专利名称：非标记型均相比色检测铅离子的方法
技术领域：
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及ー种非标记型均相比色检测铅离子的方法。
背景技术：
重金属对环境的污染引起人们极大的关注，因为它严重影响人类健康。特别是Pb2+，对人类健康和环境造成严重的威胁。铅具有不可降解性，并且能在环境中长期存在。铅作用于人体后能产生神经毒素，会造成心脏、肾脏慢性炎症，抑制大脑发育，降低运动功能和神经传导速度。美国环境保护署规定饮用水含铅量不得超过15yg/L(72nmol/L)。因此，建立准确有效的铅检测方法具有重要的应用价值和实际意义。目前铅离子检测方法主要有电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子荧光光谱法(AFS)、原子吸收光谱法(AAS)和反相高效液相色谱法等。尽管这些方法灵敏、准确，但是或多或少存在ー些缺点，例如，费时、仪器销售价格贵或需要高级设备等等。因此，急需研究一种简便、经济、高灵敏和高选择性的铅检测方法。比色法能够做到简单、快速检测生理和环境中的金属离子。其中金納米棒由于其纳米结构的特殊性而得到广泛的关注，它有两个等离子吸收峰，分别是横向等离子吸收峰和纵向等离子吸收峰。横向等离子吸收峰位于520nm左右，纵向等离子吸收峰通常大于600nm。由溴化十六烧基三甲铵包被的金纳米棒,不仅稳定性好，而且金纳米棒表面带正电荷，由于其具有独特的物理特性，而广泛应用于医学影像和生物传感领域。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述铅离子检测方法的缺点，提供ー种方法简单、快速、易于操作、灵敏度高、选择性好的非标记型均相比色检测铅离子的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成I、制备金纳米棒(I)制备金种将7. 5mL浓度为O. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98 μ L质量分数为1%的HAuCl4和152 μ L超纯水的烧瓶中，搅拌，加入600 μ L浓度为10mmol/L的NaBH4，搅拌2分钟，静置2小时，制备成金种。(2)制备金纳米棒溶液在47.6mL O. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788 μ L质量分数为I %的HAuCl4 和 1600 μ L H2O,再依次加入 300 μ L O. OlM AgNO3 和 320 μ L O. lmol/L 抗坏血酸作为还原剂，搅拌2分钟，加入215 μ L金种，搅拌20秒，30°C静置24小吋，制备成金纳米棒溶液装入棕色广ロ瓶，置于冰箱4°C保存备用。2、配制核酸探针母液按常规方法将T30695核苷酸用10mmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100 μ mol/L的T30695核酸溶液，储存于_20°C备用。T30695核苷酸DNA序列为5’ -GGGTGGGTGGGTGGGT-3’，该核苷酸DNA序列来源于American Chemical Society 数据库，并命名为 T30695。将T30695核酸溶液用lOmmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5 μ mol/L的核酸探针母液，置于冰箱4°C保存备用。3、測定金納米棒-核酸探针溶液的紫外光谱将金纳米棒溶液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入5 μ mol/L的核酸探针母液混合均勻，5 μ mol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三轻甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金納米棒溶液的体积比为I :50 70 :150 200，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱。
4、制作标准曲线向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液，依次配制成物质的量浓度为 5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、I μ mol/L、2 μ mol/L、3 μ mol/L的铅离子标准溶液，用紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱，以Ig浓度为5nmol/L-l μ mol/L铅离子溶液为横坐标X，吸光度的变化值Λ A为纵坐标Y，吸光度的变化值ΛΑ:Δ A=A0-A式中Atl为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度，A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度。由origin 8. O软件作图得标准曲线Υ=0. 03245X+0. 3030线性相关系数为0. 9932。5、检测样品溶液中的铅离子(I)水样的预处理量取自来水IOOmL,煮沸5分钟去除氯，备用；(2)将金纳米棒-核酸探针溶液与预处理的水样按体积比为3 1混合均匀，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率R%=m 测/m 实式中!!^是待测样品中铅的质量,是标准样品中铅的质量。在本发明的測定金納米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中，将金纳米棒溶液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入5 μ mol/L的核酸探针母液混合均匀，5ymol/L的核酸探针母液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的优选体积比为I :55 65 :160 200，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱。在本发明测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中，将金纳米棒溶液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入5 μ mol/L的核酸探针母液混合均匀，5 μ mol/L的核酸探针母液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金納米棒溶液的体积比为I :60 :180，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱。
图I是采用实施例I检测不同浓度铅离子的紫外吸收光谱图。图2是采用实施例I检测不同浓度铅离子的紫外吸收变化线性曲线图。图3是采用实施例I检测不同金属离子的紫外吸收变化图。图4是采用实施例I检测不同金属离子的紫外吸收的颜色变化图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进ー步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I本实施的非标记型均相比色检测铅离子的方法由下述步骤组成I、制备金纳米棒(I)制备金种将7. 5mL浓度为O. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98 μ L质量分数为1%的HAuCl4和152 μ L超纯水的烧瓶中，搅拌，加入600 μ L浓度为10mmol/L的NaBH4，搅拌2分钟，静置2小时，制备成金种。(2)制备金纳米棒溶液在47.6mL O. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788 μ L质量分数为I %的HAuCl4 和 1600 μ L H2O,再依次加入 300 μ L O. OlM AgNO3 和 320 μ L O. lmol/L 抗坏血酸作为还原剂，搅拌2分钟，加入215 μ L金种，搅拌20秒，30°C静置24小吋，制备成金纳米棒溶液装入棕色广ロ瓶，置于冰箱4°C保存备用。2、配制核酸探针母液按常规方法将T30695核苷酸用10mmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100 μ mol/L的T30695核酸溶液，储存于_20°C备用；T30695核苷酸DNA序列为5’ -GGGTGGGTGGGTGGGT-3’，该核苷酸DNA序列来源于American Chemical Society 数据库，并命名为 T30695。将T30695核酸溶液用lOmmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5 μ mol/L的核酸探针母液，置于冰箱4°C保存备用；3、測定金納米棒-核酸探针溶液的紫外光谱将150 μ I金纳米棒溶液与50 μ I浓度为lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入0. 8 μ I浓度为5 μ mol/L的核酸探针母液混合均勻，5 μ mol/L的核酸探针母液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金納米棒溶液的体积比为I :60 180，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用U-3900H紫外分光光度计测定紫外光谱见图I。在图I中，曲线a为金纳米棒-核酸探针溶液的紫外吸收光谱图。4、制作标准曲线向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液，依次配制成物质的量浓度为 5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、I μ mol/L、2 μ mol/L、3 μ mol/L的铅离子标准溶液，用U-3900H紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱，测得吸光度依次为 0. 346,0. 329,0. 315,0. 298,0. 281,0. 267,0. 239,0. 232，见图 I。、在图I中横坐标X是以Ig浓度为5nmol/L-l μ mol/L铅离子溶液，纵坐标Y是吸光度的变化值ΛA，吸光度的变化值ΛΑ:Δ A=A0-A式中Atl为金纳米棒-核酸探针溶液中金納米棒的长轴吸光度为O. 377，A为在金納米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金納米棒的长轴吸光度依次为O. 346、O. 329,0. 315,0. 298,0. 281,0. 267。见图 2，由 origin 8. O 软件作图得标准曲线Y=O. 03245X+0. 3030 线性相关系数为O. 9932。5、检测样品溶液中的铅离子(I)水样的预处理打开水管放水20分钟，量取自来水lOOmL，煮沸5分钟去除氯，备用；(2)将150 μ I金纳米棒溶液-核酸探针溶液与50 μ I预处理的水样混合均匀，采用标准加入法进行铅离子的回收，加入标准铅离子溶液检测浓度为30nmol/L和60nmol/L，检测结果见表1，按下式计算铅离子的回收率R%=m测/m *式中!11_是待测样品中铅的质量，11^是标准样品中铅的质量，计算结果见表I。表I自来水中铅离子加标回收率
权利要求
1.一种非标记型均相比色检测铅离子的方法，由下述步骤组成 (1)制备金纳米棒 ①制备金种 将7. 5mL浓度为0. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵加入含有98 y L质量分数为I %的HAuCl4和152 u L超纯水的烧瓶中，搅拌，加入600 u L浓度为10mmol/L的NaBH4,搅拌2分钟，静置2小时，制备成金种； ②制备金纳米棒溶液 在47. 6mL 0. lmol/L的溴化十六烷基三甲铵中加入788 y L质量分数为1%的HAuCl4和1600 u L H2O,再依次加入300 u L 0. OlM AgNO3和320 u L 0. lmol/L抗坏血酸作为还原齐IJ，搅拌2分钟，加入215 ii L金种，搅拌20秒，30°C静置24小时，制备成金纳米棒溶液装入棕色广口瓶，置于冰箱4°C保存备用； (2)配制核酸探针母液 按常规方法将T30695核苷酸用lOmmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液配制成物质的量浓度为100 u mol/L的T30695核酸溶液，储存于_20°C备用；T30695 核苷酸 DNA 序列为 5’ -GGGTGGGTGGGTGGGT-3 ’ ； 将T30695核酸溶液用lOmmol/L pH为7. 4的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释成5 u mol/L的核酸探针母液，置于冰箱4°C保存备用； (3)测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱 将金纳米棒溶液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入·5 V- mol/L的核酸探针母液混合均勻，5 ii mol/L的核酸探针母液与10mmol/L的三轻甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为I :50 70 :150 200，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱； (4)制作标准曲线 向金纳米棒-核酸探针溶液中逐级加入铅离子标准溶液，依次配制成物质的量浓度为5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、Iu mol/L、2 u mol/L、3 u mol/L 的铅离子标准溶液，用紫外分光光度计测定上述不同浓度铅离子标准溶液的紫外光谱，以Ig浓度为5nmol/L-l u mol/L铅离子溶液为横坐标X，吸光度的变化值A A为纵坐标Y，吸光度的变化值AA A A=A0-A 式中Atl为金纳米棒-核酸探针溶液中金纳米棒的长轴吸光度，A为在金纳米棒-核酸探针溶液中加入铅离子标准溶液后金纳米棒的长轴吸光度。由origin 8.0软件作图得标准曲线Y=0. 03245X+0.3030 线性相关系数为0. 9932 ； (5)检测样品溶液中的铅离子 ①水样的预处理 量取自来水lOOmL，煮沸5分钟去除氯，备用； ②将金纳米棒-核酸探针溶液与预处理的水样按体积比为31混合均匀，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率R%=m测/m实 式中是待测样品中铅的质量，是标准样品中铅的质量。
2.根据权利要求I所述的非标记型均相比色检测铅离子的方法，其特征在于在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三轻甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入5 u mol/L的核酸探针母液混合均匀，5 u mol/L的核酸探针母液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为I :55 65 :160 200，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱。
3.根据权利要求I所述的非标记型均相比色检测铅离子的方法，其特征在于在测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱步骤3中,将金纳米棒溶液与10mmol/L的三轻甲基氨 基甲烷-醋酸缓冲溶液混合，并加入5 y mol/L的核酸探针母液混合均匀，5 y mol/L的核酸、探针母液与lOmmol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液、金纳米棒溶液的体积比为I :·60 :180，制备成金纳米棒-核酸探针溶液，用紫外分光光度计测定紫外光谱。
全文摘要
一种非标记型均相比色检测铅离子的方法，由制备金纳米棒、配制核酸探针母液、测定金纳米棒-核酸探针溶液的紫外光谱、制作标准曲线、检测样品溶液中的铅离子步骤组成。本发明采用金纳米棒的等离子共振吸收光学性质和Pb2+能够诱导富G碱基DNA形成G-四链体结构，建立了一种快速简单比色检测Pb2+的方法。本发明经过检测灵敏度和选择性实验，结果表明，本发明检测铅离子的线性范围为5nM～1μM，检测限为3nM，具有方法简单、经济、选择性好、灵敏度高等优点，可用于样品中铅离子的检测。
文档编号G01N21/33GK102735639SQ20121022211
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者王文红, 金燕, 陈国珍 申请人:陕西师范大学
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