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专利名称：稳定的NT-proBNP校准品及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品及其制备方法与应用。
背景技术：
1988年，日本学者Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为脑钠肽或称钠尿肽(Brain Natriuretic Peptide, BNP)。此后的研究表明，在生物进化的过程中逐渐发展产生包括BNP在内的一组多肽ANP、BNP、CNP、DNP、VNP等，称为利钠肽家族，其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力的稳态。BNP主要存在于心室隔膜颗粒中，其分泌依赖于心室的容积扩张和压力负荷增加。作为心功能紊乱最敏感和最特异的指标，BNP具有重要的临床意义。最早在ESC《慢性心力衰竭指南
(2001)》，继而在美国ACC/AHA《慢性心力衰竭指南(2005)》中推荐将血液BNP水平测定作为心力衰竭的诊断和预后指标。2008年ESC《急性和慢性心力衰竭指南》和2009年AHA《心力衰竭指南》对此作了进一步的推荐。当心肌细胞受刺激后，会产生含134个氨基酸的B型利钠肽原前体(pre-proBNP),随后在相关酶的作用下切掉N端的信号肽序列，形成含108个氨基酸的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的N端产物N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)和含有32个氨基酸有活性的C端产物B型利钠肽(BNP)。BNP的清除主要通过与BNP清除受体结合，而NT-proBNP则主要由肾小球滤过，因此，其血浓度受肾功能影响大于BNP。BNP半衰期短(22min)，体外稳定性差，而NT-proBNP半衰期较长(120min)，体外稳定性强，在心力衰竭患者中的浓度较BNP高，在有些情况下更有利于心力衰竭的诊断。美国在2004年和2008年分别发表了 BNP临床应用专家共识和国际NT-proBNP专家共识，系统阐述了 BNP和NT-proBNP的生物学和临床应用。BNP和NT-proBNP检测在21世纪初先后进入我国，10年来已经被各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断和评估十分有用的生物标志物。我国2007年《慢性心力衰竭诊断治疗指南》和2010年《急性心力衰竭诊断治疗指南》也推荐将NT-proBNP和BNP用于心力衰竭的诊断和预后判断。但是在试剂盒开发和使用过程中，定标液的稳定性较差，尤其对于基于板式酶免平台的诊断试剂，由于其每次测定均需同时定标，所以对试剂盒校准品的稳定性要求较高。NT-proBNP是由76个氨基酸组成的蛋白，生产商在试剂盒和开发过程中，多采用重组蛋白作为校准品。但是大量的研究发现，由于原核重组表达的蛋白缺乏糖基化，其稳定性较天然蛋白更差。目前没有见到稳定性优良的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品。

发明内容
本发明根据上述领域存在的需求和空白，提供一种稳定的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，技术方案如下一种NT-proBNP校准品，其特征在于所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕获抗体表位肽段一连接肽一 NT-proBNP检测抗体表位肽段。所述线性结构为从氨基端到羧基端为ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕获抗体表位肽段一连接肽一NT-proBNP检测抗体表位肽段。所述连接肽为4 10个亲水氨基酸残基构成的短肽。所述连接肽中不含有易形成转角和α -螺旋的氨基酸或多肽序列。所述连接肽段的氨基酸序列如Seq ID No. 2、3和8 13任一所示。所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP捕获抗体表位肽段氨基酸序列如Seq IDNo. 15、No. 17 任一所示。所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP检测抗体表位肽段氨基酸序列如Seq IDNo. 14、No. 16 任一所不。 所述NT-proBNP校准品，其氨基酸序列如Seq ID No. 18 25任一所示。上述任一 NT-proBNP校准品在检测NT-proBNP和proBNP蛋白的试剂盒中的作为校准品的用途。本发明提供一种人工设计的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，其包含一对通过人工设计的连接肽连接的稳定的NT-proBNP抗原表位。为了提高本发明的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品的稳定性，本发明中设计的连接肽为4 10个氨基酸组成。为了防止多肽二聚体形成、线性序列的空间折叠及合成多肽的溶解性，试验进一步优化了 linker的大小、氨基酸序列组成及其空间特性,设计获得如表I中Seq ID No. 2所示的连接肽，实验证明采用这些连接肽的本发明获得的校准品具有更好的溶解性。为防止二聚体的形成，linker的设计过程中剔除了半胱氨酸的选择；为了保持多肽的线性，linker选择剔除了脯氨酸等易形成转角的氨基酸，根据此设计出如。如表I中Seq ID No. 2所示的连接肽，实验证明采用这些连接肽的本发明获得的校准品具有更好的溶解性和稳定性。据文献报道，NT-proBNP中表位EPl (5-12)和表位EP2 (67-76)较为稳定且无糖基化位点，这样不仅可以防止表位降解，而且可以保持制备的表位与天然的表位相一致，因此本发明的一个实施例中，选择表位EPl和表位EP2作为定量分析的抗体识别表位，如表2中 SeqID No. 14、No.15。 本发明的一个优选实施例中，为了降低I inker及其他因素对抗体-表位识别的影响，试验优化选择表位ΕΡΓ (4-13)、表位EP2’ (66-76)作为定量分析抗体识别表位，如表2 中 SeqID No. 16、No. 17。综上，本发明提供的校准品，由于具有ΝΤ-ρι·οΒΝΡ的表位，所以可以与其相应的抗体结合。同时，由于剔除了 ΝΤ-ρι·οΒΝΡ不稳定的氨基酸序列，选择较为稳定的表位，并用稳定的多肽linker将两个表位连接，所以由此制备的校准品更加稳定。本发明提供的校准品可用于NT-proBNP和proBNP不稳定蛋白试剂盒的校准品。本发明提供的校准品由于都是短肽，优选采用人工合成的方法制备。术语解释NT-proBNP捕获抗体表位指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗体对其起捕获作用的区域，是由一段氨基酸序列构成。
NT-proBNP检测抗体表位指NT-proBNP中，抗NT-proBNP抗体对其起检测作用的区域，是由一段氨基酸序列构成。连接肽,指人工设计的短肽,本发明中主要起到提高由NT-proBNP捕获抗体表位和ΝΤ-ρι·οΒΝΡ检测抗体表位构成的校准品的稳定性，实现两个人工合成的表位的空间结构使其发挥对抗体的捕获及检测功能。P / N :即阳性/阴性,指阳性(P, positive)读值与阴性(N, negative)读值的比值，此比值越高代表试剂盒区分阴阳性的能力越强。


图1.标准曲线，图2.方法学比较结果。
具体实施例方式以下通过具体实施方式
说明本发明的技术方案及其效果。试验所需溶液和试剂1.1OmM PB 称取称取0. 27g磷酸二氢钾(KH2P04)(国药，10017608)、1. 42g磷酸氢二钠(Na2HP04)(国药，100203008)、ImL Proclin300 (Sigma，48914-U)于 900mL 超纯水中，完全溶解后调节PH至7. 4，然后用容量瓶定容至1L。2.1OmM PBS 称取0. 27g 磷酸二氢钾(KH2P04)(国药，10017608)、1. 42g 磷酸氢二钠(Na2HP04)(国药，100203008),8g 氯化钠(NaCl)(国药，10019308)、0· 2g 氯化钾(KCl)(国药，10016308)、lmL Proclin300 (Sigma,48914-U)于 900mL 超纯水中，完全溶解后调节 pH 至7. 4，然后用容量瓶定容至1L。3. 0. 5%BSA IOmM PBS 含有0. 5% (ff/V) BSA 牛血清白蛋白(amresco，0332)的 IOmM PBS 溶液。4.洗涤液含有0. 05% (V/V) Tween-20 (sigma,44112)的 IOmM PBS 溶液。5.合成多肽本发明中表3所列的多肽均由上海生工生物合成。6. NT-proBNP 抗体 4NT1-29D12、4NT1-24E11 均购于 Hytest。7.重组 NT-proBNP (1-76 氨基酸，8NT2)蛋白购于 Hytest。8.底物 A 和底物 B (Thermo, 34080)表I本发明中设计的连接肽
权利要求
1.一种NT-proBNP校准品，其特征在于所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为ΝΤ-ρι·οΒΝΡ捕获抗体表位肽段一连接肽一 NT-proBNP检测抗体表位肽段。
2.根据权利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，所述线性结构为从氨基端到羧基端为 NT-proBNP捕获抗体表位肽段一连接肽一 NT-proBNP检测抗体表位肽段。
3.根据权利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，所述连接肽为4 10个亲水氨基酸残基构成的短肽。
4.根据权利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，所述连接肽中不含有易形成转角和 α-螺旋的氨基酸或多肽序列。
5.根据权利要求1所述的ΝΤ-ρι·οΒΝΡ校准品，所述连接肽段的氨基酸序列如Seq IDNo. 2、3和8 13任一所示。
6.根据权利要求1 5任一所述的NT-proBNP校准品，所述NT-proBNP校准品的 NT-proBNP捕获抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No. 15、No. 17任一所示。
7.根据权利要求6所述的NT-proBNP校准品，所述NT-proBNP校准品的NT-proBNP检测抗体表位肽段氨基酸序列如Seq ID No. 14、No. 16任一所不。
8.根据权利要求7所述的NT-proBNP校准品，其氨基酸序列如SeqID No. 18 25任一所示。
9.权利要求1 8任一所述NT-proBNP校准品在检测NT-proBNP和proBNP蛋白的试剂盒中的作为校准品的用途。
全文摘要
本发明提供一种稳定的NT-proBNP校准品及应用，属于生物检测试剂。其特征在于所述NT-proBNP校准品为多肽，其线性结构为NT-proBNP捕获抗体表位肽段－连接肽－NT-proBNP检测抗体表位肽段。基于该结构，发明人提供了一序列经试验验证具有较好稳定性、溶解性的校准品。可作为检测NT-proBNP和proBNP蛋白的试剂盒中的校准品。
文档编号G01N33/68GK103012595SQ20121054852
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者肖智, 焦守恕, 李全 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司