专利名称：一种脂联素受体配基及激动剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种脂联素受体配基的筛选方法，属于生物技术领域。
背景技术：
脂肪组织(adipose tissue)主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，在体内有6种存在形式gAPN、fAPN、LMW、MMW、HMW和Alb-LMW。其中，fAPN是其它各种形式的组成的基本单位，而LMW、MMW、HMW是fAPN的寡聚体，gAPN是fAPN的球形部分。脂联素是一种胰岛素增敏激素(Anlnsulin-sensitizing Hormone),倉泛改善小鼠的月夷岛素抗性(Insulin resistance)和动脉硬化症；对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。
脂联素有2种受体=AdipoRl和AdipoR2。全身各组织均可见AdipoRl表达，以骨骼肌表达最丰富，AdipoR2则在肝脏表达最丰富。AdipoRl对gAd是一种高结合力受体，而对全长型为低结合力受体；AdipoR2对两种脂联素都是中等结合力，受体和脂联素的相互作用，增加AMPK和过氧化体增殖物激活型受体a (peroxisome proliferator activatedreceptor, PPAR α)配体活性，增加由脂联素所致的脂肪酸氧化和葡萄糖摄取。脂联素与脂联素受体结合后，在锚定蛋白(APPL)的配合下，通过AMPK，MAPK以及PPAR通路调节一氧化氮的释放、葡萄糖的摄取、脂肪酸的β氧化、细胞因子如TNF-α的分泌等一系列作用发挥抗炎、抗糖尿病以及动脉粥样硬化作用。从脂联素的作用机制来看，对其信号通路的干扰主要有AdipoR，AMP/MAPK, Sirtl等几个潜在靶点，最有希望的是脂联素受体(AdipoRl和AdipoR2)，激活受体可以发挥与脂联素相似的药理学效应。因此，寻找脂联素受体的配基及其激动剂显得尤为重要。目前，国内外关于脂联素及其受体的研究数以千计，近十年来研究尤为迅速，但关于脂联素受体配基的筛选尚无任何报道。基于荧光技术的检测分析方法是近年来被应用于药物高通量筛选的重要方法之一，目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光分析法、荧光共振能量传递分析法、荧光关联光谱法和极化荧光分析法。其中，用极化荧光分析法高通量筛选药物时，生物分子之间相互作用后不用过滤分离游离(未结合)的荧光标记物，检测极方便。极化荧光方法的理论是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反t匕，小分子旋转速度快，其极化值�。蠓肿有俣嚷浼荡�。基于该理论，用荧光物质标记生物分子，当分子之间由于结合或解离，分子的体积或分子量发生变化时，引起的荧光信号反映的极化值发生变化，所以，可根据极化值的变化情况，考察分子之间的结合和解离。因而，从理论上说，所有分子的配基均可以用极化荧光方法检测出来，然而，实际情况却并非如想象的容易，该方法受到许多因素，如，荧光素分子的大小、荧光素标记位置、寿命长短、荧光素与受体蛋白的亲和度等许多因素的影响，找到恰当的极化荧光分子标记物，特异、灵敏地筛选目标分子的配基存在极大困难。筛选得到目标分子的配基以后，如何简便有效地确定配基为拮抗剂或者为激动剂也是未解决的问题。现有文献一般在进行基于极化荧光的高通量筛选后声称得到待选的“拮抗剂”，实际上是偷换概念，并不准确，因为“拮抗剂” 一定是配基，但是配基不一定是“拮抗剂”;配基也可能是“激动剂”。正确的实验方法应该是进行第二次实验对初筛样品进行复筛，现有文献所记载的复筛主要为western blotting技术,或者IP(免疫沉淀)技术。但是，这些技术具有很多的局限性，比如，一次可以处理的样品极其有限(每块胶最多可以上8-12个样品)，再如该技术的实验时间长，从实验开始到得到数据(8-12个样品)需要至少一个星期，并且，大多数情况下只能再次证明这些样品为“配基”，成本高，有效性低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种脂联素受体配基和激动剂的筛选方法。本发明脂联素受体配基的筛选方法，采用极化荧光技术筛选脂联素受体配基。其包括如下步骤(I)取脂联素用荧光分子标记，将脂联素受体与荧光标记的脂联素混合，得混合溶液；( 2)取待测样品，梯度稀释，分别与步骤(I)中混合溶液混合，测定极化荧光值并计算其亲和度；(3)根据亲和度，判断待测化合物是否为脂联素受体的配基。 其中，步骤(I)所述荧光标记的脂联素中，荧光分子与脂联素的摩尔比为1:1，荧光分子的标记位置在脂联素的N端。所述脂联素为gAPN和/或fAPN ;所述荧光分子为异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明(TMR)。其中，步骤(I)所述脂联素受体的浓度为0.5飞μ mol ;荧光标记的脂联素的浓度为10(T600nmol。优选地，所述脂联素受体的浓度为I μ mol ;荧光标记的脂联素的浓度为IOOnmol0其中，步骤(2)中，所述待测样品的初始浓度为5 15mM，进行6 12次对半稀释；待测样品与步骤(I)中混合溶液以体积比I :18 20混合。优选地，所述待测样品的初始浓度为10mM，进行7次对半稀释；与步骤(I)中混合溶液以体积比I :19混合。优选地，所述极化荧光技术为双重极化荧光技术。双重极化荧光技术是指同时使用两种荧光标记的脂联素筛选待检验品。本发明脂联素受体激动剂的筛选方法，其包括如下步骤取待检样品，采用前述配基筛选方法筛选后，再用细胞培养免疫极化荧光技术筛选。其中，所述细胞培养免疫极化荧光技术包括如下步骤a、取脂联素受体配基与细胞共培养6 18h ；b、裂解细胞，加入荧光标记的AMPK或者PPARa，以及AMPK抗体或者PPARa抗体；C、测定其极化荧光值并计算其亲和度；d、根据亲和度，判断待测化合物是否为脂联素受体的激动剂。步骤a所述细胞为骨骼肌C2C12细胞或者肝脏H印G2细胞。
所述步骤b中,所述荧光为异硫氰酸荧光素；所述荧光标记的AMPK或者PPAR α的浓度为O. 2^0. 3ηΜ ；ΑΜΡΚ抗体或者PPARa抗体的浓度为O. Γθ. 15ηΜ。本发明极化荧光技术筛选脂联素受体配基的方法，Z因子最高可达O. 86，可信度高，并且，稳定性好，准确度高；本发明双重极化荧光技术可大大降低假阳性结果，提高筛选的准确性；本发明脂联素受体激动剂的筛选方法，可以准确、有效地筛选脂联素受体激动齐U。本发明脂联素受体配基及激动剂的筛选方法操作简便，成本低廉，应用前景良好。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图I极化荧光偏振法测试标记蛋白的亲和度； 图2FITC_gANP极化荧光高通量AdipoRl配基筛选实验结果；图3TMR_gANP极化荧光高通量AdipoRl配基筛选实验结果；图4FITC-标记的AMPK极化荧光高通量AdipoRl激动剂筛选实验结果图5AdipoRl实验浓度测定；图6AdipoR2实验浓度测定；图7实验稳定性测定；图8极化荧光实验质量评估；图9脂联素受体配基AdipoRl双重标记极化荧光高通量筛选实验结果；图10化合物I极化荧光实验亲和度曲线；图11脂联素受体配基AdipoR2双重标记极化荧光高通量筛选实验结果。
具体实施例方式缩略语FITC-gAPN N 端标记 FITC 的 gAPN ；TMR-gAPN N 端标记 TMR 的 gAPN ；gAPN - FITC C 端标记 FITC 的 gAPN ；gAPN - TMR C 端标记 FITC 的 gAPN ；AdipoRl 脂联素受体I ;AdipoR2 :脂联素受体2 ；AMPK AMP蛋白激酶；PPARa :过氧化物酶体增殖物激活受体-a ；EC50 :半最大效应浓度；Ex/Em :激发波长/发射波长。实施例一脂联素受体配基的筛选制备最终浓度为600nM的FITC-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合物，然后将此混合物以19 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行11次浓度对半稀释，得到12种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-4. 88mM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ M-O. 25 μ Μ)。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 554/Em 575。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。如果未知化合物的EC5tl值在小于5 μ M浓度范围内，则可认为该化合物为AdipoRl的配基。实施例二脂联素受体配基的筛选制备最终浓度为600ηΜ的FITC-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoR2混合物，然后将19 μ L/孔此混合物加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ-0. 25 μ Μ)。将未知化合物用20 μ LDMSO溶解，制备5mM的储备液，对此储备液进行11次浓度对半稀释，得到12种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-4. 88mM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 554/Em 575。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合， 计算EC5tl值以及标准误差。如果未知化合物的EC5tl值在小于5 μ M浓度范围内，则可认为该化合物为AdipoR2的配基。实施例三脂联素受体配基的筛选制备最终浓度为IOOnM的FITC-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合物，然后将此混合物以19 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ_4 μ Μ)。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 554/Em 575。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。如果未知化合物的EC5tl值在小于5 μ M浓度范围内，则可认为该化合物为AdipoRl的配基。实施例四脂联素受体配基的筛选制备最终浓度为600ηΜ的TMR-gAPN以及最终浓度为5 μ M的AdipoR2混合物，然后将此混合物以18 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备15mM的储备液，对此储备液进行6次浓度对半稀释，得到7种不同浓度的待测样品(其浓度范围为15mM-234nM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围750 μ Μ-12 μ Μ)。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 551/Em 583。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。如果未知化合物的EC5tl值在小于5 μ M浓度范围内，则可认为该化合物为AdipoR2的配基。实施例五脂联素受体配基的筛选制备最终浓度为200nM的TMR gAPN以及最终浓度为O. 5 μ M的AdipoR2混合物，然后将此混合物以20 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备5mM的储备液，对此储备液进行12次浓度对半稀释，得到13种不同浓度的待测样品(其浓度范围为5mM-l. 22nM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围250 μ Μ-0. 0625 μ Μ)。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 551/Em 583。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。如果未知化合物的EC5tl值在小于5 μ M浓度范围内，则可认为该化合物为AdipoR2的配基。实施例六脂联素受体配基的筛选(I)制备最终浓度为IOOnM的FITC-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合物，然后将此混合物以19 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ_4 μ Μ)。 于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 554/Em 575。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。(2)制备最终浓度为IOOnM的TMR-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合物，然后将此混合物以19 μ L/孔加入384孔板中。将未知化合物用20 μ L DMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)。将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ_4 μ Μ)。于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex 551/Em 583。每一样品每一浓度应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。以极化荧光值为纵坐标，未知化合物浓度log值为横坐标作图，对数据进行标准曲线拟合，计算EC5tl值以及标准误差。(3)如果未知化合物在步骤(I)和步骤(2)中的EC5tl值均在小于5μ M浓度范围内，贝1J可认为该化合物为AdipoRl的配基。实施例七脂联素受体激动剂的筛选制备浓度为InM的AMPK抗体以及浓度为O. 5ηΜ的FITC-标记的AMPK的混合物，待用。将实施例一中得到的配基用DMSO溶解，制备成30倍其EC5tl浓度的储备液待用。于测定前48小时，将骨骼肌C2C12细胞(培养液10%胎牛血清DMEM)种植在黑色板壁黑色扁平板底384孔板中(900细胞/15 μ L/孔)。待细胞在37° C，5%C02孵箱中培养24小时后，将I μ L上述待测化合物储备液加入细胞培养液中(最终浓度为其EC50值)，继续在37° C，5%C02孵箱中培养24小时。将14μ L RIPA缓冲液加入每个样品中，将384孔板置于冰上15分钟，或者将384孔板置于_80°C冰箱中15分钟。待样品恢复至室温后，加5 μ LAMPK抗体以及FITC-标记的AMPK的混合物到样品中。于室温下培养30分钟，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax(Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Εχ554/Em 575。每一样品应进行3次测试。
待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。将样品所得极化荧光值与未加入任何样品的空白对照品所得极化荧光值进行比较，如果未知化合物的极化荧光值为空白样品的1/2以下，则可认为该化合物为AdipoRl的激动剂。实施例八脂联素受体激动剂的筛选制备浓度为InM的AAPR α抗体以及浓度为O. 5ηΜ的FITC-标记的AAPR α的混合物，待用。将实施例二中得到的配基用DMSO溶解，制备成30倍其EC50浓度的储备液待用。于测定前48小时，将肝脏HepG2细胞(培养液10%胎牛血清DMEM)种植在黑色板壁黑色扁平板底384孔板中(900细胞/15 μ L/孔)。待细胞在37° C，5%C02孵箱中培养24 小时后，将I μ L上述待测化合物储备液加入细胞培养液中(最终浓度为其EC50值)，继续在37° C，5%C02孵箱中培养24小时。将14μ L RIPA缓冲液加入每个样品中，将384孔板置于冰上15分钟，或者将384孔板置于-80°C冰箱中15分钟。待样品恢复至室温后，力口
5μ LAAPR α抗体以及FITC-标记的AAPR α的混合物到样品中。于室温下培养30分钟，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex554/Em 575。每一样品应进行3次测试。待仪器读取极化荧光值后，将得到的数据转换到SigmaPlot 11中进行数据处理。将样品所得极化荧光值与未加入任何样品的空白对照品所得极化荧光值进行比较，如果未知化合物的极化荧光值为空白样品的1/2以下，则可认为该化合物为AdipoR2的激动剂。实验例IgAPN-FITC、gAPN-TMR 和 FITC-gAPN 的极化荧光值I、实验方法 对荧光标记的蛋白(gAPN - FITC C端标记FITC的gAPN ；TMR-FITC C端标记gAPN的gAPN)进行11次浓度对半稀释，得到12种不同浓度的待测样品；该3种荧光标记的蛋白与AdipoRl混合，荧光标记的蛋白的终浓度为I μ Μ-0. 5ηΜ，共有12个梯度，AdipoRl的终浓度为I μ Μ，测定极化荧光值。2、实验结果实验结果如图I所示，gAPN-FITC以及gAPN-TMR系统所测的荧光偏振值不随荧光标记蛋白浓度的改变而改变，表明这两个荧光标记的蛋白不与受体蛋白有效结合，不能用于高通量筛�。鳩ITC-gAPN的极化荧光值随着荧光标记蛋白浓度的改变而改变，可以用于高通量筛选。实验结果说明，并非任意荧光标记的脂联素均可用于脂联素受体配基的筛�。夥肿覥端标记的脂联素，如gAPN-FITC、gAPN-TMR不能用于脂联素受体配基的筛�。夥肿覰端标记的脂联素，如FITC-gAPN可以用于脂联素受体配基的筛选。实施例2本发明方法筛选脂联素受体配基的验证实验为了验证发明方法的可行性，发明人在实验初期进行了一个双盲实验。该实验利用脂联素受体(AdipoRl)的天然激动剂fAPN作为实验的阳性对照，以及肌动蛋白(actin)作为阴性对照，进行实验。I、实验方法(I)终浓度为600nM的FITC-或者TMR-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合后转移19 μ L/孔至384孔板中；取样品I和样品2，分别用20 μ LDMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)；将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ-0. 25 μ Μ),于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax(Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定激发波长/发射波长(Ex/Em):485/538 (FITC系统);激发波长/发射波长(Ex/Em) :551/583 (TMR系统)。每一样品每一浓度进行3次测试。(2)制备浓度为InM的AMPK抗体以及浓度为O. 5nM的FITC-标记的AMPK的混合物，待用；将步骤(I)得到的配基用DMSO溶解，制备成30倍其EC5tl浓度的储备液待用；于测定前48小时，将骨骼肌C2C12细胞(培养液10%胎牛血清DMEM)种植在黑色板壁黑色扁平板底384孔板中(900细胞/15 μ L/孔)；待细胞在37° C，5%C02孵箱中培养24小时后，将I μ L上述待测化合物储备液加入细胞培养液中，继续在37° C，5%C02孵箱中培养24小时；将14μ LRIPA缓冲液加入每个样品中，将384孔板置于冰上15分钟，待样品恢复·至室温后，加5 μ LAMPK抗体以及FITC-标记的AMPK的混合物到样品中；于室温下培养30分钟，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex/Em: 554/575。每一样品进行3次测试。2、实验结果(I)实验结果如图2 3所不，样品I在初筛实验中能够取代灭光标记的蛋白FITC-gANP或者TMR-gANP)，用本发明方法检测，确认样品I为AdipoRl的配基。(2 )如图4所示，经样品I处理的骨骼肌C2C12细胞裂解液与AMPK抗体以及FITC-标记的AMPK的混合物混合培养后，样品I逐渐释放出FITC-标记的AMPK，表明样品I为AdipoRl的激动剂。实验结束后，经确证，样品I为fAPN，fAPN是脂联素受体的激动剂，样品2为肌动蛋白(actin)，不是脂联素受体的配基，表明本发明方法可以准确筛选脂联素受体配基和激动剂。实验例3脂联素受体配基AdipoRl标记极化荧光高通量实验条件的优化I、实验方法(I)荧光标记蛋白以及受体蛋白实验浓度的确定a :将10 μ I/孔终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN储备液加入384孔板中；制备最终浓度为2. 5 μ M的AdipoRl储备液并对其进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为2. 5 μ Μ-0. 01 μ Μ);将10 μ L/孔待测样品加入384孔板中与终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN储备液混合，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (M5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定激发波长/发射波长(Ex/Em) =485/538 (FITC 系统);激发波长 / 发射波长(Ex/Em) :551/583 (TMR 系统)。每一样品每一浓度进行3次测试。b :将10 μ I/孔终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN储备液加入384孔板中；制备最终浓度为2. 5 μ M的AdipoR2储备液并对其进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为2. 5 μ Μ-0. 01 μ Μ);将10 μ L/孔待测样品加入384孔板中与终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN储备液混合，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (M5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定激发波长/发射波长(Ex/Em) =485/538 (FITC 系统);激发波长 / 发射波长(Ex/Em) :551/583 (TMR 系统)。每一样品每一浓度进行3次测试。2、实验结果( I)荧光标记蛋白以及受体蛋白实验浓度a =AdipoRl蛋白的实验结果实验结果如图5所示，红色标记代表TMR系统，绿色标记代表FITC系统。FP实验的有效窗口为与AdipoRl蛋白结合的FITC-多肽的荧光偏振值与未结合的FITC-多肽的荧光偏振值的差值(ΔηιΡ=ηιΡ ofbound probe - mP offree probe)。FITC系统的有效实验窗口为 AmP=200-50=150mP ;TMR 系统的有效实验窗口为 ΛmP=300-100=200mP。结果表明，如果浓度太小则实验的有效测定范围太窄，不足以区别不同亲和度 的激动剂；如果浓度太大，则荧光标记蛋白不能完全与受体蛋白结合，即使激动剂与受体蛋白结合，也不能取代荧光标记蛋白，导致测定结果不准确。Adip0Rl蛋白的实验浓度为O. 5飞μ M时，有效实验窗口大，能满足测定要求，其中，最优为I μ Μ,有效实验窗口大。b :AdipoR2蛋白的实验结果实验结果如图6所示，空心圆圈记代表TMR系统，实心圆圈标记代表FITC系统。FP实验的有效窗口为与AdiopR2蛋白结合的FITC-多肽的荧光偏振值与未结合的FITC-多肽的突光偏振值的差值(ΔηιΡ=ηιΡ ofbound probe - mP of free probe)。FITC系统的有效实验窗口为 AmP=160-40=120mP ;TMR 系统的有效实验窗口为 ΛmP=160_40=120mP。实验结果表明，如果浓度太小则实验的有效测定范围太窄，不足以区别不同亲和度的激动剂；如果浓度太大，则荧光标记蛋白不能完全与受体蛋白结合，即使激动剂与受体蛋白结合，也不能取代荧光标记蛋白，导致测定结果不准确。AdipoR2蛋白的实验浓度为0. 5飞μ M时，有效实验窗口大，能满足测定要求，其中，最优为I μ Μ,有效实验窗口大。实验例4本发明双重标记极化荧光高通量筛选方法的稳定性和Z因子测试I、实验方法( I)极化荧光实验稳定性测定a AdipoRl的稳定性测定方法将终浓度为IOOnM的TMR-gAPN或者IOOnM的FITC-gAPN分别与终浓度为I μ M的AdipoRl蛋白混合，并分别在0，3，6，24，26小时对实验数据进行测定分析；b :AdipoR2的稳定性测定方法将终浓度为IOOnM的FITC-gAPN分别与终浓度为I μ M的AdipoR2蛋白混合，并分别在0，3，6，24，26小时对实验数据进行测定分析。(2)评估极化荧光实验质量(Z因子测试)a AdipoRl的Z因子测试方法通过重复大约400次FP实验(终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoRl混合后转移20 μ L/孔至384孔板中，测定极化荧光值(信号);将最终浓度为I μ M的AdipoRl混合后转移20 μ L/孔至384孔板中，测定极化突光值(背景);利用公式ζ因子=1-3 (cvon)/|yp-yn|)进行计算，其中。=标准差，P=信号，η=背景)，得到该极化荧光实验的Z因子数值。b AdipoR2的Z因子测试方法。通过重复大约400次FP实验(终浓度为IOOnM的FITC-或者TMR-gAPN以及最终浓度为I μ M的AdipoR2混合后转移20 μ L/孔至384孔板中，测定极化荧光值(信号);将最终浓度为I μ M的AdipoR2混合后转移20 μ L/孔至384孔板中，测定极化荧光值(背景);利用公式ζ因子=1-3 (cvon)/|yp-yn|)进行计算，其中。=标准差，P=信号，η=背景)，得到该极化荧光实验的Z因子数值。2、实验结果(I)稳定性
实验结果如图7所示，用本发明极化荧光检测方法26小时内都能维持稳定的有效测试窗口，稳定性好。(2) Z 因子a AdipoR2的Z因子测定结果。如图8所示，FITC-gAPN系统的Z因子数值为O. 81 ；TMR-gAPN系统的Z因子数值为O. 86，均大于O. 5，由此可知该实验具有良好的重复性，可以作为高通量筛选模型；b AdipoR2的Z因子测定结果。如图8所示，FITC-gAPN系统的Z因子数值为O. 76 ；TMR-gAPN系统的Z因子数值为O. 63，均大于O. 5，由此可知该实验具有良好的重复性，可以作为高通量筛选模型。本发明极化荧光高通量方法的稳定性强，Z因子高，说明本发明方法可行，结果可
信度高。实验例5本发明双重标记极化荧光高通量方法筛选脂联素受体的配基和激动剂I、实验方法(I)脂联素受体的配基的筛选a :将终浓度为IOOnM的FITC-gAPN和TMR-gAPN分别于最终浓度为I μ M的AdipoRl混合后转移19 μ L/孔至384孔板中；取10，000个化合物，用20 μ L DMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)；分别将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ-0. 25 μ Μ),于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定激发波长/发射波长(Ex/Em) :485/538 (FITC系统);激发波长/发射波长(Ex/Em) :551/583 (TMR系统)。每一样品每一浓度进行3次测试。)b :脂联素受体配基AdipoR2双重标记极化荧光高通量筛选将终浓度为IOOnM的FITC-gAPN和TMR-gAPN分别于最终浓度为I μ M的AdipoR2混合后转移19 u L/孔至384孔板中；取10，000个化合物，用20 μ LDMSO溶解，制备IOmM的储备液，对此储备液进行7次浓度对半稀释，得到8种不同浓度的待测样品(其浓度范围为10mM-78nM)；分别将I μ L/孔待测样品加入384孔板中(最终浓度范围500 μ Μ-0. 25 μ Μ),于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定激发波长/发射波长(Ex/Em) :485/538 (FITC系统);激发波长/发射波长(Ex/Em) :551/583 (TMR系统)。每一样品每一浓度进行3次测试。(2)脂联素受体激动剂的筛选制备浓度为InM的AMPK抗体以及浓度为O. 5nM的FITC-标记的AMPK的混合物，待用；将步骤(I)得到的配基用DMSO溶解，制备成30倍其EC5tl浓度的储备液待用；于测定前48小时，将骨骼肌C2C12细胞(培养液10%胎牛血清DMEM)种植在黑色板壁黑色扁平板底384孔板中(900细胞/15 μ L/孔)；待细胞在37°C，5%C02孵箱中培养24小时后，将I μ L上述待测 化合物储备液加入细胞培养液中，继续在37° C，5%C02孵箱中培养24小时；将14μ LRIPA缓冲液加入每个样品中，将384孔板置于冰上15分钟,待样品恢复至室温后，加5 μ LAMPK抗体以及FITC-标记的AMPK的混合物到样品中；于室温下培养30分钟，于测试前震动384孔30秒板使溶液充分混合，使用SpectraMax (Μ5)对样品极化荧光值进行读取。仪器应设定在Ex/Em: 554/575。每一样品进行3次测试。2、实验结果实验结果如图扩11以及表I所示表I :脂联素受体激动剂极化荧光高通量筛选实验结果
骨骼肌C2C12细胞系统肝脏HepG2细胞系统
化合AMPK抗体系统极化 AAPRot抗体系统极—~AMPK抗体系统极化 AAPRot抗体系统极
物荧光值(mP)__化荧光值(mP)__荧光值(mP)__化荧光值(mP)
对照__244±15__300±17__209土 8__255±23_
_I__199士 18___120 士 7__
2__176 土 13___188 士 5__
3__96 士 15___78±4__
4__201 士5___144 士 9__
_5__255士 23___]84 士 4__
6__166±8___156 士 22__
7__8 9士 17___102士12__
_8__5 9士 15___77±8__
9__128 士 17___166土 15__
10__134 士 6___187 土 8__
11__202士 8___213士4__
12__236土 19___222士21__
13__245土 10___218 土 15__
14__234土 18___201 士 17__
15__224士 19___184±8__
16___103 士 12___54士玉7_
17___278士21___233士 19_
18丨45士2369士12 —(I)由表I和图9 10可知，FITC-gAPN极化荧光高通量筛选得到55个AdipoRl配基，TMR-gAPN极化荧光高通量筛选得到78个AdipoRl配基，FITC-gAPN、TMR-gAPN双重标记极化荧光高通量筛选得到18个AdipoRl配基，其中，15个AdipoRl配基(化合物f 15)具有完整的亲和力曲线，化合物I的亲和力曲线如图10所示。(2)由表I和图11可知，FITC-gAPN极化荧光高通量筛选得到26个AdipoRl配基，TMR-gAPN极化荧光高通量筛选得到33个AdipoR2配基，FITC-gAPN、TMR-gAPN双重标记极化荧光高通量筛选得到5个AdipoR2配基，其中，3个AdipoR2配基(化合物16 18)具有完整的亲和力曲线。(3)由表I可知，通过细胞培养免疫极化荧光技术的筛�。玫�3个AdipoRl激动剂(化合物3，7，8)以及2个AdipoR2激动剂(化合物16，18)。实验结果说明，本发明FITC-gAPN、TMR-gAPN极化荧光高通量筛选方法可用于脂联素受体配基的筛�。現ITC-gAPN、TMR-gAPN双重标记极化荧光高通量方法中，两种荧光物质具有不重合的激发波长以及吸收波长(FITC:激发波长/发射波长为Ex/Em 485/538; TMR:激发波长/发射波长为Ex/Em =551/583),因此大大降低了假阳性结果，提高了筛选的准确性。另一方面，本发明细胞培养免疫极化荧光技术可用于脂联素受体激动剂 的筛选。综上，用本发明脂联素受体的配基和激动剂筛选方法准确、有效、稳定，操作简便，成本低廉，为筛选抗炎、抗糖尿病以及动脉粥样硬化的药物打下良好的基�。哂辛己玫牧俅布肮ひ涤τ们熬�。
权利要求
1.一种脂联素受体配基的筛选方法，其特征在于采用极化荧光技术筛选脂联素受体配基。
2.根据权利要求I所述的筛选方法，其特征在于其包括如下步骤 (1)取脂联素用荧光分子标记，将脂联素受体与荧光标记的脂联素混合，得混合溶液； (2)取待测样品，梯度稀释，分别与步骤(I)中混合溶液混合，测定极化荧光值并计算其亲和度； (3)根据亲和度，判断待测化合物是否为脂联素受体的配基。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(I)所述荧光标记的脂联素中，荧光分子与脂联素的摩尔比为1:1，荧光分子的标记位置在脂联素的N端。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于所述脂联素为gAPN和/或fAPN;所述荧光分子为异硫氰酸荧光素或四甲基罗丹明。
5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(I)所述脂联素受体的浓度为O.5^5 μ mo I ;突光标记的脂联素的浓度为10(T600nmol。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于所述脂联素受体的浓度为Iμ mol ;荧光标记的脂联素的浓度为IOOnmol。
7.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，所述待测样品的初始浓度为5 15mM，进行6 12次对半稀释；待测样品与步骤(I)中混合溶液以体积比I :18 20混八口 ο
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于所述待测样品的初始浓度为10mM，进行7次对半稀释；与步骤(I)中混合溶液以体积比I :19混合。
9.根据权利要求I所述的筛选方法，其特征在于极化荧光技术为双重极化荧光技术。
10.一种脂联素受体激动剂的筛选方法，其特征在于其包括如下步骤取待检样品，采用权利要求Γ9任意一项所述方法筛�。儆孟赴嘌庖呒饧际跎秆�。
11.根据权利要求10所述的筛选方法，其特征在于所述细胞培养免疫极化荧光技术包括如下步骤 a、取脂联素受体配基与细胞共培养6 18h； b、裂解细胞，加入荧光标记的AMPK或者PPARα，以及AMPK抗体或者PPAR α抗体； C、测定其极化荧光值并计算其亲和度； d、根据亲和度，判断待测化合物是否为脂联素受体的激动剂。
12.根据权利要求11所述的筛选方法，其特征在于步骤a中所述细胞为骨骼肌C2C12细胞或者肝脏IfepG2细胞。
13.根据权利要求11所述的筛选方法，其特征在于所述步骤b中，荧光为异硫氰酸荧光素；荧光标记的AMPK或者PPAR α的浓度为O. 2^0. 3ηΜ ；ΑΜΡΚ抗体或者PPAR α抗体的浓度为 O. Γθ. 15ηΜ。
全文摘要
本发明公开了一种脂联素受体配基的筛选方法，它是采用极化荧光技术筛选脂联素受体配基。本发明还公开了脂联素受体激动剂的筛选方法，其包括如下步骤取待检样品，采用前述配基筛选方法筛选后，再用细胞培养免疫极化荧光技术筛选。本发明脂联素受体配基及激动剂的筛选方法可以准确、有效地筛选脂联素受体的配基及其激动剂，为筛选抗炎、抗糖尿病以及动脉粥样硬化的药物打下良好的基�。哂辛己玫墓ひ涤τ们熬�。
文档编号G01N21/64GK102879587SQ20121040286
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月19日 优先权日2011年10月21日
发明者孙毅毅, 钟玲, 林东, 陈修平 申请人:成都医学院
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