2. 00745X23+10. 47970X24_2. 54667X26+0. 64201X27+5. 41115X29)；其中，-9253990为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2. 06612为X2对Ys产生的贡献，+4. 38622为XjfYs产生的贡献，……+5. 41115为X29对Ys产生的贡献，其中X1的显著性检验P值大于0. 05，所以Xl的色谱峰被剔除。 磷钥酸结合率与各共有特征峰和特征峰组)峰面积的数学模型Y^(3852360+2. 35563Xr0. 96533Xs-2. 76869X4-0. 65365X7+0. 52339X9+1. 88828Xn+0. 31946X12+2.28396X14-0. 40311X15+0. 17496X16+0. 58855Xlg+l. 33864X21_1. 13913X22+0. 584843X24+0. 81001X25+1. 87709X27+0. 14703X28+3. 20671X29-3. 89578X3(i)*1(T5 ;其中，3852360 为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+2. 35563为X1对产生的贡献，-0. 96533为X3对产生的贡献，……-3. 89578为X3tl对\产生的贡献。 羟基自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型(2594840+0. 77370X^0. 52682X2_0. 66321Xs+0. 29189X5_0. 42388X6+0. 35545X9+0. 25710Xn+0.068273X12+0. 20390X13+0. 66739X14-0. 19164X16-0. 089679X17-0. 40292X19-0. 69228X20+0. 50906X21-0. 036671X22+1. 04316X23+0. 24692X24+0. 25121X25+0. 21718X26+0. 29829X27+0. 30746X28-1.21455X29-1. 37137X30) *10_5 ;其中，2594840为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，+0. 77370为X1对Yq产生的贡献，+0. 52682为X2对Yq产生的贡献，……-I. 37137为X3t^fYe产生的贡献。
DPPH自由基清除率与各共有特征峰和特征峰组峰面积的数学模型Yd=Z/179117-0. 1889(^+0. 27095X3-0. 46197X4-0. 11349X5+0. 29916X6-0. 83315X8+0. 030917X9+0. 028327X12-0.048098X13-0. 0026432X15+0. 065066Xie+0. 0070715X18+0. 0040330X19-0. 039620X21+0. 035916X23+0. 24007X24-0. 058539X25+0. 063668X26+0. 0065765X27-0. 027835X28+0. 21152X29-0. 00054146X3tl)。其中，179117为模型建立中产生的随机校正误差即方程截距，-0. 18890为XJ^Yd产生的贡献，+0. 27095为X3对Yd产生的贡献，……-0. 00054146为X3tl对Yd产生的贡献。
6.根据权利要求I所述一种基于谱效关系的蜂胶质量控制方法，其特征在于，根据预测结果判定蜂胶质量优劣方法如下高锰酸钾褪色时间Ytj为负数或大于25s则此蜂胶样品为不合格品；高锰酸钾褪色时间\大于15s的为劣质品，高锰酸钾褪色时间Yg小于15s的为优质品以数值较小者为佳；或对于合格样品磷钥酸结合率Yl小于60%的为劣质品，磷钥酸结合率Yl大于60%的为优质品以数值较大者为佳；或对于合格样品羟基自由基清除率Yq小于40%的为劣质品，羟基自由基清除率Yq大于40%的为优质品以数值较大者为佳； 或对于合格样品DPPH自由基清除率Yd小于65%的为劣质品，DPPH自由基清除率Yd大于65%的为优质品以数值较大者为佳。
全文摘要
本发明提供一种根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化活性的质量控制方法，其是采用HPLC建立蜂胶指纹图谱，以高锰酸钾褪色时间、DPPH自由基清除率、磷钼酸结合率、羟基自由基清除率评价其抗氧化活性。通过分析蜂胶指纹图谱色谱及光谱特征确定25个特征峰及5个特征峰组。采用多项式拟合建立了根据蜂胶指纹图谱预测其抗氧化活性的数学模型。根据指纹图谱特征峰(组)，仅采用本发明所提供的数学模型，不用做抗氧化试验即可直接判定蜂胶药材抗氧化活性的强弱，确定其质量的优劣。本发明具有方法简便、客观性强、特征峰多等优点，使蜂胶的质量控制更加完善和科学。
文档编号G01N21/78GK102980952SQ20121046999
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者林励, 陈南迪, 谭东山 申请人:广州市谭山蜂业有限公司
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