专利名称：采用时间分辨荧光的基于膜的检测的制作方法
相关申请本申请是于2002年8月27日申请的美国申请系列号No.10/22837的系列申请。
背景技术：
人们已经研究出了采用荧光标记物的检测方法，从而有利于检测分析物。荧光通常是三阶段过程的结果。在第一阶段，由外部源提供能量，例如白炽灯或激光，能量被荧光化合物吸收，得到激发的电子单重态。在第二阶段，激发态持续一有限时间，在此期间，荧光化合物发生构型改变，同时还与其分子环境发生多种相互作用。在此时间内，激发态的能量部分被消耗，产生弛豫态，其是荧光发射的来源。第三阶段为荧光发射阶段，发射能量，将荧光化合物返回至基态。发射出的能量低于其激发能(灯或激光)，因此具有较长的波长。这种能量或波长的漂移或不同使得发出的能量能够被检测出来，并与激发能分离开来。
常规荧光检测通常利用波长过滤将发射光子同激发光子分离开来，以及利用检测器记录发射光子并生成可记录的输出，所述输出通常为电信号或摄影图像。然而，常规荧光检测技术存在一些问题。例如，大多数生物液体具有自荧光，其可以降低检测准确性。检测装置也可以具有某些自荧光。许多常规荧光标记物的小的斯托克司频移例如20至50纳米，增加了干扰。
对于常规荧光检测技术中存在的某些问题，研究出了一种称为“时间分辨”荧光的技术。时间分辨荧光涉及用短脉冲光激发荧光标记物，在激发之后以及测量剩余的寿命较长的荧光信号之前，等待一特定时间(例如大约100至200微秒之间)。这样，消除了任意寿命较短的荧光背景信号和散射激发辐射。尽管时间分辨技术已经成功地在某些类型的检测装置中使用，例如基于比色杯的仪器，但是在其它类型的检测装置中结合时间分辨技术仍然存在问题，例如基于膜的装置。
特别是，常规时间分辨系统，例如基于单色器的系统涉及非常复杂而且昂贵的仪器。例如，典型的研究级实验用荧光计为双重的单色器系统，其中一个单色器用于选择激发波长，另一个单色器用于选择检测波长。其复杂性显著增加了系统的成本，同时要求体积较大的、不便于携带的、笨重的仪器。此外，当常规的时间分辨系统与基于膜的检测装置结合使用时存在问题。特别是，在基于膜的装置中，分析物的浓度减少了，这是因为其被可以流经所述多孔膜的液体稀释了。不幸的是，在如此低的分析物浓度下，背景干扰格外地有问题，其原因是待检测的荧光强度相对较低。由于膜结构还趋向于反射发出的光，检测器精确测量标记分析物的荧光强度的能力显著减少。实际上，所发出的荧光信号的强度通常比多孔膜反射的激发光低3至4个量级。
因此，目前需要有一种简单、便宜而且有效的系统用于测量基于膜的检测装置的荧光。
本发明的简要描述根据本发明的一个实施方式，公开了一种检测测试样品中分析物的存在或者量的方法，其包括i)提供流式检测装置，其包括与荧光标记物流体连接的多孔膜，所述荧光标记物的荧光发射寿命大于大约1微秒，所述多孔膜限定一检测区；ii)将荧光标记物与测试样品接触，从而形成混合物(例如，溶液、悬浮液等等)；iii)使所述混合物流至检测区；iv)在检测区附近放置一时间分辨荧光读数器，所述荧光读数器包括脉冲式激发源和按时选通检测器；v)用所述脉冲激发源激发检测区的荧光标记物，其中所述激发导致荧光标记物发出检测信号；以及vi)用按时选通检测器测量检测信号的强度。
所述荧光标记物包括钐、镝、铕、铽的镧系螯合物或它们的混合物。而且，在某些实施方式中，荧光标记物的发射寿命大于大约10微秒，在某些实施方式中大于约50微秒，以及在某些实施方式中为大约100至大约1000微秒。同样，荧光标记物的斯托克司频移可以大于约50纳米，在某些实施方式中，大于约100纳米，以及在某些实施方式中为大约250至大约350纳米。如果需要，所述标记物可以与微粒结合使用，所述微粒用所述分析物的特定结合组分修饰。
可以采用所述荧光读数器精确地激发标记物，并检测基于膜的检测装置的荧光，不需要采用昂贵的组件，例如单色器或窄发射带宽的滤波器。在一个实施方式中，例如，所述脉冲激发源为硅光电二极管。荧光读数器还可以含有与脉冲激发源和按时选通的检测器相连接的定时电路(例如A/D转换器，微处理器，放大器，分配器，晶体振荡器，晶体管，触发电路等)，从而控制信号脉冲和检测。
根据本发明的另一实施方式，公开了一种检测测试样品中分析物的存在或者量的方法，其包括i)提供流式检测装置，其包括与结合探针流体连接的多孔膜，所述探针含有镧系螯合物，所述镧系螯合物的荧光发射寿命大于约50微米，其斯托克司频移大于大约100纳米，所述多孔膜限定了一检测区和校正区；以及ii)结合探针与测试样品接触从而形成混合物；iii)使混合物流至检测区和校正区；iv)在检测区和校正区附近放置一时间分辨荧光读数器，所述荧光读数器包括脉冲式发光二极管和按时选通检测器，所述检测器包括硅光电二极管，以及两者的组合；v)用脉冲式发光二极管激发检测区和校正区内的镧系螯合物，其中所述激发导致检测区内的镧系螯合物发出检测信号，使校正区内的镧系螯合物发出校正信号；vi)用按时选通检测器测量检测信号和校正信号；vii)比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中分析物量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例；。
检测区的荧光标记物可以与校正区的荧光标记物同时或分别激发。同样，可以同时或者单独测量检测信号和校正信号。
以下将对本发明的其它特征和方面进行详细描述。
附图的简要说明参考以下附图，针对本领域的技术人员，在本说明书的以下部分对本发明进行全面的公开，包括最佳实施方式，其中附
图1为本发明一个实施方式的基于膜的装置的透视图；
附图2为可用于本发明的时间分辨荧光读数器的一个实施方式的示意图，包括代表性的电子组件；附图3为可用于本发明的时间分辨荧光读数器的另一实施方式的示意图，包括代表性的电子组件；附图4为可用于本发明的时间分辨荧光读数器的另一实施方式的示意图，包括代表性的电子组件；附图5为例2中所得结果的标化激发和发射光谱的图形；以及附图6为例4中所得结果的标化荧光强度对分析物浓度(毫微克每毫升)的图形。
在本说明书和附图中重复使用的附图标记代表本发明的相同或类似特征或元件。
代表实施方式的详细描述定义在本文中，术语“分析物”通常是指待检测物质。例如，分析物可以包括抗原性物质，半抗原，抗体以及它们的组合。分析物包括但不限于毒素、有机化合物、蛋白质、肽、微生物、氨基酸、核酸、激素、类固醇、维生素、药物(包括出于治疗目的以及违法目的服用的药物)、药物中间物或副产物、细菌、病毒颗粒、以及上述物质的代谢物或者抗体。某些分析物的特定例子包括铁蛋白；肌酐激酶MIB(CK-MB)；地高辛；苯妥英；鲁米那；酰胺咪嗪；万古霉素；庆大霉素；茶碱；丙戊酸；奎尼�。淮倩铺迳伤�(LH)；卵泡刺激素(FSH)；雌二醇，黄体酮；C-反应蛋白；lipocalins；IgE抗体；维生素B2微球蛋白；糖化血红蛋白(Gly，Hb)；皮质醇；洋地黄毒甙；N-乙酰普鲁卡因胺(NAPA)；普鲁卡因胺；风疹病毒抗体，例如风疹病毒-IgG和风疹病毒IgM；弓形虫抗体，例如弓形虫IgG(Toxo-IgG)和弓形虫IgM(Toxo-IgM)；睾丸激素；水杨酸盐；对乙酰氨基酚；乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；乙肝病毒核心抗原的抗体，例如抗乙肝病毒核心抗原IgG和IgM(抗-HBC)；人类免疫缺陷病毒1和2(HIV1和2)；人类T细胞白血病毒1和2(HTLV)；乙肝病毒e抗原(HBeAg)；抗乙肝病毒e抗原的抗体(抗-HBe)；甲状腺刺激素(TSH)；甲状腺素(T4)；总三碘甲状腺氨酸(总T3)；游离三碘甲状腺氨酸(游离T3)；癌胚抗原(CEA)；和α甲胎蛋白(AFP)。滥用的药物和经控制的物质包括但不限于，苯丙胺；甲基苯异丙胺；巴比妥类，例如异戊巴比妥，司可巴比妥，戊巴比妥和巴比妥；苯二氮，例如甲氨二氮卓和安定；大麻成分，例如大麻粉和大麻毒品；可卡因；芬太尼；LSD；安眠酮；鸦片剂，例如海洛因、吗啡、可待因、二氢吗啡酮、氢可酮、美沙酮、14-羟基二氢可待因酮、氧吗啡酮和鸦片；苯环己哌啶；和丙氧酚。其它潜在的分析物参见Everhart等的美国专利No.6436651和Tom等的美国专利NO.4366241。
本文中，术语“测试样品”通常是指怀疑含有分析物的材料。所述测试样品可以从其来源直接应用，或者对其进行预处理从而修饰样品的特征。测试样品可以来自任何生物来源，例如生理液体，包括血液、胞间液、唾液、接触镜液体、脑脊液、汗液、尿液、乳汁、腹水、raucous、滑液、腹膜液、阴道粘液、羊水等。在使用前可以对测试样品进行预处理，例如从血液制备血浆、稀释粘性液体等等。处理的方法涉及过滤、沉淀、稀释、蒸馏、浓缩、对干扰组分的灭活以及加入试剂。除了生理液体之外，也可以使用其它液体样品，例如水、食物等等，从而进行环境或食品生产检测。另外，怀疑含有分析物的固体材料也可以用作测试样品。在某些情况下，对固体测试样品进行修饰从而形成液体介质或释放分析物是有利的。
详细描述现在对本发明的不同实施方式进行详细参考，以下描述了一个或几个例子。本发明对每个例子进行了解释，但不限制本发明。实际上，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对本发明进行各种修改和变化对于本领域技术人员来说，是显而易见的。例如，举例或者描述的作为实施方式一部分的特征可以用于另一实施方式中，从而得到其它实施方式。因此，在以下权利要求及其等同物的范围内，本发明包括了上述修改和变化。
总的来说，本发明涉及基于膜的检测装置，用于检测测试样品中分析物的存在或量。该装置利用时间分辨荧光检测被激发的荧光标记物产生的信号。由于标记物可以具有较长的发射寿命，实际上可以在检测过程中消除多个来源的背景干扰，例如散射光和自荧光。此外，本发明中采用的荧光读数器具有简单而且便宜的设计。例如，在一个实施方式中，所述读数器可以利用脉冲式发光二极管(LED)和硅光电二极管精确激发标记物并检测基于膜的检测装置的荧光，而不需要使用昂贵的组件，例如单色器或窄发射带宽的滤波器。
参照附图1，例如，现在对根据本发明形成的流式检测装置20的一个实施方式进行详细描述。如图所示，装置20含有多孔膜23，其可选择地由一刚性材料21支撑。通常，所述多孔膜23可以由多种材料中的任意一种构成，测试样品能够通过所述材料。例如，用于构成多孔膜23的材料可以包括但不限于，天然、合成或者经合成修饰的天然形成的材料，例如多糖(例如纤维素材料，例如纸和纤维素衍生物，例如醋酸纤维素和硝酸纤维素)；聚醚砜；尼龙膜；硅土；无机材料，例如去活性的氧化铝、硅藻土、MgSO4、或其它均匀分散在多孔聚合物基质中的无机细小分离材料，聚合物例如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物、和氯乙烯-醋酸乙烯共聚物；布料，包括天然形成(例如棉花)和合成的(例如尼龙和人造丝)；多孔胶，例如硅胶、琼脂糖胶、葡聚糖和白明胶；聚合物膜，例如聚丙烯酰胺；等等。在一特定实施方式中，所述多孔膜23由硝酸纤维素和/或聚酯砜材料构成。应这样理解，术语“硝酸纤维素”是指纤维素的硝酸酯，其可以是单独的硝酸纤维素，或者硝酸和其它酸的混合酯，例如具有1至7个碳原子的脂肪族羧酸。
装置20还可以含有芯吸垫28。所述芯吸垫28通常接受迁移经过整个多孔膜23的液体。如本领域所公知的，芯吸垫28可以帮助促进毛细管作用和液体流经膜23。
为了开始检测测试样品中的分析物，用户可以直接将测试样品施加至多孔膜23的一部分，样品可以经过膜迁移。或者，首先将测试样品施加于加样垫(未示出)，所述加样垫与多孔膜23流体连接。可以形成加样垫的一些适当材料包括但不限于，硝酸纤维素、纤维素、多孔聚乙烯垫、和玻璃纤维滤纸。如果需要，所述加样垫可以含有一个或多个检测预处理试剂，所述试剂可以扩散性地或非扩散性地附着在加样垫上。
在所描述的实施方式中，测试样品从加样垫(未示出)迁移至结合垫22，所述结合垫与加样垫的一端流体连接。结合垫22由测试样品能够通过的材料构成。例如，在一个实施方式中，结合垫22由玻璃纤维构成。尽管只显示了一个结合垫22，但是应这样理解，在本发明中也可以采用其它的结合垫。
为了有利于检测测试样品中分析物的存在与否，在装置20的不同位置施加标记物。所述标记物可以用于检测分析物和校正。一般来说，装置20中使用的至少一部分标记物含有荧光化合物。通常，所述荧光化合物可以是荧光分子、聚合物、树状物、颗粒等。
根据本发明，所述荧光标记物的结构允许进行“时间分辨荧光检测”。时间分辨荧光涉及用短脉冲光激发荧光标记物，然后在激发后以及在测量剩余的长寿命荧光信号之前通常等待一特定时间(例如大约100-200微秒之间)。这样，消除了任意的寿命较短的荧光背景信号和散射激发辐射。消除大多数背景信号的能力可以使灵敏度比常规荧光高2至4个量级。因此，通过利用特定荧光材料的荧光特性，时间分辨荧光检测设计用于减少来自发射源或散射过程(由激发辐射散射导致的)的背景信号。
用于时间分辨荧光的尤其理想的标记物的选择原则包括相对较长的发射寿命。如上所述，在任一寿命较短的背景信号损耗之后，标记物较好地发出其信号，这是人们所希望的。而且，长荧光寿命能够采用低成本的电路进行按时选通的荧光测量。例如，本发明中使用的荧光标记物的荧光寿命可以大于约1微秒，在某些实施方式中大于约10微秒，在某些实施方式中大于约50微秒，以及在某些实施方式中在大约100微秒至大约1000微秒之间。此外，荧光标记物还可以具有相对较大的“斯托克司频移”。术语“斯托克司频移”通常是指发光辐射的谱线或波段位移至比激发线或波段更长的发射波长。相对较大的斯托克司频移使得荧光标记物的激发波长与其发射波长分离开，这是较为理想的，因为激发和发射波长之间存在较大的差别能够更加容易地消除来自发射信号的反射激发辐射。进一步地，大的斯托克司频移还使由于样品中的荧光分子和/或由于蛋白或胶体的光散射引起的干扰降至最低，所述蛋白或胶体在某些体液中存在(例如，血液)。此外，大的斯托克司频移还减少了昂贵而具有高精确性的滤波器的需求，所述滤波器用于消除背景干扰。例如，在某些实施方式中，荧光标记物的斯托克司频移大于大约50纳米，在某些实施方式中大于大约100纳米，在某些实施方式中在大约250至大约350纳米。
同时具有相对较长的发射寿命和相对较大的斯托克司频移的荧光化合物的一种类型为钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III)))和铽(Tb(III))的镧系螯合物。用非常短的波长激发所述螯合物后，所述螯合物明显显示出红移、窄波段、长时间的发射。典型地，由于生色团靠近分子中的镧系元素，所述螯合物具有强的紫外激发波段。在用生色团激发之后，激发能可以从被激发的生色团转移至镧系元素。随后是镧系元素的荧光发射特征。例如，与只有约28纳米的荧光素相比，铕螯合物具有非常大的斯托克司频移，大约为250-350纳米。而且，与其它荧光标记物的大约1-100毫微秒的寿命相比，铕螯合物的荧光时间较长，其寿命为大约100-1000微秒。此外，这些螯合物具有非常窄的发射光谱，通常在大约50％发射处，其带宽小于约10纳米。一个适当的铕螯合物为N-(对异硫氰基苯)-二乙烯三胺四乙酸-Eu+3)。
另外，惰性、稳定而且在水溶液或悬浮液中固有发出荧光的镧系螯合物还可以使本发明不再需要形成微粒的试剂，所述试剂通常用于保护具有有限溶解力并且在水溶液或悬浮液中存在淬灭问题的螯合物。所述螯合物的一个例子是4-[2-(4-异氰硫基苯)乙炔基]-2，6-双([N，N-双羧甲基氨基]甲基)-吡啶[参考Lovgren T.等；Clin.Chem.42，1196-1201(1996)].某些镧系螯合物还显示特别高的信噪比。例如，一种所述螯合物为四配位基的β-二酮-铕螯合物[参考Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596-601(1998)]。除了上述荧光标记物外，Mullinax等的美国专利No.6030840；Davidson的美国专利No.5585279；Singer等的美国专利5573909；Wieder等的美国专利No.6242268；Hemmila等的美国专利No.5637509中还描述了其它适合用于本发明的标记物，出于所有目的，上述申请的全文在本文中结合并引用。
可以各种方式使用荧光标记物从而形成探针。例如，可以单独使用所述标记物构成探针。另外，所述标记物可以与聚合物、脂质体、树状物和其它微米级或纳米级结构结合使用从而构成探针。另外，标记物可以与微粒(通常称为“小珠”或“微珠”)结合使用构成探针。例如可以使用天然形成的微粒，例如核、支原体、质粒、质体、哺乳动物细胞(例如，红细胞影)、单细胞微生物(例如细菌)、聚糖(例如琼脂糖)、硅石、玻璃、基于纤维素的颗粒等。而且，还可以利用合成微粒。例如，在一个实施方式中，采用了标记有荧光或彩色染料的乳胶微粒。尽管在本发明中可以使用任一种乳胶微粒，但是乳胶微粒通常由以下形成，包括聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯三聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙基丙烯酸甲酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶、聚二乙烯基苯、聚丁烯对苯二甲酸酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或它们的醛基、羧基、氨基、羟基、酰肼衍生物。其它适当的微粒见Jou等的美国专利申请No.5670381和Tarcha等的美国专利No.5252459，出于所有目的，上述申请的全文在本文中结合并引用。
在某些实施方式中，微�？梢允谴判缘摹Ｍǔ＃绻牧鲜苁┘拥拇懦〉挠跋欤缛绻牧媳晃蚺懦饣蚓哂锌杉觳獾拇乓赘行曰蛴盏迹蛉衔貌牧暇哂小按判浴�。例如，某些适当的具有磁响应的可用于赋予探针磁性能的材料例子包括但不限于，顺磁性材料、超顺磁性材料、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料。特定的例子为金属，例如铁、镍、钴、铬、锰等；镧系元素，例如钕、铒等；合金，例如铝、镍、钴、铜等的磁性合金；氧化物，例如氧化铁(Fe3O4)、氧化亚铁(Fe2O3)、氧化铬(CrO2)、氧化钴(CoO)、氧化镍(NiO2)、氧化锰(Mn2O3)等；复合材料，例如铁氧体等；以及固溶体，例如氧化铁的磁铁矿等。
当采用颗粒时，例如如上所述，颗粒的平均直径通常根据各种因素而改变，例如所选择的颗粒类型、膜的孔径和膜组成。例如，在某些实施方式中，颗粒状标记物的平均直径可以为大约0.01微米至大约1000微米，在某些实施方式中为大约0.01微米至大约100微米，以及在某些实施方式中为大约0.01微米至大约10微米。在一特定实施方式中，颗粒的平均直径为大约0.1至大约2微米。通常，颗粒基本上为球形，但是其它形状也适用于本发明，包括但不局限于，盘状、杆状、条状、不规则形状等等。正如本领域技术人员所理解的，颗粒的组成、形状、大小和/或密度可以发生广泛地变化。
在某些情况下，较为理想的是，以某种方式对探针进行修饰，从而这些探针更加易于结合分析物。在这种情况下，探针可以用特定结合组分进行修饰，所述结合组份附着在探针上形成结合探针。特定结合组分通常是指一特定结合对中的一个组分，所述结合对即两个不同分子，其中一个分子与第二个分子化学和/或物理结合。例如，免疫反应性特定结合组分可以包括抗原、半抗原、寡核苷酸配基、抗体以及它们的复合物，包括由重组DNA方法或肽合成形成的复合物。抗体可以是单克隆或多克隆抗体、重组蛋白或它们的混合物或片段，以及抗体和其它特定结合组分的混合物。上述抗体的制备和用作特定结合组分的适用性的细节是本领域技术人员公知的。其它常见的特定结合对包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白、生物素和抗生物素蛋白链霉素、抗体结合蛋白(例如蛋白A或G)以及抗体、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列(包括在DNA杂交检测中使用的标记和捕获核酸序列，用于检测靶核酸序列)、互补肽序列(包括用重组方法形成的肽序列)、效应物和受体分子、激素和激素结合蛋白、酶协同因子和酶、酶抑制剂和酶，等等。而且，特定结合对包括的组分可以是原始特定结合组分的类似物。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即分析物类似物，只要其与分析物具有至少一个相同的表位。
通�？梢圆捎枚嘀忠阎椒ㄖ械娜我庖恢纸囟ń岷献榉指阶庞谔秸肷�。例如，可以采用羧基、氨基、醛基、溴乙酰基、碘乙酰基、硫醇基、环氧基以及其它反应或连接功能团将特定结合组分共价连接至探针上，以及通过剩余游离基和游离基阳离子发生蛋白耦合反应从而将特定结合组分共价连接至探针上。表面功能基团还可以结合作为功能化的共聚用单体，这是由于微粒的表面可以具有相对高的极化基团表面浓度。另外，虽然微粒标记物通常在合成后进行功能化，在特定情况下，例如聚苯硫酚，微粒能够直接与蛋白共价连接，不需要进一步的修饰。例如，在一个实施方式中，结合的第一步是采用碳化二亚胺活化颗粒表面的羧基。第二步，活化的羧酸基团与抗体的氨基反应从而形成酰胺结合。可以在缓冲液中进行活化和/或抗体耦合，例如磷酸盐缓冲液(PBS)(例如，pH为7.2)或2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES，例如pH5.3)。如所示的，然后用例如乙醇胺封闭所得到的颗粒，从而形成标记共轭物。除了共价结合之外，本发明中还可以采用其它连接方法，例如物理吸附。
通常，根据本发明可以构建多种流式检测装置与时间分辨荧光检测系统结合使用。在这方面，将对本发明的不同实施方式进行详细描述。然而，应当这样理解，下文讨论的实施方式仅仅是举例，本发明还可以构思出其他的实施方式。例如，再次参照附图1，其示意性地描述了检测测试样品中分析物存在的一个系统。开始，将含有分析物的测试样品施加至加样垫(未示出)。然后，测试样品从加样垫迁移至结合垫22，在此，分析物与探针混合形成分析物复合物。在一个实施方式中，由微粒构成探针，所述微粒用镧系螯合物标记物进行染色，如上所述，并且探针结合至待测分析物的特定结合组分。而且，由于结合垫22与多孔膜23流体连接，所述复合物可以从结合垫22迁移至多孔膜23上的检测区31。
检测区31可以含有固定的捕获试剂，所述捕获试剂通常能够与探针形成化学或物理结合。例如，在某些实施方式中，结合剂中可以含有生物捕获试剂。利用，在某些实施方式中，所述捕获试剂可以是生物捕获试剂。所述生物捕获试剂是本领域公知的，可以包括但不限于，抗原、半抗原、抗体、蛋白A或G、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白链霉素、第二抗体以及它们的复合物。在许多情况下，较为理想的是，这些生物捕获试剂能够结合微粒上存在的特定结合组分(例如抗体)。此外，同样较为理想的是，利用各种非生物材料作为结合剂。例如，在某些实施方式中，结合剂可以包括能够结合未捕获探针的聚合电解质。所述聚合电解质可以带有净的正或负电荷，以及通常为中性的净电荷。例如，某些具有净正电荷的聚合电解质的适当例子包括但不限于聚赖氨酸(可以从Sigma-Aldrich Chemical公司，Inc.of St.Louis，MO购买得到)、聚氮丙啶；表氯醇功能化的聚胺和/或聚酰胺型胺类，例如聚(二甲胺-共-表氯醇)；聚二烯丙基二甲基-氯化铵；阳离子纤维素衍生物，例如纤维素共聚物或用四铵水溶性单体嫁接的纤维素衍生物；等等。在一特定实施方式中，可以使用CelQuatSC-230M或H-100(可从National Starch & Chemical公司购得)，为含有四铵水溶性单体的纤维素衍生物。而且，具有净负电荷的聚合电解质的某些适当例子包括但不限于聚丙烯酸，例如聚(乙烯-共-甲基丙烯酸，钠盐)等。应这样理解，本发明中还可以采用其它聚合电解质，例如两性聚合电解质(即具有极性和非极性部分)。例如，某些适当的两性聚合电解质的例子包括但不限于，聚(苯乙烯-b-N-甲基2-乙烯吡啶碘化物)和聚(苯乙烯-b-丙烯酸)，两者均可以从加拿大的Polymer Source，Inc.of Dorval购得。
这些捕获试剂作为探针结合物/分析物复合物的固定结合位点。在某些情况下，分析物，例如抗体、抗原等，具有两个结合位点。当到达检测区31时，这些结合位点中的一个被所述复合探针的特定结合组分占据。但是，分析物的游离结合位点可以结合固定的捕获试剂。当结合至固定的捕获试剂时，所述复合探针形成新的三元三明治式复合物。
检测区31通常提供任意数量的不同检测区域，从而用户可以更好地确定测试样品中特定分析物的浓度。每个区域可以含有相同的捕获试剂，或可以含有不同的捕获试剂用于捕获多个分析物。例如，检测区31可以包括两个或多个不同检测区域(例如，线、点等)。所述检测区域可以线的形式排列，其方向基本垂直于测试样品沿着检测装置20的流动方向。同样，在某些实施方式中，检测区域可以线的方式排列，其方向基本平行于测试样品沿着检测装置的流动方向。
尽管检测区域31可以指示分析物的存在，采用单一的检测区域31很难确定测试样品中分析物的相对浓度。因此，检测装置20还可以包括校正区32。在该实施方式中，在多孔膜23上形成检测区32，并位于检测区31的下游。校正区32具有捕获试剂，所述试剂能够结合任意剩余的未捕获探针，其通过整个膜23的长度。尤其是，当与测试样品接触时，未结合分析物的任意未捕获探针迁移通过检测区31，进入多孔膜23的校正区32。在校正区32处，然后这些未捕获探针结合捕获试剂。校正区32中使用的捕获试剂可以与检测区31的捕获试剂相同或不同。而且，类似于检测区31，校正区32还可以提供任意数量的不同校正区域，其可以是任意方向，从而用户可以更好地确定测试样品中特定分析物的浓度。每个区域可以含有相同的捕获试剂，或者可以含有不同的捕获试剂用于捕获不同的荧光标记物。
含有不同量结合剂的校正区域可以预先放置于多孔膜23上，从而当未捕获探针迁移时，每个校正区域产生不同的信号强度。通过采用不同大小的校正区域和/或通过改变每个校正区域内的结合剂的浓度或体积，每个校正区域内的结合剂总量可以不同。如果需要，在检测装置20中可以采用过量的探针分子，从而每个校正区域达到其全部和预定的信号强度。也就是说，沉积在校正区域上的未捕获探针的量是预定的，这是因为，校正区域上结合剂的量设定在预定而且已知的水平。
一旦被捕获，采用时间分辨荧光读数器50可以测量检测和校正区31和32的探针荧光信号。例如，在该实施方式中，荧光读数器50的构建使其能够同时发射脉冲光至检测和校正区31和32。读数器50还可以同时接收检测和校正区31和32的被激发标记物发出的荧光信号。另外，荧光读数器50的构建使其可以连续发出脉冲光至检测区31和校正区32。此外，还可以采用单个荧光读数器(未示出)测量校正区32的荧光信号。
通�？梢愿荻喔鲆蛩馗谋溆舛潦�50的结构，例如成本、所需要的准确性水平、感兴趣的分析物的性质和浓度等。典型地，荧光读数器50利用一个或多个的脉冲激励源和光电检测器，它们相互连接以及与其它可选择组件连接，例如滤波器。采用脉冲激励和按时选通检测，选择性地与滤波器结合，可以对仅仅来自荧光标记物的荧光进行特定检测，而排除样品中存在的其它物质的发射，这些物质的发射通常寿命较短。
例如，参照附图2，其显示了示例性的荧光读数器50的一个实施方式，其包括激励源52和检测器54。本发明中可以使用不同的激励源52，包括例如，发光二极管(LED)，闪光灯以及其它适当的光源。激发照明还可以是多路复用的和/或经准直的；例如，来自多个相干辐射源(例如激光)的各种不同频率的光束可以采用分色镜阵列进行准直和多路复用。而且，照明可以是连续的或者脉冲式的，或者可以结合连续波(CW)和脉冲照明，其中多个照明光束为多路复用的(例如，脉冲光束可以用CW光束进行多路复用)，从而可以对CW源诱发的荧光和脉冲源诱发的荧光进行信号区分。例如，砷化镓LED二极管(例如，铝砷化镓红色二极管、磷化镓绿色二极管、砷磷化镓绿色二极管、或氮化铟镓紫色/蓝色/紫外(UV)二极管)可以用作照明源。适合用于本发明的适当UV LED激发二极管的一个商业上可购得的例子为Model NSHU55OE(Nichia公司)，其发出光强度为750-1000微瓦、正向电流为10毫安培(3.5-3.9伏特)的全波宽光束，其半最大值为10度，峰波长为370-375纳米，光谱半波宽为12纳米。
进一步地，可以在本发明中使用的适当检测器54的例子包括但不局限于，光电倍增管装置；光电二极管，例如雪崩光电二极管、硅光电二极管等；高速、线性电荷耦合装置(CCD)、CID装置、或基于CMOS的成像仪；等等。在一个实施方式中，所述荧光系统利用硅光电二极管进行荧光检测。硅光电二极管较为有利，这是因为它们较为便宜、敏感，能够进行高速操作(短上升时间、高带宽)，易于与大多数的其它半导体技术和单片电路结合。此外，硅光电二极管在物理上较�。淠芄挥胗糜诨谀さ淖爸玫南低辰岷�。如果使用硅光电二极管，荧光发射的波长范围应在其灵敏度范围内，其为400至1100纳米。另一检测器的选择为CdS(硫化镉)光导电池，其优点是，其光谱灵敏度类似于人类的视力(适光曲线)，从而更加易于排除反射的激励辐射。
可选择地，滤波器(未示出)可以邻近激励源52和检测器54放置。所述滤波器在激励波长范围内具有高的透过率而在一个或多个不合需要的波段具有低透过率，从而将激励源发出的不合需要的波长过滤掉。不合需要的波长范围通常包括那些产生可检测的样品自荧光的波长，和/或激励最大波长位于大约25至大约100纳米范围内的波长，因此，上述波长是散射激励照明发出的背景噪声的潜在来源。本发明可以使用的滤波器的几个例子包括但不限于，染色塑料树脂或明胶滤光片、分色镜、薄的多层膜干扰滤波器、塑料或玻璃滤片、环氧或硬透明树脂滤光片。在一个实施方式中，检测器和/或激励源可以包埋于或密封于滤波器中。尽管可以采用滤波器，但是本发明的一个益处在于，由于采用时间分辨，因此通常不需要所述滤波器。尤其是，由于荧光发射的延迟，不需要采用发射带宽滤波器将激励源发出的任一短寿命的荧光过滤掉。
再次参考附图2，还可以采用不同的定时电路控制激励源52的脉冲激励，以及控制对所发出的荧光的测量。例如，在所描述的实施方式中，采用时钟脉冲源56(例如，晶体振荡器)为荧光读数器50的其它电子组件提供经控制的频率源。在该特定实施方式中，例如，振荡器56可以产生20MHz信号，将其提供至LED驱动器/脉冲发生器55和A/D转换器64。来自振荡器56并提供至A/D转换器64的时钟信号控制A/D转换器64的工作速度。应当这样理解，如果A/D转换器64的工作频率或如果时钟输入至LED驱动器/脉冲发生器55的所需频率不同于20MHz，可以在上述各自的信号通道中利用分频器。因此，应当这样理解，来自振荡器56的信号可以适当地被修饰，从而提供所需频率的信号。在某些实施方式中，来自振荡器56的信号还可以提供至微处理器60，从而控制其运行速度。根据本发明，在其它信号通道中还可以采用额外的分频器。
微处理器60提供控制输入至脉冲发生器55，这样，可编程地对来自振荡器56的20MHz信号进行调整，从而提供需要的脉冲持续时间和重复频率(例如，具有50％工作周期的1kHz源)。然后，可以将来自脉冲发生器55的信号提供至激励源52，控制其脉冲重复频率和照明的工作周期。在某些实施方式中，可以在至激励源52的信号通道上提供晶体管，以提供转换装置，从而在激励源52处实现脉冲光信号。
如上所述，脉冲光激发附属的检测装置的荧光标记物。在所需要的响应时间之后(例如大约100至大约200微秒)，检测器54检测激发的荧光标记物发出的荧光信号，并产生代表所述信号的电流。然后，将所述电流通过高速跨阻抗前置放大器78转化为电压水平，其可以通过相对低的设定时间和从饱和状态快速回复进行表征。然后，将前置放大器78的输出提供至A/D转换器64的数据输入。在前置放大器78之后以及A/D转换器64之前，可以在信号通道上提供额外的放大器元件(例如可编程的增益放大器)，从而在激励脉冲的后沿产生适当电压范围内的信号，并提供至A/D转换器64。A/D转换器64可以是高速转换器，其抽样率足够在附属荧光标记物的荧光寿命范围内获取多个点。可以设置前置放大器78的增益，从而数据值降至激励脉冲后沿的最大A/D计数(例如对于12位转换器为2047)。然后，A/D转换器的动态范围内的数据主要代表所需要的荧光信号。如果与激励脉冲的上升时间和下降时间相比，抽样间隔较短，则可以设置前置放大器78的增益，从而确保A/D转换器78的上1/2或3/4的动态范围内的信号值对应于发射脉冲的后沿。
A/D转换器64从前置放大器78抽取信号，将其提供至微处理器60，其中构建软件指令对数字信号进行不同的处理。来自微处理器60的输出提供至A/D转换器64，从而当被检测的荧光信号被抽样时进行进一步的控制。可以连续对提供至前置放大器78(未示出)和A/D转换器64的控制信号进行修改，从而得到最适当的增益、抽样间隔和触发偏移。应当这样理解，尽管A/D转换器64和微处理器60被描绘成不同的组件，在本发明中还可以采用商业上可以购买得到的在单个模块上包括上述两个组件的芯片。处理后，微处理器60可以提供至少一个被指示检测器54检测的荧光水平的输出。将一个所述范例性的输出提供至显示器86，从而向用户提供关于标记物所生成的荧光信号的视觉指示。显示器86可以提供额外的交互式特征，例如用户可以提供程序可控输入至微处理器60的控制界面。
附图3中还描述了用于荧光读数器50的代表性特定电子组件的另一实施方式。附图3中的许多组件类似于附图2的组件，从而在上述情况下采用相同的附图标记。例如，附图3的读数器50与附图2相比，其中一个区别是在相位延迟�？�57中生成选通信号。将来自微处理器60的控制信号提供至相位延迟�？�57，从而对所提供的时钟信号的有效相移进行编程。然后，将偏移的时钟信号(也称为选通信号)提供至混频器58，在此，所述信号经检测器54接收的周期性检测器信号进行倍增，并通过前置放大器78。然后，在提供至A/D转换器64之前，将所得到的混频器58的输出经过低通滤波器62。A/D转换器64可以测量低通滤波器62的输出，从而得到选通信号所限定的间隔期间的荧光量度。
附图4描述了示例性荧光读数器实施方式50的其它特征。例如，显示了抽样/保持放大器88(有时也称为跟踪和保持放大器)，其在外部信号控制下及时捕获并保持特定点的电压输入信号。本技术所采用的抽样/保持放大器的一个特定例子是SHC5320芯片，例如Burr-Brown公司所出售的。附图4实施方式中的所述抽样/保持放大器外部控制信号来自延迟电路92，其可以是例如数字延迟电路，采用计数器、基础逻辑门和触发电路从时钟衍生出预定延迟。延迟电路92从振荡器56接收时钟信号，并从分频器90接收起动信号，其简单提供周期性信号，所述信号的频率低于振荡器56产生的信号的频率。延迟电路92还可以从微处理器60接收控制输入，从而启动延迟的可程序控制，以确保抽样/保持放大器88的正确抽样。当激励源52关闭之后，来自延迟电路92并提供至抽样/保持放大器88的所述延迟脉冲控制信号启动在预定时间间隔获取来自检测器54的荧光信号。
不论所采用的读数器50的结构，可以将在检测区31捕获的标记物发出的荧光信号Is与预定的分析物浓度相互关联起来，从而确定分析物的量。在某些实施方式中，强度信号Is还可以与校正区32捕获的标记物发出的荧光强度信号Ic进行比较。荧光强度信号Is可以与荧光强度信号Ic比较。在该实施方式中，校正区32的标记物总量是预先确定的而且已知的，其由此可以用作校正目的。例如，在某些实施方式中(例如三明治式检测)，分析物的量与Is和Ic的比率成正比。在其它实施方式中(例如竞争性检测)，分析物的量与Is和Ic的比率成反比。基于检测区31的强度范围，可以确定分析物的总的浓度范围。因此可以在近乎相同的条件下同时进行校正和样品检测，从而提供可靠的定量或半定量结果，而且灵敏度增加。
如果需要，就Is和Ic的比率对在已知分析物浓度范围内的分析物浓度进行作图，从而得到校正曲线。为了确定未知测试样品中的分析物量，根据校正曲线，将信号比率转化为分析物浓度。应注意的是，可以就Is和Ic的另外数学关系对分析物浓度作图，从而得到校正曲线。例如，在一个实施方式中，可以就Is/(Is+Ic)的值对分析物浓度进行作图，从而得到校正曲线。
如上所述，装置20可以采用三明治形式、竞争性形式等等。三明治式检测形式通常涉及将测试样品与分析物的抗体混合。这些抗体是移动的并与标记物连接，例如染色乳胶、胶体状金属溶胶或放射性同位素。然后，所述混合物与色谱分离介质接触，所述介质含有分析物的固定抗体的带或区域。所述色谱分离介质通常为类似于量杆的条状物。当分析物和标记抗体的复合物到达色谱分离介质上的固定抗体区域，发生结合，所结合的标记抗体定位在所述区域内。其指示了分析物的存在。该方法可以用于获得定量或半定量结果。所述三明治式检测方法的例子参见Grubb等的美国专利申请No.4168146和Tom等的美国专利申请No.4366241，出于所有目的，所述申请的全文在本文中结合并引用。
在竞争性检测中，标记物通常为标记的分析物或分析物类似物，其与样品中存在的任意未标记分析物竞争结合抗体。竞争性检测通常用于检测例如半抗原的分析物，每个半抗原为单价，仪能结合一个抗体分子。竞争性免疫检测装置的例子参见Deutsch等的美国专利No.4235601，Liotta的美国专利No.4442204和Buechler等的美国专利No.5208535，出于所有目的，所述申请的全文在本文中结合并引用。Lambotte等的美国专利申请No.5395754；Jou等的美国专利No.5670381；和Malich等的美国专利No.6194220中还公开了不同的其它装置结构和/或检测方式，出于所有目的，所述申请的全文在本文中结合并引用。
尽管上文已经描述了装置结构的不同实施方式，但是应当这样理解，本发明的装置通�？梢跃哂腥我馑璧慕峁梗恍枰鲜龅乃凶榧�。
参照以下实施例可以更好地理解本发明。
实施例1其显示了形成用于基于膜的装置中的结合荧光探针颗粒的能力。用100微升PBS缓冲液(0.1摩尔)清洗500微升的0.5％羧化铕螯合物封闭的颗粒(0.20微米，EU-P颗粒，来自Molecular Probes公司)。然后对40微升清洗过的颗粒施加3毫克碳化二亚胺(来自Polysciences公司)。所述混合物在室温(RT)下在振荡器上反应30分钟。然后，用硼酸盐缓冲液通过离心对活化的颗粒进行清洗。将活化的颗粒通过2分钟的浴化超声处理再次悬浮于200微升的硼酸盐缓冲液中。
之后，在活性颗粒中加入30微升C反应蛋白(CRP)(4.9毫克每毫升，Mab1 A58110228P，来自BiosPacific，Emeryville公司，CA)。所述反应混合物在室温下在振荡器上反应2.5小时。然后收集活化颗粒并在0.25毫升的0.25摩尔乙醇胺中孵化，轻微振荡30分钟。用PBS清洗颗粒两次。然后在冰浴中用PBS对颗粒进行探针超声处理10秒、三次，然后存储于4℃。
实施例2用常规的FluoroLog III分光荧光计(购自Horiba基团)在370纳米的激发波长和615纳米的发射波长确定实施例1中形成的结合探针颗粒的激发光谱和发射光谱。
结果示于附图5中。如图所示，探针颗粒的激发光谱和发射光谱类似于未结合探针颗粒的激发光谱和发射光谱，但是，结合探针颗粒的430纳米峰对615纳米峰的相对强度较高。结合探针颗粒在350纳米左右具有强的激发峰，在430和615纳米处具有两个强的发射峰。430纳米处的发射峰认为是来自配体，而615纳米处的峰认为来自铕金属离子的d-d转换，其是从配体至铕金属中心的能量转化。
实施例3显示了形成基于膜的检测的能力。开始，由硝酸纤维素构成的Millipore SX多孔膜样品层压至相应的支撑卡片上，长度大约为30厘米。C反应蛋白(CRP)单克隆抗体(Mab A58040136P，2.3mg/ml，来自BiosPacific，Emeryville公司，CA)在膜上形成条带，从而构成检测线。然后将Goldline(从British Biocell International得到的聚赖氨酸溶液)划在膜上从而形成校正线。在37℃干燥所述膜一个小时。
将纤维素纤维芯吸垫(Millipore公司)附着于膜的一端。在膜的另一端层压两个来自Millipore公司的玻璃纤维垫(样品和结合垫)。所述结合垫和芯吸垫与膜直接接触，样品垫与结合垫直接接触。结合垫和样品垫每个的宽度为4毫米。用1％聚氧化乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(来自SigmaAldrich的非离子表面活性剂，商品名为“Tween 20”)处理样品垫，并在37℃干燥2小时。用200微升实施例1中的结合探针颗粒处理所述结合垫，所述结合垫与PBS缓冲液、200微升的2％Tween 20和200微升的20％蔗糖混合。在干燥炉中在37℃下对浸湿的结合垫进行干燥1.5小时。
所得到的装置密封于袋中并储存。
实施例4确定实施例3的装置检测分析物存在的能力。尤其是，提供实施例3装置的8个全样品。将40微升不同浓度的CRP的PBS溶液(即，0，1，2，5，10，20，50和100毫微克每毫升)分别直接施加至每个样品的样品垫上。让所述装置反应30分钟，在370纳米和611.5纳米的激发波长处分别测量检测线和校正线的荧光。用常规FluoroLog III分光荧光计(购自Horiba Group)采用正面模式测量荧光。将激发光束相对于装置的曲面法线定位于大约70°，将发射光束相对于装置的曲面法线定位于大约45°。尽管视觉观察在大约15分钟内反应完全，但是在进行荧光测量之前应有足够的时间以完全反应。
表I给出校正线和检测线的荧光数据。
表I荧光数据
附图6显示了Is/(Is+Ic)的标化强度比率对CRP浓度的曲线。将样品的测量荧光强度除以对照样品的荧光强度得到标化强度。如图所示，剂量反应曲线经校正线校正成线性，特别是当CRP浓度低于20毫微克每毫升。
实施例5确定了实施例3装置检测分析物存在的能力。特别是，提供了五组，每组均含有实施例3装置的四个全样品。将40微升不同浓度的CRP的PBS溶液(即，0，1，2和5毫微克每毫升)直接施加至样品垫。让所述装置反应30分钟，在370纳米和611.5纳米的激发波长处分别测量检测线和校正线的荧光。用常规FluoroLog III分光荧光计采用正面模式测量荧光。将激发光束相对于装置的曲面法线定位于大约70°，将发射光束相对于装置的曲面法线定位于大约45°。尽管视觉观察在大约15分钟内反应完全，但是在进行荧光测量之前应有足够的时间以完全反应。
表II和III给出校正线和检测线的荧光数据。
表II荧光数据(Is/Ic)
表III平均荧光强度/标准差(Is/Is+Ic)
因此，本发明的结果是在检测期间可以实际上将多个来源的背景干扰消除掉，例如散射光和自荧光。此外，本发明中使用的荧光读数器可以具有简单且便宜的设计。例如，在一个实施方式中，所述读数器可以利用脉冲发光二极管(LED)和硅光电二极管，从而精确激发标记物，并在基于膜的检测装置上检测荧光，而不需要使用昂贵的组件，例如单色器或窄发射带宽的滤波器。
尽管已经就特定实施方式对本发明进行了详细描述，但是应注意的是，当理解上述内容时，本领域技术人员可以非常容易地构思出这些实施方式的变化、修改以及等同物。因此，本发明的范围应由以下所附的权利要及其等同物限定。
权利要求
1.一种检测测试样品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式检测装置，其包括与荧光标记物流体连接的多孔膜，所述荧光标记物的荧光发射寿命大于约1微秒，所述多孔膜限定了检测区；ii)所述荧光标记物与测试样品接触，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述检测区；iv)将时间分辨荧光读数器邻近所述检测区放置，所述荧光读数器包括脉冲激励源和按时选通的检测器；v)用所述脉冲激励源激发检测区的荧光标记物，其中所述激发使得荧光标记物发出检测信号；以及vi)用所述按时选通检测器测量检测信号的强度。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物的发射寿命大于约10微秒。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物的发射寿命在大约100至大约1000微秒之间。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移大于约50纳米。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移大于约100纳米。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移在大约250纳米至大约350纳米之间。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物包括钐、镝、铕和铽的镧系螯合物，或它们的组合。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物为铕螯合物。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物与微粒、纳米颗粒、脂质体、树状物、聚合物及它们的组合结合使用。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述荧光标记物与经分析物的特定结合组分修饰的微粒或纳米颗粒结合使用。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述检测区包括多个检测区域。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述检测区域含有多个用于结合多种分析物的捕获试剂。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜进一步限定了校正区，其中所述混合物还可以流至所述校正区。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述校正区包括多个检测区域。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述校正区域含有多个用于结合多种荧光标记物的捕获试剂。
16.如权利要求13所述的方法，其进一步包括将所述时间分辨荧光读数器邻近校正区放置；用所述脉冲激励源激发所述校正区的荧光标记物，其中所述激发使荧光标记物发出校正信号；用按时选通检测器测量校正信号的强度；以及比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。
17.如权利要求16所述的方法，其中检测区的荧光标记物与校正区的荧光标记物同时被激发。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述检测信号和校正信号同时被测量。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述脉冲激励源为发光二极管。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述按时选通检测器为硅光电二极管。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述荧光读数器含有与所述脉冲激励源和按时选通检测器相连接的定时电路，所述定时电路控制脉冲激励和检测。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述滤波器邻近所述脉冲激励源、按时选通检测器或它们的组合放置。
23.一种检测测试样品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式检测装置，其包括与含有荧光标记物的结合探针流体连接的多孔膜，所述荧光标记物的荧光发射寿命大于约10微秒，所述多孔膜限定了检测区和校正区；ii)所述结合探针与测试样品接触，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述检测区和校正区；iv)将时间分辨荧光读数器邻近所述检测区和校正区放置，所述荧光读数器包括脉冲激励源和按时选通检测器；v)用所述脉冲激励源激发检测区和校正区的荧光标记物，其中所述激发使得荧光标记物在检测区发出检测信号，使荧光标记物在校正区发出校正信号；以及vi)用所述按时选通检测器测量检测信号和校正信号的强度；vii)比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中的分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号强度成比例。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记物的发射寿命大约为100至1000微秒。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移大于约50纳米。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移在约250至350纳米之间。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光标记物包括钐、镝、铕和铽的镧系螯合物，或它们的组合。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述荧光标记物为铕螯合物。
29.如权利要求23所述的方法，其中检测区的荧光标记物与校正区的荧光标记物同时被激发。
30.如权利要求23所述的方法，其中同时测量所述检测信号和校正信号。
31.如权利要求23所述的方法，其中所述脉冲激励源为脉冲发光二极管。
32.如权利要求23所述的方法，其中所述按时选通检测器为硅光电二极管。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述荧光读数器含有与所述脉冲激励源和按时选通检测器相连接的定时电路，所述定时电路控制脉冲激励和检测。
34.一种检测测试样品中分析物的存在或量的方法，所述方法包括i)提供流式检测装置，其包括与含有镧系螯合物的结合探针流体连接的多孔膜，所述镧系螯合物的荧光发射寿命大于约50微秒，其斯托克司频移大于约100纳米，所述多孔膜限定了检测区和校正区；ii)所述结合探针与测试样品接触，形成混合物；iii)使所述混合物流至所述检测区和校正区；iv)将时间分辨荧光读数器邻近所述检测区和校正区放置，所述荧光读数器包括脉冲发光二极管和按时选通检测器，所述检测器包括硅二极管；v)用所述脉冲发光二极管激发检测区和校正区的镧系螯合物，其中所述激发使得检测区的镧系螯合物发出检测信号，使校正区的镧系螯合物发出校正信号；以及vi)用所述按时选通检测器测量检测信号和校正信号的强度；vii)比较检测信号和校正信号的强度，其中测试样品中的分析物的量与经校正信号强度校正的检测信号的强度成比例。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述镧系螯合物选自由以下构成的组，包括钐、镝、铕和铽的镧系螯合物，或它们的组合。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述镧系螯合物为铕螯合物。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述脉冲发光二极管为紫外发光二极管。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述荧光读数器含有与所述脉冲激励源和按时选通检测器相连接的定时电路，所述定时电路控制脉冲激励和检测。
39.如权利要求34所述的方法，其中检测区的荧光标记物与校正区的荧光标记物同时被激发。
40.如权利要求34所述的方法，其中同时测量所述检测信号和校正信号。
41.如权利要求34所述的方法，其中所述荧光标记物的发射寿命为大约100至1000微秒。
42.如权利要求34所述的方法，其中所述荧光标记物的斯托克司频移在约250至350纳米之间。
全文摘要
提供了一种基于膜的检测装置，用于检测测试样品中分析物的存在和量。所述装置采用时间分辨荧光检测被激发的荧光标记物所产生的信号。由于所述标记物具有相对较长的发射寿命，通过延迟的荧光检测实际上可以消除寿命较短的背景干扰。此外，所得到的荧光读数器可以具有简单而且便宜的设计。例如，在一个实施方式，读数器利用硅光电二极管和脉冲发光二极管(LED)，精确激发标记物和检测基于膜的检测装置上的荧光，而不需要使用昂贵的组件，例如单色器或窄发射带宽滤波器。
文档编号G01N33/58GK1675545SQ03819391
公开日2005年9月28日 申请日期2003年7月10日 优先权日2002年8月27日
发明者宋旭东, R·凯洛, M·克诺茨, 卫宁 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
