液相色谱法测定独一味中8-o-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：：液相色谱法测定独一味中8-o-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法
技术领域：
：本发明属于中药领域，涉及一种药品的检测方法，尤其涉及一种液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法。
背景技术：
：独一味为传统藏药，相关制剂被临床广泛应用于各种外科手术后的镇痛止血及口腔科、妇科、关节炎等方面的治疗。《中国药典》要求测定独一味及其制剂中总黄酮及木犀草素含量，并设定了质量标准。但是大量药理实验表明以8-0-乙酰基山栀子苷甲酯为代表的环烯醚萜苷类成分具有很好的止血、镇痛作用，是独一味的活性物质基础。建立独一味制剂中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的含量测定方法，能更好地保障独一味药材及其相关提取物、制剂的质量。
发明内容本发明的目的是为了提供一种液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法。本发明液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，在检测波长230-240nm，流速0.52.0mL/min,进样量5~50pl的色谱条件下，将制备的样品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量。所述流动相中乙腈:水的体积比为3:10040:100(最佳为15:85)。所述对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品，用水制成浓度介于0.1-100.0ng'mr1的梯度溶液。本发明的测定方法适用于独一味药材及由独一味药材制得的提取物及制剂。所述独一味制剂样品溶液的制备将独一味制剂溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，使8-O-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于0.1100.0^mr1，即得样品溶液。其中独一味制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、分散剂、3口服液体制剂、针剂、膜剂、气雾剂、散剂及外用制剂。所述独一味药材样品溶液的制备将独一味药材采用水提、醇提或超声提�。锰崛∫合∈椭�8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于0.1~100.0pg.mr1，即得样品溶液。所述独一味提取物样品溶液的制备将独一味提取物溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，稀释至8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于0.1-100.0pg-mr1，即得样品溶液。独一味提取物包括各种分离手段从独一味药材中得到的提取物，如独一味水提取物、独一味总皂苷、独一味总环烯醚萜苷等。下面通过具体实验对本发明方法进行进一步说明。(1)仪器与试药高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括600型二元梯度泵、996型二极管阵列紫外检测器，BP210S电子分析天平(Sartorius公司)，SK7200H超声波清洗器(上�？频汲瞧饔邢薰�)。8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品(实验室自制，MS,NMR确定其结构)，纯化水，乙腈为色谱纯(CaledonLaboratoriesLTD.Canada)。市场销售独一味制剂5种，见表1。表1市售5种独一味制剂<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>(2)色谱条件选择SymmetryCw色谱柱(4.6mmXI50mm,5pm，Waters);洗脱流动相为乙腈-水(15:85);流速1.0ml'min";柱温20。C;进样量2(Hd。(3)检测波长的选择取8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品溶液，在200-400nm范围内扫描，结果在234nm处有最大吸收，故选择234nm作为检测波长。(4)线形关系的考察及标准曲线的绘制分别精密吸取100pg-mr1的对照样品母液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，用水注射加至刻度，得浓度分别为20.0，16.0，12.0，8.0，4.0pg'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，用水注射稀释定容得2.0，1.2pg，ml—1梯度溶液，综合起来得到1.220.0pg，mr1的7个梯度对照品溶液。分别进样20W，测定色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程式及线性相关系数，结果见表2。表2线形关系考察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表2的线形关系考察得到线性方程为Y=23459X+271.21;线性相关系数r=0.9999。表明8-0-乙酰基山栀苷甲酯在1.2~20.0pg.ml"浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。(5)精密度试验精密取8.0pgTnl"对照品溶液20^1，分别于第一天，第二天，第三天各重复进样5次，并测定8-0-乙酰基山栀苷甲酯峰积分面积及保留时间，实验结果见表3。从表3的实验结果可以看出，日内、日间精密度，积分面积日内RSD分别为0.08，0.13，和0.52%，日间精密度RSD为0.390/。，保留时间日内RSD分别为0.18，1.44，和0.31%,日间精密度RSD为2.14。/。。表3精密度试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(6)稳定性试验精密吸取同一样品溶液分别在0，2，4，8，12,24，48h测定峰面积积分值(见表4)，计RSD为0.102%，表明样品溶液在48小时内基本稳定。表4稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(7)重现性试验照含量测定项下操作，对同一种独一味样品6份进行测定，求得标准偏差RSD为0.53y。，结果见表5。表5重现性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(8)加样回收率试验取己知样品含量的样品适量9份，1-3份加入对照品0.59mg，4-6份加入对照品0.984mg，7-9份加入对照品1.476mg，混匀，按上述方法制备样品溶液，按上述方法测定色谱峰面积，计算其中8-0-乙酰基山栀苷甲酯的含量及相应的加样回收率，结果见表6。表6加样回收率试验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(9)最低检测限的测定精密吸取8pg'mr1的对照品溶液适量，以注射用水稀释成8，0.8ng'mr1的对照品溶液，分别进样20pl，测定色谱图，以色谱峰积分面积大于3倍该处噪音算，8-0-乙酰基山栀苷甲酯的检测限可达到0.8ng'mr1，可以满足独一味制剂中的含量测定。(10)样品中的含量测定精密吸取样品溶液20.0)al，以上述色谱条件，注入高效液相色谱仪中，测定与8-0-乙酰基山栀苷甲酯标准品相同位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算制剂中8-0-乙酰基山栀苷甲酯的含量，同时根据制剂相应包装，计算每粒(袋)中8-0-乙酰基山栀苷甲酯含量，结果见表7。表7样品含量测定(n=2)样品编号制剂名称含量(mg/g)每粒、袋重量(g)每粒、袋含量(mg/g)1独一味片剂10.730.283.002独一味胶囊剂10.360.33.113独一味软胶囊7.030.644.54独一味软胶囊0.430.550.245独一味颗粒剂0.8673.02.6结果表明独一味不同制剂中均可检测出8-0-乙酰基山栀苷甲酯，但含量相差很大。具体实施例方式实施例一独一味胶囊中8-0-乙酰基山栀苷甲酯含量的测定独一味胶囊由甘肃独一味生物制药股份有限公司提供，批号0710025331。色谱条件与波长选择用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂；乙腈-水(体积比为15:85)为流动相；检测波长234nm。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品适量，加注射用水制成每lml含0.1mg的对照品母液。样品溶液的制备精密称取独一味胶囊内容物1.0g于具塞三角锥瓶中，加入50ml50%的甲醇溶液，称定重量，于7(TC水浴加热30min，时时振�。淙春笤俪贫ǎ�50%甲醇补齐失去的重量。过滤，续滤液适当稀释，即得样品溶液。标准曲线的制备精密吸取对照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，用注射用水加至刻度，得浓度分别为20.0，16.0，12.0，8.0，4.0^mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pgTiir1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀释定容得2.0，1.2)ag'mr1梯度溶液，综合起来得到1.220.0叫-mr1间的7个梯度对照品溶液。分别进样20W，测定色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定方法精密吸取样品溶液20^，注入高效液相色谱仪，测定与标准品相应位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算得每0.3g独一味胶囊(相当于生药lg)中含8-0-乙酰基山栀子苷甲酯为3.11mg，即8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量为1.033%。实施例二独一味片剂中8-0-乙酰基山栀苷甲酯的测定独一味片剂由广州白云山制药总厂提供，批号1070013。色谱条件与波长选择用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(体积比15:85)为流动相；检测波长234nm。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品适量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的对照品母液。样品溶液的制备独一味片剂20粒，去处包衣，研匀，精密称取1.0g于具塞三角锥瓶中，加入50ml50。/。甲醇溶液，称定重量，于70。C水浴加热30min，时时振�。淙春笤俪贫ǎ�50%甲醇补齐失去的重量。过滤，续滤液适当稀释，即得样品溶液。标准曲线的制备精密吸取对照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得浓度分别为20.0，16.0，12.0，8.0，4.0pgTiir1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀释定容得2.0，1.2吗'ml—1梯度溶液，综合起来得到1.2—20.0pg-ml—1间的7个梯度对照品溶液。分别进样20pl，测定色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定方法精密吸取样品溶液20)Lll，注入高效液相色谱仪，测定与标准品相应位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算得每0.28§独一味片剂(相当于生药lg)中含8-O-乙酰基山栀子苷甲酯为3.0mg，即8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量为1.073%。实施例三独一味药材中8-0-乙酰基山栀苷甲酯的测定独一味药材于2007.8月采自甘肃省玛曲县，主要为其地上部分。色谱条件与波长选择用十八烷基硅垸键合硅胶为填充剂；乙腈-水(体积比15:85)为流动相；检测波长234nm。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品适量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的对照品母液。样品溶液的制备独一味药材，研碎，过20目筛，精密称取1.0g于250ml圆底烧瓶中，加入50ml甲醇溶液，称定重量，于75-C回流加热30min，冷却后再称定，加甲醇补齐失去的重量。过滤，续滤液适当稀释，即得样品溶液。标准曲线的制备精密吸取对照品溶液5.0，4.0，3.0,2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得浓度分别为20.0，16.0,12.0，8.0，4.0吗'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀释定容得2.0，1.2pg'mr1梯度溶液，综合起来得到1.2-20.0)Lig-mr1间的7个梯度对照品溶液。分别进样20pl，测定色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定方法精密吸取样品溶液20^d，注入高效液相色谱仪，测定与标准品相应位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算得每lg独一味药材中含8-0-乙酰基山栀子苷甲酯为8.0mg,即8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量为0.80%。实施例四独一味环烯醚萜苷提取物中8-0-乙酰基山栀苷甲酯的测定独一味环烯醚萜苷提取物由兰州军区兰州总院提供。色谱条件与波长选择用十八垸基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(体积比15:85)为流动相；检测波长234nm。对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品适量，加注射用水制成每1ml含0.1mg的对照品母液。样品溶液的制备精密称取独一味环烯醚萜苷提取物0.1g于100ml容量瓶中，加入注射用用水，定容，适当稀释，即得样品溶液。标准曲线的制备精密吸取对照品溶液5.0，4.0，3.0，2.0，1.0ml于25ml容量瓶中，注射用水加至刻度，得浓度分别为20.0，16.0，12.0，8.0，4.0lig'mr1梯度溶液，再精密吸取溶液20.0pg'mr1的溶液2.5，1.5ml于25ml容量瓶中，注射用水稀释定容得2.0，1.2pg'mr1梯度溶液，综合起来得到1.2-20.0pg-mr1间的7个梯度对照品溶液。分别进样20pl，测定色谱峰面积，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。测定方法精密吸取样品溶液20pl，注入高效液相色谱仪，测定与标准品相应位置的色谱峰面积，根据标准曲线计算得每lg独一味环烯醚萜苷提取物中含8-0-乙酰基山栀子苷甲酯为189.6mg，即8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量为18.96%。权利要求1、液相色谱法测定独一味中8-O-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，在检测波长230～240nm，流速0.5～2.0mL/min，进样量5～50μl的色谱条件下，将制备的样品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量。2、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述独一味为独一味药材及由独一味药材制得的提取物及制剂。3、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述流动相中乙腈:水的体积比为3:10040:100。4、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述对照品溶液的制备精密称取经五氧化二磷干燥过夜的8-0-乙酰基山栀苷甲酯对照品，用水制成浓度介于0.1-100.0吗'mr1的梯度溶液。5、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述独一味制剂样品溶液的制备将独一味制剂溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，使8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于o.i-ioo.o吗Tnr1，即得样品溶液。6、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述独一味药材样品溶液的制备将独一味药材采用水提、醇提或超声提�。锰崛∫合∈椭�8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于0.1100.0pg'mr1，即得样品溶液。7、如权利要求1所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述独一味提取物样品溶液的制备将独一味提取物溶于甲醇或乙醇的任何比例的水溶液中，稀释至8-0-乙酰基山栀子苷甲酯的浓度介于0.1-100.0^mr1，即得样品溶液。8、如权利要求5所述液相色谱法测定独一味中8-0-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，其特征在于所述独一味制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊剂、分散剂、口服液体制剂、针剂、膜剂、气雾剂、散剂及外用制剂。全文摘要本发明提供了一种液相色谱法测定独一味中8-O-乙酰基山栀子苷甲酯含量的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水为流动相，在检测波长230～240nm，流速0.5～2.0mL/min，进样量5～50μl的色谱条件下，将制备的样品溶液进行液相色谱分析，测定对照品溶液相应位置的色谱峰面积，按标准曲线计算相应的含量。本发明的测定方法适用于独一味药材及由独一味药材制得的提取物及制剂。文档编号G01N30/02GK101308123SQ20081015027公开日2008年11月19日申请日期2008年7月1日优先权日2008年7月1日发明者李茂星,贾正平申请人:李茂星

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