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专利名称：鼠伤寒沙门氏菌的特异性fq-pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种禽类及其制品安全检验领域的FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列，具体是一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列。
背景技术：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙门氏菌致病的常见血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热；对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，该菌形成了哥本哈根变种、宾斯变种及0型变种三个变种。该菌的检测主要依靠传统培养方法(参见国标GB/T4789. 4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，虽然结果可靠，但操作复杂，通常要3 5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情蔓延。之后，许多研究学者建立了如荧光抗体技术、免疫磁珠富集法、ELLSA、自动酶联免疫荧光法、免疫组化、显色培养基法、DNA探针技术等检测技术，但在实践中都有不同程度的局限性。FQ-PCR技术具有快速、简便、灵敏等优点，并且由于该法采用弓I物和探针的“双保险”，因而特异性更强。该技术逐步应用于沙门氏菌的检疫后，对沙门氏菌病诊断和防治工作起到了积极作用，曾先后有学者以沙门氏菌stn、fimY、invA等为靶基因，建立检测沙门氏菌的FQ-PCR方法。但是只针对鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法极少，并且由于检测靶位点的特异性不强，以及假阳性的出现，可对检测结果产生影响，产生判断困难。经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌的FQ-PCR检测方法、核酸及弓I物对有关的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法本发明是通过以下的技术方案具体实现的。利用荧光定量PCR仪检测荧光素的特点，将根据鼠伤寒沙门氏菌STM4493基因设计的探针标记为FAM突光报告基团，经反复试验,优化FQ-PCR反应体系和反应参数,建立了鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法，包括如下步骤步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO :1设计引物对和探针；所述引物对和探针具体为上游引物序列如SEQ IDNO :2所示,下游引物序列如SEQ ID NO :3所示,探针序列如SEQ ID N0:4所示。步骤二，提取样品DNA步骤三，FQ-PCR检测，其检测体系具体为10XPCR反应缓冲液2. 5 y L，25mmol/L的 Mg2+2. Ou L, 2. 5mmol/L 的 dNTPl. Ou L,5uM 引物对 I y L，5 y M 探针 0. 5 y L，Taq 酶 1U，模板溶液0. 5 L，最后用双蒸水补至25ii L ;扩增参数具体为95°C预变性5min后开始扩增循环，每个循环的程序为95°C变性30s，51°C退火30s，72°C延伸30s ;共45个循环(采用三步法，并在退火延伸阶段收集荧光信号)；最后72°C延伸lOmin，降温至16°C，结束。步骤四，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为通过FQ-PCR仪(BIO-RAD定量PCR仪)自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，若出现Ct < 35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct <35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，检测成本低；并可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具有实用性；本发明检测的靶点具有单一特异性，提供的引物对和探针对不含目的基因的样品均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。本发明提供的引物对和探针检测DNA和菌液灵敏度分别可达2. 5copies/uL和5cfu/y L，说明其具有良好的敏感性。


图I为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法特异性评价试验扩增曲线图；图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法DNA敏感性评价试验扩增曲线图；图3为实施例4中鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法菌液敏感性评价试验扩增曲线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Habor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法的建立步骤一，设计特异性扩增鼠伤寒沙门氏菌的引物对和探针通过生物信息学分析，从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中筛选出保守且特异的STM4493基因，将之作为检测鼠伤寒沙门氏菌的靶基因，基因序列如SEQ ID NO : I所示；将STM4493基因DNA序列输入软件primer express3. 0中设计引物对和探针，设置GC%范围为40 % 60 %，产物大小范围为100 300bp，从备选弓丨物对和探针中选择出引物对和探针，引物对和探针序列如下(引物对和探针由上海基康生物技术有限公司合成)上游引物5_，CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’(SEQ ID NO 2)下游引物5_’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’(SEQ ID NO 3)探针5_’CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’ (SEQ ID NO 4) 步骤二，DNA模板制备将鼠伤寒沙门氏菌接菌至IOml的LB液体培养基中，在37°C增菌8h后，取Iml菌液，放入1. 5ml离心管中，12，OOOr/min离心IOmin,弃上清液,加入200 μ L无菌双蒸水重新悬浮菌体，12，OOOr/min离心5min,弃上清液,收集菌体。用100 μ L无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20°C放置30min。在37°C解冻后，12，OOOr/min离心5min，取上清液放置-20°C备用。步骤三，FQ-PCR检测方法的建立FQ-PCR反应体系如下在定量PCR反应管中依次加入IOXPCR反应缓冲液2. 5 μ L，25mmol/L 的 Mg2+2. O μ L，2. 5mmol/L 的 dNTPl. (^1^，5“] 弓|物对14 1^54]\1探针
O.5 μ L，Taq酶1U，模板溶液I μ L，最后用双蒸水补至25 μ L。将定量PCR反应管离心后，放入荧光定量PCR反应仪中，按照以下FQ-PCR循环参数进行95°C预变性5min ;之后开始扩增循环，每个循环的程序为95°C变性30s，51°C退火30s，72°C延伸30s ;共45个循环(采用三步法，并在退火延伸阶段收集荧光信号)；最后72°C延伸lOmin，降温至16°C，结束。步骤四，结果鉴别和判定用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct < 35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct
<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。结果通过FQ-PCR仪自带软件(BI0-RAD的IQ5)分析后可获得Ct < 35且呈对数增长的特异性扩增曲线，说明所建立的FQ-PCR检测方法可以成功检测出鼠伤寒沙门氏菌。实施例2鼠伤寒沙门氏菌FQ-PCR检测方法特异性评价试验
步骤一，DNA模板制备按照实施例I步骤二中DNA提取方法，分别提取鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S. Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S. Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(S. Paratyphi C)、猪霍乱沙门氏菌(S. Cho lerae su I S)、鸡白痢沙门氏菌(S. Pullorosis)、鸭沙门氏菌(S. Anatis)、鸡沙门氏菌(S. Gallinarum)、都柏林沙门氏菌(S. Dublin)、肠炎沙门氏菌(S. Enteritidis)、海德尔堡沙门氏菌(S. Heidelberg)、山夫登堡沙门氏菌(S. Senftenberg)、大肠埃希氏菌(Escherichia)的 DNA 模板。步骤二，FQ-PCR检测方法特异性评价按照实施例I步骤三中FQ-PCR反应体系，取步骤一中制备各菌株的DNA模板I μ L作为FQ-PCR反应模板分别添加到FQ-PCR反应体系中，空白对照则以I μ L的无菌双蒸水为模板；然后按照实施例I步骤三中FQ-PCR循环参数进行扩增反应。步骤三，结果鉴别和判定用FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，以获得扩增曲线。若出现Ct <35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct
<35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含有鼠伤寒沙门氏菌。结果图I所示为该方法特异性评价试验的检测结果，其血清型及菌株编号请参见表I说明。
权利要求
1.一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，筛选出鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA中的保守且特异性的STM4493基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO 1定义，并根据其序列设计扩增引物对和探针；引物对和探针序列如下上游引物5_’ CCGCGTTTTTGTATTGAAAGTTATC-3’ (SEQ ID NO 2)下游引物5_’AAACATCATGAACGGCCTGG-3’ (SEQ ID NO 3)探针5_’ CAGCCAAAACATCAGCAGGCGATCA-3’ (SEQ ID NO 4)步骤 ，提取样品DNA ；步骤三，对样品DNA进行FQ-PCR检测；FQ_PCR反应体系如下依次加入IOXPCR反应缓冲液 2. 5 μ L，25mmol/L 的 Mg2+2. O μ L，2. 5mmol/L 的 dNTPl. 0 μ L，5 μ M 引物对 I μ L, 5 μ M探针O. 5 μ L，Taq酶1U，模板溶液O. 5 2 μ L，最后用双蒸水补至25 μ L ;扩增参数具体为95°C预变性5min ;之后开始扩增循环，每个循环的程序为95°C变性30s，51°C退火30s，72°C延伸30s ;共45个循环；最后72°C延伸lOmin，降温至16°C，结束；步骤四，通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取FQ-PCR检测结果，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为若出现Ct < 35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct <35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
全文摘要
本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌的特异性FQ-PCR检测方法及其中的核酸、引物对和探针序列；该检测方法包括以下步骤根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组序列中的保守且特异的STM4483基因序列SEQ ID1，设计扩增引物对序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO3及探针序列SEQ ID NO4。提取样品DNA，FQ-PCR法扩增；通过FQ-PCR仪自带软件自动分析读取结果，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为若出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若未出现Ct＜35且呈对数增长的特异性扩增曲线，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌；采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本底，检测结果特异，结果判定简单。
文档编号G01N21/64GK102618635SQ201210045529
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者汪铭书, 程安春, 陈孝跃, 黄静玮 申请人:四川农业大学