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专利名称：一种硫酸铜快速定量分析发酵液提取物中长链二元酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及二元酸发酵技术领域的检测方法，具体地，涉及一种利用硫酸铜比色法快速定量分析发酵液提取物中长链二元酸的方法。
背景技术：
长链二元酸(long chain dicarboxylic acids, DCAs)是指碳链中含有10个以上碳原子的脂肪族二元羧酸。长链二元酸是重要的有机酸产品，用于合成高性能工程塑料尼龙1212、高档服装用尼龙热熔胶和高级涂料等，市场需求量相当大。用化学法生产长链二元酸存在技术、设备要求，高能耗大等缺点，而且一些长链二元酸也难以用化学方法制备，目前长链二元酸的生产逐步采用微生物发酵法进行。在长链二元酸发酵过程中，必须经常性的对发酵液中长链二元酸含量进行分析，以合理的控制发酵进程。对发酵过程产酸量分析可以采用气相色谱法、薄层色谱法、以及NaOH滴定法，其中气相色谱法需使用价格昂贵的气相色谱仪、还需对长链二元酸进行衍生处理，不但成本高、检测时间长，而且对系统的各项要求也很高(中国科学院微生物研究所烃代谢组.微生物的正烷烃代谢I假丝醉母的正烷经代谢产物的研究.微生物学报，1981，21(1) 88-95)；薄层色谱法同样也存在检测时间长、仪器设备要求高的问题(王丽华等.薄层色谱法分析十三碳二元酸及其单、双甲酯.石油化工高等学校学报，2003，16 O) :29-32)。NaOH滴定法由于操作简单，常用于发酵过程粗提产品中长链二元酸的快速分析，但滴定法存在较大误差一直难以克服。李占朝等研究表明为了获得较准确的检测结果，需要经过多次重复实验，取其平均值(李占朝.十二碳二元酸的重结晶精制工艺研究.北京化工大学硕士学位论文，2009，17-26.)。此外，发酵生产长链二元酸粗提工艺大多采用酸沉淀法，直接利用NaOH滴定计算二元酸产量，提取物中无机酸残留也会造成较大误差。因此，研究建立一种简便、准确、高效的长链二元酸检测方法， 可供实验研究及实际生产的分析检测所需。

发明内容
本发明的目的在于提供一种利用硫酸铜比色法快速定量分析发酵液提取物中长链二元酸的方法。通过长链二元酸与硫酸铜-甲醇溶液的Cu2+反应形成沉淀，离心去除沉淀后，在600-850nm检测上清液吸光值，根据标准曲线计算长链二元酸的含量。本发明包括发酵长链二元酸样品的制备，比色法快速分析长链二元酸含量两部分。操作步骤如下(1)发酵长链二元酸样品的制备取体积为V1的发酵液加lmol/1氢氧化钠调节pH至9. 5、60°C下振荡30min使长链二元酸充分溶于水相中。离心使发酵液中固相、水相及发酵剩余烷烃分离，取出体积为V2 的水相部分，用6mol/L HCl调pH值至2. 0，加入2倍V2体积的乙醚进行抽提，分相后乙醚萃取液倒入烧杯中，再以2倍V2体积的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通风橱中吹去乙醚，得到白色固体即为长链二元酸粗提物。(2)比色法快速分析长链二元酸含量①配制硫酸铜-甲醇溶液称取Ig硫酸铜加入干燥的锥形瓶中，量取20_200mL甲醇与硫酸铜混合，摇勻，至硫酸铜完全溶解。②检测波长的选择取硫酸铜-甲醇溶液进行光谱扫描，以最强吸收峰波长为检测分析波长。对空白测定20次，方法的检出限(3s/k)为0.011mg/mL。③标准曲线的建立精确称量标准十二烷二酸25、50、75、100、125、150、175、 200mg，加入5mL硫酸铜-甲醇反应溶液，使标准十二烷二酸浓度分别为5、10、15、20、25、 30、35、40mg/mL(每个标准样设3个平行)，常温120rpm振荡反应10_60min，5000rpm离心 IOmin,取上清液于820nm波长处测定吸光值。以OD82tl为横坐标，标准十二烷二酸含量为纵坐标绘制工作曲线，线性回归方程为C1 = -91. 185X0D82Q+101.66，决定系数R2 = 0. 9920。④样品中长链二元酸含量分析将一定量的待测物加入到5mL硫酸铜-甲醇反应监测溶液中，常温120rpm振荡反应10_60min，5000rpm离心lOmin，取上清液于820nm波长处测定吸光值。将吸光值代入标准曲线的线性回归方程中，即可计算出检测反应液中长链
二元酸的含量。根据以下公式即可算出发酵液中长链二元酸含量(以十二烷二酸为标准)
…r、 C C1 c 101.66-91.185XOD820C(g/L) = 5x-^ = 5x---^
厂2*2本发明的优点在于长链二元酸易溶于甲醇，在均相条件下和显色剂硫酸铜反应迅速、完全；利用比色法检测反应上清液吸光值，操作简单，提高检测结果的精确度；整个分析检测不需要昂贵仪器设备或贵重试剂，成本低。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实施例子对本发明做进一步的描述。实例1 (1)发酵长链二元酸样品的制备取IOOmL发酵液加lmol/L氢氧化钠调节pH至9. 5、60°C下振荡30min使长链二元酸充分溶于水相中。SOOOrpm离心IOmin使发酵液中固体、水相以及发酵剩余烷烃分离，取出IOmL水相部分，用6mol/LHCl调pH值至2. 0，加入20mL乙醚进行抽提，分相后乙醚萃取液倒入烧杯中，再以20mL的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通风橱中吹去乙醚，得到白色固体即为长链二元酸提取物。(2)比色法快速分析长链二元酸含量将长链二元酸提取物加入到5mL硫酸铜-甲醇反应监测溶液中，常温120rpm振荡反应10-60min，5000rpm离心lOmin，取上清液于820nm波长处测定吸光值。根据公式
C(8/L) = 5χ·| = 5χ !Ο1.66-9 5·82。算出发酵液中长链二元酸含量。检测结果发酵液中长链二元酸的浓度为6. 17g/L实例2:(1)发酵长链二元酸样品的制备取IOOmL发酵液加lmol/L氢氧化钠调节pH至9. 5、60°C下振荡30min使长链二元酸充分溶于水相中。SOOOrpm离心IOmin使发酵液中固体、水相、发酵剩余烷烃分离，取出 30mL水相部分，用6mol/LHCl调pH值至2.0，加入60mL乙醚进行抽提，分相后乙醚萃取液倒入烧杯中，再以60mL的乙醚重新萃取一次，合并萃取液，在通风橱中吹去乙醚，得到长链二元酸提取物。(2)比色法快速分析长链二元酸含量将长链二元酸提取物加入到5mL硫酸铜-甲醇反应监测溶液中，常温120rpm振荡反应10-60min，5000rpm离心lOmin，取上清液于820nm波长处测定吸光值。根据公式
权利要求
1.一种硫酸铜快速定量分析发酵液提取物中长链二元酸含量的方法，包括发酵产长链二元酸样品的制备，比色法快速分析长链二元酸含量；其特征在于利用长链二元酸与硫酸铜-甲醇溶液反应，沉淀溶液中铜离子，固液分离后使用比色法检测上清液吸光值，长链二元酸含量与吸光值成反比关系，根据由标准长链二元酸绘制的标准曲线计算发酵液提取物中长链二元酸含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于使用十二烷二酸作为长链二元酸标准，十二烷二酸在硫酸铜-甲醇反应溶液的浓度范围为0-40mg/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于硫酸铜-甲醇反应溶液浓度为5-50g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于分析测量波长为600-850nm。
全文摘要
本发明提供了一种硫酸铜快速定量分析发酵液提取物中长链二元酸含量的方法。发酵液中长链二元酸经提取后，加入硫酸铜-甲醇溶液并充分反应，固液分离后利用比色法检测上清液吸光值，根据长链二元酸含量与吸光值成反比关系计算出发酵液提取物中长链二元酸含量。本发明操作简单，精确度高，成本低，是一种很好的长链二元酸检测分析方法。
文档编号G01N21/78GK102183514SQ201110028098
公开日2011年9月14日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者余运玲, 林日辉 申请人:广西民族大学