专利名称：一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及动物源食品和果蔬类农产品中农药残留检测试纸条，具体说是涉及到一种一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸。
背景技术：
阿维菌素(Avermectin, AVM)是由日本科学家大村智和美国Merck公司于1976年 从链霉菌MA-4680的发酵产物中得到的一种大环内酯抗生素类杀虫、杀螨剂。AVM属于昆虫神经毒剂，主要干扰害虫神经生理活动，刺激释放C2氨基丁酸，抑制神经传导，使害虫麻痹中毒而死，具触杀和胃毒作用，无内吸性，是目前应用最广泛的抗寄生虫药物，被广泛的应用于农作物疾病防治和畜禽的健康养殖。AVM虽然属于微生物源农药，但其具有极强的脂溶性，不论以何种途径给药均能很好地被吸收，可广泛分布于全身组织，体内持续时间长，因而消除缓慢。世界卫生组织将AVM认定为高毒化合物。研究表明，AVM对大鼠的LD5tl为10 mg/kg，属高毒农药。研究还发现，AVM对哺乳动物的繁殖能力具有潜在的毒性，当实验鼠摄入量为I. 19-2. 13 mg/(只
d)后，雄性老鼠的生育生殖能力显著下降，且配偶发生死胎的机率明显提高。因此，国际上对AVM的最高残留限量MRL (Maximum Residue Limits)要求非常严格,对其残留指标的检测十分重视，制定了相当严格的MRL值。中国农业部规定其在柑桔中MRL为20 μ g/kg,叶菜中为50 μ g/kg ;欧盟规定其在果蔬产品、谷物等农产品中MRL为10 μ g/kg;韩国规定其在苹果中MRL为20 yg/kg，芹菜为50 μ g/kg ;以色列规定其在黄瓜、茄子、桃子、草莓等果蔬农产品中MRL为10 μ g/kg;澳大利亚规定在苹果、梨、番茄等产品中的MRL为10 μ g/
kg ο目前，AVM残留检测的方法主要有薄层色谱法(TLC)，气相色谱法(GC)，高效液相色谱一紫外检测法(HPLC-UV)，高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)，气-质联用法(HPLC-MS )，液-质联用法(LC-MS )，毛细管电泳法(CE )，酶联免疫法(ELISA)等。这些方法存在着仪器设备复杂，操作步骤多，过程繁琐，检测费用高，需要在实验室进行，并且要求专门的技术人员等问题。
发明内容本实用新型的目的在于提供一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，其具有特异性强、灵敏度高、准确、方便、便宜、大众化的检测阿维菌素残留的胶体金试纸。本实用新型的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，是由塑料基板、加样区、金标区、反应显色区及吸水区，上述各区带边缘依次重叠搭接，粘贴固定在塑料基板上；在反应显色区上设有三条检测带和一条质控带。作为本实用新型的进一步改进，所述的金标区由金标AVM包被抗原AVM-OVA构成。作为本实用新型的进一步改进，所述的AVM包被抗原AVM-OVA是由AVM和蛋白载体鸡卵清蛋白OVA偶联而成。[0009]作为本实用新型的进一步改进,所述的金标AVM包被抗原AVM-OVA由胶体纳米金颗粒标记AVM包被抗原AVM-OVA而成，其浓度为5 μ g/L^15 μ g/L。作为本实用新型的进一步改进，所述的三条检测带包被有不同浓度梯度的AVM单克隆抗体。作为本实用新型的 进一步改进，所述的三条检测带分别是包被浓度为1.0 μ g/L的第一检测带，包被浓度为2. O μ g/L的第二检测带，包被浓度为5. O μ g/L的第三检测带。作为本实用新型的进一步改进，所述的一条质控带包被有一定浓度的鼠抗鸡卵清蛋白抗体。作为本实用新型的进一步改进，所述的吸水区由滤纸构成。当该试纸条用来检测样品时，把预处理过的样品滴于该试纸条的加样区，样品由于毛细作用进行侧向层析，首先经过金标区，样品会将金标AVM包被抗原复溶，然后一起进行侧向层析。当经过硝酸纤维素滤膜上的显色检测区时，金标AVM包被抗原会和检测带上的AVM单克隆抗体及质控带上的鼠抗鸡卵清蛋白抗体进行抗原抗体特异反应显色。若样品中含有AVM或其含量超过一定浓度(I. O μ g/L, 2. O μ g/L, 5. O μ g/L)时，其就会同金标AVM包被抗原竞争而与检测带上包被的AVM单克隆抗体结合，由于样品中AVM与金标AVM包被抗原相比分子量小很多，层析时空间位阻也很小，从而使得样品中AVM比金标AVM完全抗原更快更容易与AVM单克隆抗体结合，因而使得AVM包被抗原不能够和检测带AVM单克隆抗体结合显色，这样金标AVM包被抗原会继续层析与其余AVM单克隆抗体和抗鸡卵清蛋白抗体结合显色。本实用新型的有益效果提高了检测的特异性、灵敏性。利用胶体纳米金颗粒标记AVM完全抗原(包被抗原AVM-0VA)，提高了其检测结果可视性，进一步提高了灵敏性，摆脱了特定仪器的束缚，降低了成本，使得该试纸条的使用对象更加准确、方便、便宜、大众化。
图I为一种检测阿维菌素残留含量的胶体金试纸条的结构示意图；图2为图I的分解图。图3为检测结果说明图。
具体实施方式
本实用新型的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，其特征在于塑料基板I、加样区2、金标区3、反应显色区4及吸水区9，上述各区带边缘依次重叠搭接，粘贴固定在塑料基板I上；反应显色区4设有三条检测带和一条质控带8。所述的金标区3由金标AVM包被抗原AVM-OVA构成；三条检测带包被有不同浓度梯度的AVM单克隆抗体其浓度分别为其中检测带5的包被浓度为1.0 μ g/L，检测带6的包被浓度为2. O μ g/L，检测带7的包被浓度为5. O μ g/L ;质控带8包被有一定浓度的鼠抗鸡卵清蛋白抗体；吸水区9由滤纸构成。所述的AVM包被抗原AVM-OVA是由AVM和蛋白载体鸡卵清蛋白OVA偶联而成。[0021 ] 所述的AVM包被抗原AVM-OVA由胶体纳米金颗粒标记AVM包被抗原AVM-OVA而成，其浓度为5 μ g/L 15 μ g/L。[0022]本实用新型的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸的制备1、AVM单克隆抗体的制备(I)将AVM用琥珀酸羧化成羧基AVM，再用碳二亚胺法使其分别与血蓝蛋白KLHjI卵清蛋白OVA藕联，用透析法纯化AVM藕联蛋白，用紫外扫描法鉴定其藕联效果。最终制成AVM完全抗原(免疫抗原AVM-KLH，包被抗原AVM-OVA )；(2 )用AVM免疫抗原AVM-KLH免疫BALB/C小鼠，三次免疫后，测小鼠血清抗体效价，最后进行加强免疫，取效价高的小鼠为脾细胞提供者；(3)用8-杂氮鸟嘌呤驯化SP2/0细胞，待其驯化好后，按照经典动物细胞融合法将SP2/0细胞与体内产生高的抗体水平的小鼠脾细胞进行融合；(4 )用AVM包被抗原AVM-OVA包被酶标板，间接ELISA法检测能够分泌AVM抗体的融合细胞，并按照有限稀释法进行亚克�。钡缴秆〕瞿芄怀晒Ψ置贏VM单克隆抗体的稳 定的融合细胞株；(5)将筛选出的稳定的能够分泌AVM单克隆抗体的阳性细胞株进行扩大培养，并将其注射进预先经过石蜡驯化的纯系BALB/C小鼠腹腔内，使其产生大量含有分泌AVM单克隆抗体的腹水；(6)将收集到的腹水进行浓缩、提纯，进而得到AVM单克隆抗体。2、鼠抗鸡卵清蛋白(OVA)抗体的制备(I)将鸡卵清蛋白按照常规免疫程序免疫BALB/C小鼠，三次免疫后ELISA法测定小鼠抗体效价，以确定小鼠抗体水平；(2)将效价最高的小鼠进行眼球摘除法采血，分离得其血清，按照辛酸-硫酸铵法纯化得到鼠抗鸡卵清蛋白OVA抗体。3、胶体纳米金颗粒的制备(I)在洁净的烧杯中加入一定量(100 mL)的O. 01%的氯金酸水溶液，然后加热至沸腾；(2)在搅拌状态下加入一定浓度(I. 0%)的柠檬酸三钠水溶液I mL，继续煮沸10min，反应体系颜色从金黄色逐渐变为紫红色；(3)静置冷却后，用去离子水恢复至原有体积，最终制成符合条件的(粒径约为40nm)胶体纳米金颗粒。4、胶体金标记AVM包被抗原AVM-OVA (I)通过预实验确定胶体金标记AVM包被抗原AVM-OVA的最佳pH值和浓度；(2)将制得的胶体金溶液通过用O. I M碳酸钾调整至最佳pH值(pH 8. 5)；(3)将AVM包被抗原AVM-OVA经过进一步透析、过滤等处理，尽可能去除一些影响金标过程的离子和粒子等杂质； (4)电磁搅拌条件下，将经过处理的AVM包被抗原AVM-OVA按照优化出的条件浓度(3.0 mL)逐滴加入100 mL的胶体金溶液中；(5) 10 min后，加入10% BSA至其浓度为1%，以稳定其反应体系，继续搅拌均匀；(6)将制得的金标AVM包被抗原AVM-OVA溶液经过离心(15000 g，4 0C, 30 min)后，小心吸取上清,用含1% BSA的PBS恢复原体积重悬后，再离心，即重复洗涤3次；(7)将沉淀最终用含稳定剂(1% BSA或O. 3 mg/mL PEG)的PBS重悬至合适浓度。加入一定量的O. 5 mg/mL叠氮钠可长期4 °C保存。5、AVM残留半定量检测试纸条的装配(I)将玻璃纤维经过含1% BSA和1%吐温-20的PBS (pH 7.4,0.01 Μ)活化处理后，浸在金标AVM包被抗原AVM-OVA溶液中30 min,自然风干，即可将金标AVM包被抗原AVM-OVA包被在玻璃纤维膜上；(2)在硝酸纤维素滤膜上间隔O. 2 cm依次喷涂上三条梯度浓度的AVM单克隆抗体 溶液带作为检测带，其浓度依次为1.0 μ g/L,2. O μ g/L,5. O μ g/L。鼠抗鸡卵清蛋白OVA抗体为质控带。然后将硝酸纤维素膜用含1% BSA的PBS (pH 7. 4,0. 01 Μ)封闭2 h，自然风干；(3)最后，将加样膜(主要成分为滤纸或玻璃纤维，作为采样区)、喷涂有金标AVM包被抗原的玻璃纤维膜(金标区)、包被检测带和质控带的硝酸纤维素滤膜(显色区)、吸水滤纸(吸水区)依次贴在塑料底板上制成AVM残留检测试纸。本实用新型的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸的使用( I)将待测样品进行预处理液态样品，包括动物体液(血清、尿液、乳汁等)和液态饮品(牛奶，果汁等)，不用进行预处理，或者用蒸馏水进行等倍稀释即可。肉类样品，取I. O g样本置捣碎杯中与10. O mL丙酮溶剂混合,高速捣碎2 min,超声波振荡30 min,以10 000 rpm离心10 min。取上清液ImL,备用。果蔬样品，取粉碎后的果蔬样品10. O g，加入50 mL乙腈，在14 OOOrpm高速匀质器中匀质2 min后，用滤纸过滤，滤液收集到装有5-7 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，收集滤液，盖上塞子，剧烈震荡2 min，在室温下静止30 min，使乙腈相和水相分层。从乙腈相中吸取10 mL溶液，备用。(2)将微量样本滴入加样区，或将试纸条伸入样品中即可开始检测。5-10 min后即可观察结果。(3)结果判定(结合说明书附图3)如果三条检测带和质控带均显色，则说明样品呈阴性，样品中不含AVM或AVM含量低于I. O μ g/L，如图3中I所示；如果检测带5不显色，而其他两条检测带和质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中AVM含量在I. O μ g/L -2.0 μ g/L之间，如图3中2所示；如果检测带5和检测带6均不显色，检测带7和质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中AVM含量在2.0 μ g/L -5. O μ g/L之间，如图3中3所示；如果检测带5、6、7都不显色，只有质控带显色，则说明样品呈阳性，样品中AVM含量达到或超过5. O yg/L，如图3中4所示；如果检测带均不显色，质控带也不显色，则说明该试纸条已经失效，不能使用，须更换新的试纸条后重新检测，如图3中5所示。
权利要求1.一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，其特征在于塑料基板(I)、加样区(2)、金标区(3)、反应显色区(4)及吸水区(9)，上述各区带边缘依次重叠搭接，粘贴固定在塑料基板(I)上；在反应显色区(4)上设有三条检测带和一条质控带(8)。
2.如权利要求I中所述的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，其特征在于吸水区(9)由滤纸构成。
专利摘要本实用新型的一种检测阿维菌素残留的胶体金试纸，由塑料底板、加样区、金标区、显色区及吸水区组成。采用竞争法原理，使样品中的AVM与金标AVM包被抗原AVM-OVA竞争，从而与检测带上的AVM单克隆抗体结合显色，建立样品中AVM含量与检测带显色条数对应的关系，进而根据显色区中条带显色数量来判断样品中AVM含量。本实用新型具有操作简单、敏感特异、携带方便等特点。可应用于动物源食品和果蔬类农产品的AVM残留检测。
文档编号G01N33/531GK202383142SQ20112045077
公开日2012年8月15日 申请日期2011年11月15日 优先权日2011年11月15日
发明者初海坤, 张爽, 徐亚军, 晏磊 申请人:黑龙江八一农垦大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
