专利名称：检测弓形虫IgM抗体的电化学免疫传感器及其制备方法
技术领域：
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及一种检测弓形虫IgM抗体的电化学免疫传感器的制备方法，具体是基于抗原抗体间的反应，用于检测孕妇血清中弓形虫IgM抗体(Tg-IgM)的免疫传感器及其制备方法。
背景技术：
随着现代饮食习惯改变和家养宠物增多，弓形虫病的感染率呈逐年上升趋势，孕期弓形虫感染可引起孕妇流产、早产、畸胎或死胎，并且会导致新生儿神经性损伤或视觉障碍。弓形虫特异性IgM抗体(Tg-IgM)在弓形虫感染14天即可出现于孕妇血清之中，可作为弓形虫病近期感染和早期诊断的有效指标。IgM抗体分子量大不能通过胎盘，如果胎血中检测到Tg-IgM，说明胎儿宫内感染，是判断孕妇是否终止妊娠的重要指标。目前Tg-IgM已被列为孕妇优生五项(TORCH)指标之一。 现有的诊断Tg-IgM的免疫学方法主要有间接血凝实验、间接免疫荧光抗体实验和酶联免疫吸附实验等。这些方法均存在操作繁琐，检测灵敏度低，且不能准确定量检测等缺点。作为目前临床检测Tg-IgM最为普遍的方法，酶联免疫法不仅存在敏感性和特异性低等问题，且该法样本用量大、检测时间长，难以满足临床快速检测的需要。作为另一种常见的临床检测方法，快速胶体金免疫层析法只能定性或半定量，且容易出现假阴性和假阳性的结果。国内外至今没有一种定量即时检测Tg-IgM的方法。与之相比，电化学免疫传感器不仅具备免疫反应的高特异性，并且结合了电化学检测技术的高灵敏性。此外电化学免疫传感器还具备检测时间短、价格低廉、易于小型化等独特的优点，可有效实现对Tg-IgM的灵敏和定量检测。石墨烯作为新兴纳米材料在生物传感器的制备中展现出良好的导电性能和优异的促电子传递能力，将其修饰于电极表面，可以增加传感器的灵敏度和稳定性。金纳米粒子具有比表面积大、生物亲和性高等优点，与石墨烯共同修饰于电极表面，不仅可有效促进电子的传递，并且可以增加生物分子的固定量，适用于灵敏度高的免疫传感器的制备。目标放大检测蛋白质的方法是提高免疫传感器灵敏度的有效手段，将具有良好生物活性的Au-Fe3O4壳核型纳米粒子用于酶标二抗的标记，制备成复合检测探针。该探针上的高比例辣根过氧化物酶与酶催化反应可双重放大夹心免疫分析的检测信号。聚硫堇作为有效的电子媒介体，可有效的促进电子传递，产生可检测信号。本发明将石墨烯、金纳米粒子通过聚硫堇化学组装于玻碳电极表面，利用金纳米粒子对捕获抗原的高效固定，通过检测探针催化底物产生电化学信号，发明一种用于检测孕妇Tg-IgM的电化学免疫传感器，可以用于孕妇弓形虫感染的灵敏、快速、定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以灵敏、快速、定量检测孕妇血清中Tg-IgM的电化学免疫传感器及其制备方法。该传感器进行检测时灵敏度高，检出限低，制备简便，检测快速，其具体的制备步骤如下(I)将玻碳电极分别经I. O和3. O μ m的Al2O3浆液打磨抛光后，在双蒸水和无水乙醇中分别超声5min,待干；(2)将2mg/mL的GS溶液加入I. OmLO. I %的Nafion溶液中，超声30min,制备成Nf-GS混合液；(3)滴加5 μ LNf-GS溶液在玻碳电极表面，待干，制成Nf-GS修饰玻碳电极；(4)将修饰电极浸入3mM/L的Thi-ABS(pH6.0)溶液中，在_0· 5至O. 15V的电势范围内，以50mV/s的扫速，循环伏安法扫描6圈，电聚合硫堇于Nf-GS修饰的玻碳电极，制成PTH/Nf-GS修饰玻碳电极；(5)将该修饰电极浸入制备的AuNPs溶液中，3h后取出，双蒸水小心冲洗后待干， 制备成AuNPs/PTH/Nf-GS修饰玻碳电极；(6)滴加5μ L弓形虫特异性捕获抗原至修饰电极表面，4°C下孵育8h，双蒸水小心冲洗后待干；(7)滴加5 μ L0. 25界七％的牛血清白蛋白(BSA)用以封闭电极表面的非特异性结合位点，室温下反应40min，双蒸水小心冲洗后待干；(8)将一系列不同浓度的Tg-IgM标准溶液分别滴涂于上述制备的修饰电极表面，37°C 下孵育 25min ；(9)滴加5 μ LAu-Fe3O4-HRP-Bnti-IgM复合检测探针溶液在结合了 Tg-IgM的电极表面，37°C下孵育30min，然后在含有25mM H2O2的ABS(pH6. O)缓冲液中测定其氧化还原电位变化；(10)根据所得电流值与Tg-IgM浓度呈线性关系，绘制工作曲线。本发明中所述的Au-Fe304-HRP-anti-IgM复合检测探针的制备,其过程具体包括以下步骤(I)将 ImgAu-Fe3O4 加入 300 μ LHRP-anti-IgM溶液中，置于 37°C恒温摇床，180rpm振荡反应20min ；(2)通过施加外部磁场对偶联反应液进行磁性分离；(3)用PBS对偶联粒子进行反复清洗3次；(4)加入O. 25%小牛血清(BSA)对偶联粒子上的非特异位点进行封闭；(5)通过再次清洗和磁性分离得到Au-Fe304-HRP-anti-IgM复合检测探针；(6)将该复合检测探针加入PBS缓冲液中，4°C下保存备用。本发明用于定量检测血清中Tg-IgM的测定原理当检测物中含有待测的Tg-IgM时，在孵育过程中会与电极表面的捕获抗原发生抗原-抗体特异性免疫结合，进一步与复合检测探针结合，在传感器表面形成夹心免疫复合物；在含有H2O2的ABS缓冲液中，检测探针上的HRP会催化H2O2产生可转移的电子，而固定在传感器表面的聚硫堇将会作为电子传递的媒介体，将电子传递至电极表面产生电化学信号；该信号与待测的Tg-IgM浓度成正相关，通过绘制工作曲线可以对未知标本中的Tg-IgM进行定量检测。本发明所建立的检测孕妇血清中Tg-IgM的电化学免疫传感器及其制备方法，其体现的优势和特点是(I)本发明中石墨烯具有良好的导电性能和促电子传递能力；聚硫堇作为优异的电子传递媒介，可以高效的促进酶促反应所产生的电子在电极表面的传递；电极修饰过程中金纳米粒子的掺入提高了捕获抗原的分子固定量，并且在电化学检测中有利于电子的传递；三者的共同作用使本发明所制备的传感器具有很高的灵敏度；(2)本发明的检测利用酶功能化的纳米复合检测探针和多种材料修饰的电极，对待测物Tg-IgM实现夹心免疫法检测，该法具有强特异性，样品中其它干扰物质对检测结果无影响；检测时间较短，可以实现快速检测；(3)本发明建立的电化学免疫传感器制备过程简便，检测过程方便，检测结果具有优良的灵敏度、特异性和重现性，可以应用于临床检测。
图I为免疫传感器修饰过程的循环伏安表征图。(a)裸玻碳电极；(b)Nf-GS/玻碳电极；(c) PTH/Nf-GS/玻碳电极；(d) AuNPs/PTH/Nf-GS/玻碳电极；(e)捕获抗原/AuNPs/PTH/Nf-GS/玻碳电极；(f)BSA/捕获抗原/AuNPs/PTH/Nf-GS/玻碳电极。工作溶液为含有
0.IM KCI 的 ABS (pH 6. O)缓冲液，扫速为 50mV/s。图2为Au-Fe304-HRP-anti-IgM复合检测探针的透射电镜图。图3为免疫传感器对一系列不同浓度的Tg-IgM检测所得的工作曲线，插图为结合了 Tg-IgM和检测探针的免疫传感器在含有25mM H2O2的ABS (pH6. O)缓冲液中的循环伏安图，扫速为50mV/s。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例I基于石墨烯、聚硫堇、金纳米粒子的免疫传感器的制备(I)电极的预处理将玻碳电极在麂皮上分别经I. O和3. O μ m的Al2O3浆液打磨抛光至镜面，再于双蒸水和无水乙醇中分别超声5min，待干；(2)Nafion-石墨烯混合液和金纳米粒子的制备将2mg/mL的石墨烯溶液加入
1.OmLO. 1%的Nafion溶液中，超声30min,制备成黑色勻质的Naf ion-石墨烯混合液；称取
O.01wt%氯金酸溶液IOOmL于烧瓶中，加热至8(TC;迅速加入2. 5mL新鲜配制的I %朽1檬酸三钠溶液；加热搅拌至溶液颜色变为深紫红色；自然冷却后存储于棕色容量瓶中(制备所得的金纳米粒子平均粒径为16nm)；(3)石墨烯-聚硫堇-金纳米粒子修饰玻碳电极的制备滴加5 μ L步骤⑵中制备所得的Nafion-石墨烯混合液于步骤(I)预处理的玻碳电极表面,待干,制成Nf-GS修饰玻碳电极；将修饰电极浸入3mM/L的Thi-ABS (pH6. O)溶液中，在-O. 5至O. 15V的电势范围内，以50mV/s的扫速，循环伏安法扫描6圈，电聚合硫堇于Nf-GS修饰的玻碳电极，制成PTH/Nf-GS修饰玻碳电极；将该修饰电极浸入金纳米粒子溶液中，3h后取出，双蒸水小心冲洗后待干，制备成AuNPs/PTH/Nf-GS修饰玻碳电极；(4)免疫传感器的制备滴加5 μ L弓形虫特异性捕获抗原至AuNPs/PTH/Nf-GS修·饰玻碳电极，4°C下孵育8h，双蒸水小心冲洗后待干，随后滴加5 μ LO. 25wt%的牛血清白蛋白(BSA)用以封闭电极表面的非特异性结合位点，室温下反应40min，双蒸水小心冲洗后待干;对不同修饰电极在含有O. IM KCl的ABS (pH6. O)缓冲液中进行循环伏安法研究，其结果如附图I所示裸玻碳电极(曲线a)和仅修饰了 Nf-GS的电极(曲线b)无氧化还原峰的出现；当其表面结合了 PTH后(曲线C)，在-280mV和-150mV处有一对明显的氧化还原峰，氧化峰电流值为48. 8 μ A ;继续修饰上AuNPs后(曲线d)，电流得到进一步的放大，说明AuNPs有增强电子传递的作用；在修饰了捕获抗原和BSA之后(曲线e和f)，电流明显下降，这是由于捕获抗原和BSA均为生物大分子并且不导电，覆盖在电极表面会对电子传递造成阻碍。实施例2利用电化学免疫传感器测定Tg-IgM，绘制工作曲线
(I)制备 Au-Fe3O4-HRP-anti-IgM 复合检测探针将 Img Au-Fe3O4 加 A300 μ LHRP-anti-IgM溶液中，置于37 °C恒温摇床，180rpm振荡反应20min ;通过施加外部磁场对偶联反应液进行磁性分离；用PBS对偶联粒子进行反复清洗3次；加入O. 25%小牛血清(BSA)对偶联粒子上的非特异位点进行封闭；通过再次清洗和磁性分离得到Au-Fe3O4-HRP-Bnti-IgM复合检测探针；将该复合检测探针加入PBS缓冲液中，4°C下保存备用；(2)将一系列不同浓度的Tg-IgM标准溶液分别滴涂于BSA/捕获抗原/AuNPs/PTH/Nf-GS/玻碳电极表面，37°C下孵育25min ；(3)滴加5μ L复合检测探针溶液在结合了 Tg-IgM的电极表面，37°C下孵育30min，然后在含有25mM H2O2的ABS (pH6. O)缓冲液中测定其氧化还原电位变化；(4)根据所得电流值与Tg-IgM浓度呈线性关系，绘制工作曲线。图2为制备所得的复合检测探针的透射电镜图，图中可见直径约为30nm的球形粒子分布于溶液之中，图中粒子成像较为�：馐怯捎诿副甓沽佑诳呛诵文擅琢Ｗ颖砻娴脑颍砻鞲春霞觳馓秸氲某晒χ票�。图3中，不同浓度的Tg-IgM与传感器表面的捕获抗原结合，继而与检测探针反应，然后在含有25mMH202的ABS(pH6. O)缓冲液中，在-O. 5 O. IV区间，以50mV/s的扫描速度，用循环伏安法记录电流变化大小。所得电流值与Tg-IgM浓度在O. 0375 I. 2AU/mL范围内和2. O 18AU/mL范围内分别呈线性相关，相关系数分别为O. 993和O. 997。该传感器对Tg-IgM的检测限达O. 016AU/mL。根据该工作曲线，可以对未知样本中的Tg-IgM含量进行定量检测。实施例3孕妇血清标本中Tg-IgM含量的测定根据实施例2所建立的Tg-IgM检测的工作曲线，采用本发明的方法测定孕妇血清中Tg-IgM含量，采用标准加入法测定其回收率。(I)孕妇血清标本的前处理收集临床健康孕妇的血液标本(来源于重庆市九龙坡区第一人民医院检验科)，以3000rpm离心IOmin,吸取血清标本；(2)在上述血清标本中依次加入2. 0,4. 0,6. 0,8. OAU/mL的Tg-IgM标准品；
(3)进行与实施例I和实施例2相同的方法对电极进行修饰和对Tg-IgM进行测定，对每个加标样品测定5次，根据工作曲线得到样品中Tg-IgM的实际浓度。如表I所示，Tg-IgM的回收率在98. 8% 101. 2%之间，表明该传感器用于孕妇血清标本检测时，结果可靠。表I免疫传感器的回收试验
孕妇血清中Tg-IgM含量Tg-IgM加入量Tg-IgM测定量1RSD回收率~
(AU/mL)(AU/mL)(AU/mL)(%, η = 5)(%) δδ:20772.13,1.87, 1.96,2.09^2710L2
O4.004.01，4.03，3.91,3.88,3.931.6498.8
6.006.16，5.88，5.78，6.21,6.083.07100.4
5.008.09，7.85，8.14，7.81，7.961.8199.权利要求
1.一种检测弓形虫IgM抗体(Tg-IgM)的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)金磁纳米粒子(Au-Fe3O4)-辣根过氧化物酶(HRP)-抗IgM 二抗(anti-IgM)复合检测探针的制备； (2)Nafion-石墨烯混合液(Nf-GS)、聚硫堇(PTH)、金纳米粒子(AuNPs)的制备； (3)建立电化学免疫传感器，测定Tg-IgM，绘制工作曲线。
2.根据权利要求I所述Au-Fe304-HRP-anti-IgM复合检测探针的制备过程，其特征在于具体包括以下步骤 (1)将ImgAu-Fe3O4 加入 300 μ L HRP-anti-IgM 溶液中，置于 37°C恒温摇床，180rpm 振荡反应20min ； (2)通过施加外部磁场对偶联反应液进行磁性分离； (3)用PBS对偶联粒子进行反复清洗3次； (4)加入O.25%小牛血清(BSA)对偶联粒子上的非特异位点进行封闭； (5)通过再次清洗和磁性分离得到Au-Fe304-HRP-anti-IgM复合检测探针； (6)将该复合检测探针加入PBS缓冲液中，4°C下保存备用。
3.根据权利要求I所述的Nf-GS混合液的制备，其特征在于将2mg/mL的GS溶液加A I. OmT,0. I % 的 Nafion 溶液中，超声 30min。
4.根据权利要求I所述的PTH的制备，其特征在于配制3mM/L的Thi-ABS(pH6. O)溶液；将修饰了 Nf-GS的电极置于Thi-ABS溶液中，在-O. 5至O. 15V的电势范围内，以50mV/s的扫速，循环伏安法扫描6圈。
5.根据权利要求I所述的AuNPs的制备，其特征在于称取适量氯金酸溶液于烧瓶中，加热至80°C ;迅速加入新鲜配制的1%柠檬酸三钠溶液；加热搅拌至溶液颜色变为深紫红色；自然冷却后存储于棕色容量瓶中。
6.根据权利要求I所述的建立电化学免疫传感器，测定Tg-IgM，绘制标准曲线，其特征在于包括以下步骤 (1)将5μ LNf-GS溶液滴加在玻碳电极表面，待干，制成Nf-GS修饰玻碳电极； (2)将修饰电极浸入3mM/L的Thi-ABS(pH6. O)溶液中，电聚合硫堇于Nf-GS修饰的玻碳电极，制成PTH/Nf-GS修饰玻碳电极； (3)将该修饰电极浸入制备的AuNPs溶液中，3h后取出，双蒸水小心冲洗后待干，制备成AuNPs/PTH/Nf-GS修饰玻碳电极； (4)滴加5μ L弓形虫特异性捕获抗原至修饰电极表面，4°C下孵育8h，双蒸水小心冲洗后待干; (5)滴加5yL0.25wt%的牛血清白蛋白(BSA)用以封闭电极表面的非特异性结合位点，室温下反应40min，双蒸水小心冲洗后待干； (6)将一系列不同浓度的Tg-IgM标准溶液分别滴涂于上述制备的修饰电极表面，适当温度下反应一段时间； (7)滴加5μLAu-Fe304_HRP-anti-IgM复合检测探针溶液在结合了 Tg-IgM的电极表面，适当温度下反应一段时间，然后在含有25mM H2O2的ABS (pH6. O)缓冲液中测定其氧化还原电位变化； (8)根据所得电流值与Tg-IgM浓度呈线性关系，绘制工作曲线。
7.根据权利要求6所述的用于检测Tg-IgM的电化学免疫传感器的制备过程，其特征在于，所述的将Tg-IgM标准溶液结合于电极表面时的免疫反应条件为在37°C下孵育25min ；将复合检测探针与Tg-IgM结合时的免疫反应条件为在37°C下孵育30min。
全文摘要
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，公开了一种检测孕妇弓形虫IgM抗体(Tg-IgM)的电化学免疫传感器及其制备方法。通过将石墨烯、聚硫堇、金纳米粒子及捕获抗原依次修饰到玻碳电极表面，制得免疫传感器。在Au-Fe3O4表面组装高比例的酶和二抗，制得具有电信号放大作用的酶功能化纳米复合检测探针。根据夹心免疫分析法原理，利用酶对底物催化产生电化学信号来测定Tg-IgM浓度。该传感器结合了免疫反应的特异性和电化学检测的灵敏性，利用石墨烯、聚硫堇、金纳米粒子、Au-Fe3O4等材料促进电子的传递，提高了检测的灵敏性。该传感器操作简便、再生性良好，降低了检测成本。在此基础上制备的免疫传感器还可用于其它免疫标志物的检测，在医学诊断中具有良好的应用前景。
文档编号G01N33/569GK102914648SQ20121037864
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月9日 优先权日2012年10月9日
发明者蒋姝婷, 谢国明, 罗鹏, 花尔辉, 赵朝辉, 马翠霞 申请人:重庆医科大学
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