专利名称：一种水体中微囊藻毒素mc-lr的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，属于环保技术领域。
背景技术：
随着全球淡水水华的持续大规模的爆发，蓝藻死亡过程中释放的次级代谢产物微囊藻毒素已成为水体中一类广泛存在的天然有毒物。微囊藻毒素是七肽单环化合物，到目前为止，已发现80种不同的微囊藻毒素亚型。其中以可变氨基酸为亮氨酸(L)和精氨酸(R)的微囊藻毒素MC-LR为最常见、毒性最强，目前已知毒性仅次于二恶英。微囊藻毒素MC-LR在环境中的分布、迁移、积累的归宿等环境行为，已受到环保工作者的特别关注。目前对水体中微囊藻毒素MC-LR的检测方法可分为生物毒理学法、化学分析法、免疫检测法。1、生物测试法采取对小鼠进行灌喂或腹腔注射来鉴定藻毒素的毒性。它的优点是简便直观，能较为粗略地判断提取物是否有毒性。具有操作简单，结果直观、快速等优点，但需要消耗较多的毒素，灵敏度和专一性不高，无法准确定量，也不能辨别毒素的异构体类型。且小鼠的维持费用高、工作量大。2、免疫检测法利用毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测。主要包括酶联免疫分析法、蛋白磷酸酶抑制分析法等。免疫检测法简单易行、分析速度快、灵敏度较高，但不能对毒素起到良好的鉴别作用，有时会出现假阳性反应。3、化学分析法包括高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)高效液相色谱和质谱(HPLC-MS)、气相色谱和质谱(GC-MS)联用、毛细管电泳(CE)等方法。化学分析法中的GC分析法快速、准确、灵敏、痕量，但只能测定藻毒素的总量，且技术含量高、操作复杂，仪器设备价格昂贵，不能普遍采用。TLC法分离度有限，对其实际应用还有难度。CE法检测时间短，分离度较高，样品量�。诩嗖獾牧槊舳确矫嬉飞贖PLC。HPLC法准确、灵敏、重现性好，并能同时分析出不同的藻毒素异构体，操作相对简单，仪器设备价格适中，但在鉴定过程中需要借助藻毒素标准样品。相对来说，HPLC是常用的一种分析手段。由于生物测试与免疫检测均需要生物样本，且测定过程中存在上述不确定性，因此在环境监测中应用不普遍。HPLC法因其分析速度快，方法重现性好而应用较普遍。但在样品预处理上仍存在以下问题(1)样品预处理时采用树脂作为富集柱，体积较大，洗脱步骤多，消耗有机溶剂多，且有机溶剂涉及四氯化碳、丙酮等毒性相对较大的溶剂，对操作人员相对风险较大；
(2)采用常规规格的C18硅胶柱对样品富集纯化，因其尺寸较大，所需填料及溶剂较多，存在浪费溶剂及填料利用不充分的现象，且填料回收利用率较低，往往是一次性的，对环境影响较大。发明内容
本发明的目的是为了解决上述的水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法中所存在有机溶剂用量大、毒性大、步骤繁多等技术问题而提供一种简单、快速、准确、环保的水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法。
本发明的技术方案一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，即利用GF/C玻璃纤维滤纸过滤待测水样中的藻细胞，用C18硅胶为填料的固相萃取柱SPE柱分离纯化过滤后的待测水样，并用高效液相反相色谱系统进行测定其出峰面积，然后通过预先获得的不同浓度的微囊藻毒素MC-LR 标准品所对应的出峰面积的标准曲线求出待测水样中微囊藻毒素MC-LR的含量。
上述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，具体包括如下步骤(1)、水样的预处理将5-10mL待测水样经过规格为1. 2 μ m的GF/C玻璃纤维滤纸过滤去除藻细胞及水样中其他悬浮颗粒物，收集过滤后的待测水样待用；(2)、固相萃取柱SPE柱的活化与微囊藻毒素MC-LR的萃取固相萃取柱SPE柱中的填料为C18硅胶，每个样品柱的填料为500 mg,固相萃取柱SPE 柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水调节；所述的固相萃取柱SPE柱的规格SPE柱为固相萃取小柱，柱管容量6mL ；将步骤(I)的过滤后的待测水样，用上述活化后的SPE柱萃�。撕蟮拇馑詌OmL/min的速度进SPE萃取柱，保留分离物，其他干扰物通过吸附剂，所得的分离物用 5mL20%的甲醇冲洗I次，使先前保留的干扰物选择性地淋洗掉；经20%甲醇冲洗后的分离物用3mL的纯甲醇洗脱，洗脱液即为待测水样中MC-LR提取物，控制温度为45°C用氮吹至干，溶于200 μ L色谱纯甲醇，于_20°C保存；(3)、微囊藻毒素MC-LR标准曲线的绘制取MC-LR标准样品，用色谱醇甲醇配成不同浓度的MC-LR标准品甲醇溶液，用HPLC反相色谱系统测定其不同浓度MC-LR标准品甲醇溶液对应的出峰时间在6min的峰面积，然后以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积，得到不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线；(4)、水样中MC-LR的高效液相色谱HPLC测定取步骤(2)处理好的待测水样中MC-LR提取物用色谱纯甲醇定容到lmL，得到待测水样中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色谱系统测定，然后根据步骤(3)所得的标准曲线求出其对应的MC-LR浓度值，即为待测水样浓缩5-10倍后的MC-LR浓度值；即测定值应该是待测水样中实际值的5-10倍，因为取样5-10mL，经过滤、萃取浓缩、吹干，最终定容至ImL进行检测。
上述的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，最低检测限为O. 002mg/Lo
本发明的技术效果 本发明的一种微囊藻毒素MC-LR的测定方法，由于采用6mL规格的SPE小柱对水样进行预处理，所需待测水样仅为5-10mL，并采用甲醇为淋洗溶剂，使得洗脱液的用量及毒性与传统方法相比都有所降低，对操作人员更安全。进一步，由于所需待测水样量的减少，从而相对的减少废液排放量，填料得以充分利用，对环境更友好，检测成本低。进一步，本发明的一种微囊藻毒素MC-LR的测定方法，由于采用SPE小柱-HPLC联用技术，是集样品预处理与分析检测一体的分析方法，因此，具有步骤简单、操作方便、分析速度快、溶剂消耗少、方法重现性好、易于自动化等优点。进一步，本发明的一种微囊藻毒素MC-LR的测定方法，操作过程中，待测水样首先在GF/C玻璃纤维滤纸过滤后可将悬浮颗粒物及藻细胞过滤去除，进C18硅胶为填料的SPE柱后，可明显看到浅黄色物质吸附在填料上，其中可能包含一些色素干扰物，在用20%的甲醇冲洗后，并用纯甲醇解吸附，将待测样品浓缩后进HPLC反相色谱系统检测鉴定，峰形非常清晰，并在检测限之上，能很好的检测到MC-LR的含量，最低检测限为O. 002mg/L。
图1A、不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线图，其中 O. 002 彡 X 彡 O. 2mg/L;
图1B、不同浓度的微囊藻毒素 MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线图，其中x^O. 2mg/L ；
图2、实施例1含MC-LR为lmg/L的带出自来水水样中微囊藻毒素MC-LR含量测定的HPLC 图3、实施例2人工湖夏阳湖水水样中微囊藻毒素MC-LR含量测定的HPLC图。
具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。本发明所用的SPE柱中的填料C18硅胶，杭州沃华滤纸有限公司生产；
本发明所用的固相萃取柱SPE柱为固相萃取小柱，柱管容量6mL，杭州沃华滤纸有限公司生产；
本发明所用的1.2μπι的GF/C玻璃纤维滤纸，上海摩速科学器材有限公司；
本发明所用的MC-LR标准品分子式C49H74NltlO12,分子量995. 2，伊普瑞斯科技有限公司生产，HPLC纯度彡95% ；
本发明所用的甲醇，色谱级。实施例1
一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，具体包括如下步骤
(1)、水样的预处理
取自来水水样添加MC-LR标准样品得到待测自来水水样，并使待测自来水水样中MC-LR理论值为lmg/L。取5mL待测自来水水样，经过规格为1. 2 μ m的GF/C玻璃纤维滤纸过滤，收集过滤后的待测自来水水样待用；
(2)、固相萃取柱SPE柱的活化与微囊藻毒素MC-LR的萃取
SPE柱中的填料为C18硅胶，每个样品柱的SPE填料为500mg，SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水调节；
将步骤(I)的过滤后的待测自来水水样，用上述活化后的SPE柱萃�。撕蟮拇庾岳此詌OmL/min的速度进SPE萃取柱，保留分离物，其他干扰物通过吸附剂，所得的分离物用5mL20%的甲醇冲洗I次，使先前保留的干扰物选择性地淋洗掉；经甲醇冲洗后的分离物用3mL的纯甲醇解吸附，残留物即为待测自来水水样中MC-LR 提取物，45°C氮吹至干,溶于200 μ L色谱纯甲醇,于-20°C保存；(3)、微囊藻毒素MC-LR标准曲线的绘制依次用色谱纯甲醇配制浓度分别为O. 002mg/L、0. 01mg/L、0. 02mg/L、0. 05mg/L、0. lmg/ L、0. 2mg/L、0. 5mg/L、lmg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L 的 MC-LR标准品甲醇溶液,采用 HPLC 反相色谱系统进行测定不同浓度的MC-LR标准品甲醇溶液在出峰时间为6min处的出峰面积； 测定所用的反相色谱系统型号为LC-2000，日本JASCO公司生产，所用色谱柱为大连伊利特柱Hypersil ODS 25 μ m，色谱柱尺寸为4. 6 X 250 mm ；测定条件流动相为甲醇水的体积比为60/40，并用三氟乙酸调pH为3. 2，流速为 O. 8mL/min,柱温保持在25°C，紫外检测波长238nm，进样量为10 μ L ;`以MC-LR标准品甲醇溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，最终得到标准曲线如图1Α，图1B所示，从图1Α、图1B中可以得出y=8. 15x+0. 8313，R2=O. 9266，其中y为峰面积，χ为MC-LR标准品甲醇溶液， O. 002 ^ χ ^ O. 2mg/L ；y=0. 1975x+2. 434，R2=9843，其中y为峰面积，χ为MC-LR标准品甲醇溶液，χ彡O. 2mg/L ；(4)、高效液相色谱HPLC的测定取步骤(2)处理好的待测自来水水样中MC-LR提取物用色谱纯甲醇定容到lmL，得到待测水样中MC-LR提取物甲醇溶液，用与步骤(3)所述的HPLC反相色谱系统进行测定，测定条件同步骤(3)，测定结果如图2所示，从图2中获得出峰时间在6min处的峰面积，然后根据步骤(3)所得的标准曲线求出MC-LR浓度为4. 6mg/L,由于检测过程中待测自来水水样取样为5mL，经过滤、萃取浓缩、吹干，最终定容至ImL进行检测，因此实际测定的MC-LR浓度为待测自来水水样的5倍，即实际的待测自来水水样中MC-LR浓度为O. 92mg/L。
通过上述的水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法测定出待测自来水水样中的微囊藻毒素MC-LR的浓度O. 92mg/L，其与步骤(I)中的实际加入量即浓度为lmg/L相差8%。 由此表明本发明的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法可靠、准确度高。
实施例2一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，具体包括如下步骤(1)、水样的预处理取人工湖夏阳湖水水样5mL经过规格为1. 2 μ m的GF/C玻璃纤维滤纸过滤，收集过滤后的待测人工湖夏阳湖水水样待用；(2)、固相萃取柱SPE(固相萃取)柱的活化与微囊藻毒素MC-LR的萃取SPE柱中的填料为C18硅胶，每个样品柱的填料为500mg，SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水调节；将步骤(I)的过滤后的待测人工湖夏阳湖水水样，用上述活化后的SPE柱萃�。撕蟮拇獾娜斯ず难艉詌OmL/min的速度进SPE萃取柱，保留分离物，其他干扰物通过吸附剂，所得的分离物用5mL20%的甲醇冲洗I次，使先前保留的干扰物选择性地淋洗掉；
经甲醇冲洗后的分离物用3mL的纯甲醇解吸附，残留物即为人工湖夏阳湖水水样中MC-LR提取物，45 °C氮吹至干，溶于200 μ L色谱纯甲醇，于-20 V保存；
(3)、微囊藻毒素MC-LR标准曲线的绘制 同实施例1的步骤(3)；
(4)、高效液相色谱HPLC的测定
取步骤(2)处理好的待测人工湖夏阳湖水水样中MC-LR提取物用色谱纯甲醇定容到lmL，得到待测人工湖夏阳湖水水样中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色谱系统测定，测定条件同步骤(3)，结果如图3所示，从图3中获得出峰时间在6min处的峰面积，然后根据步骤(3)所得的标准曲线求出MC-LR的浓度为2. 3mg/L,由于检测过程中人工湖夏阳湖水水样取样为5mL，经过滤、萃 取浓缩、吹干，最终定容至ImL进行检测，因此实际测定的MC-LR浓度为待测人工湖夏阳湖水水样的5倍，即实际的待测人工湖夏阳湖水水样中MC-LR的浓度为 O. 46mg/L。上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.ー种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，其特征在于利用GF/C玻璃纤维滤纸过滤待测水样中的藻细胞，用C18硅胶为填料的固相萃取柱SPE柱分离纯化过滤后的待测水样，并用高效液相反相色谱系统进行測定其出峰面积，然后通过预先获得的不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线求出待测水样中微囊藻毒素MC-LR的含量。
2.如权利要求1所述的ー种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，其特征在于所述的GF/C玻璃纤维滤纸的规格为1. 2 ii m。
3.如权利要求1所述的ー种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，其特征在于所述的SPE柱为固相萃取小柱，柱管容量6mL。
4.如权利要求1、2或3所述的ー种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，其特征在于具体包括如下步骤 (1)、水样的预处理 将5-10mL待测水样经过GF/C玻璃纤维滤纸过滤，收集过滤后的水样待用； (2)、固相萃取柱SPE柱的活化与微囊藻毒素MC-LR的萃取 固相萃取柱SPE柱填料为C18硅胶，每个样品柱的填料为500mg，固相萃取柱SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水调节； 将步骤(I)的过滤后的待测水样，用上述活化后的SPE柱萃�。撕蟮拇馑詌OmL/min的速度进SPE萃取柱，保留分离物，其他干扰物通过吸附剂，所得的分离物用5mL20%的甲醇冲洗I次； 经20%甲醇冲洗后的分离物用3mL的纯甲醇洗脱，洗脱液即为待测水样中MC-LR提取物，控制温度为45°C用氮吹至干，溶于200 u L色谱纯甲醇，于_20°C保存； (3)、微囊藻毒素MC-LR标准曲线的绘制 取MC-LR标准样品，用色谱纯甲醇配成不同浓度的MC-LR标准品甲醇溶液，用HPLC反相色谱系统測定其不同浓度MC-LR标准品甲醇溶液对应的出峰时间在6min的峰面积，然后以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积，得到不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线； (4)、水样中MC-LR的高效液相色谱HPLC測定 取步骤(2)处理好的待测水样中MC-LR提取物用色谱纯甲醇定容到lmL，得到待测水样中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色谱系统測定，然后根据步骤(3)所得的不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线求出其对应的MC-LR浓度值，即为待测水样浓缩5-10倍后的MC-LR浓度值。
5.如权利要求4所述的ー种水体中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于所述的HPLC反相色谱系统型号为LC-2000，日本JASCO公司生产，所用色谱柱为大连伊利特柱Hypersil ODS 25 y m，色谱柱尺寸为 4. 6 X 250mm ; 測定条件流动相为甲醇水的体积比为60/40，并用三氟こ酸调pH为3. 2，流速为0. 8mL/min,柱温保持在25°C，紫外检测波长238nm，进样量为10 Uし
全文摘要
本发明公开了一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法，属于环保技术领域。所述的水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法即利用GF/C玻璃纤维滤纸过滤待测水样中的藻细胞，用C18硅胶为填料的固相萃取柱SPE柱分离纯化过滤后的待测水样，并用高效液相色谱进行检测，然后通过预先获得的不同浓度的微囊藻毒素MC-LR标准品所对应的出峰面积的标准曲线求得待测水样中微囊藻毒素MC-LR的含量。本发明的一种水体中微囊藻毒素MC-LR的测定方法具有步骤简单、操作方便、洗脱液的用量及对环境的毒性都有所降低，对操作人员更安全，检测成本低等优点，最低检测限为0.002mg/L。
文档编号G01N30/02GK103048398SQ20121051308
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者叶璟, 张颖, 王鲁梅, 楼春, 钱景茹 申请人:上海应用技术学院
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