抗C4.4a抗体及其用途的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：抗C4.4a抗体及其用途的制作方法
抗C4. 4a抗体及其用途本发明提供重组抗原结合区以及含有所述抗原结合区的抗体和功能片段，其对命名为C4. 4a的29 kDa膜锚定多肽具有特异性，所述C4. 4a在肿瘤中过量表达。此外，它在这些癌症类型的转移中具有高丰度。因此，该抗体可用于治疗这些和其它病症和病况。本发明的抗体还可用于诊断领域，以及用于进一步研究C4. 4a在癌症相关病症进程中的作用。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和附有使用说明书的药盒。
背景技术：
基于抗体的疗法证明在治疗包括实体瘤在内的各种癌症中非常有效。例如，HERCEPTIN 已被成功用于治疗乳腺癌，RITUXAN 在B细胞相关癌症类型中是有效的。开发成功的基于抗体的疗法的重点是针对所发现的在肿瘤细胞上优先表达的细胞表面蛋白的抗体分离。C4.4a (基因名LYPD3)多肽是一种糖磷脂酰肌醇(GPI)锚定的高度糖基化的细胞表面蛋白。大鼠C4. 4a最早被描述为在大鼠胰腺肿瘤细胞转移过程中的转移相关的细胞表面蛋白(R5sel Μ.等，Oncogene 1998，17 (15) : 1989-2002)。从胎盘 cDNA 文库中克隆人 C4.4a (ffurfel, J.等，Gene 2001，262:35-41)。C4. 4a 显示与 uPAR 受体有结构同源性，并且含有2个LY6结构域,显示出典型的3指蛋白质折叠(three finger protein fold)(Jacobsen B.和 Ploug Μ. , Current Medicinal Chemistry 2008,15:2559-2573)。该蛋白质是高度糖基化的，含有6个预测的N-糖基化位点和若干O-糖基化位点。此外，C4. 4a共含有 9 个位于 2 个 Ly6 结构域上的二硫键(Hansen L.等，Biochem J. 2004，380:845-857)。在以下肿瘤细胞中C4. 4a显示强表达，如肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌和黑素瘤。RNA印迹分析表明，C4. 4a在约50%的原发性肺肿瘤和约75%的肺肿瘤转移中表达，然而在未患病肺组织中未检出表达(WUrfel J.等，Gene 2001, 262:35-41)。在非小细胞肺癌中，C4. 4a可用作预后标志物。该文的临床数据清楚表明C4. 4a高表达与预后差有关(Hansen L.等，Lung Cancer 2007，58:260-266)。在黑素瘤中，详细的表达分析揭示了 C4. 4a不在黑素细胞和痣中表达，但在约60%的原发性恶性黑素瘤和100%的淋巴结和皮肤转移中表达(Seiter S.等，J Invest Dermatol. 2001,116 (2) : 344-347)。此外，发现在与相当的邻近正常乳腺组织相比的乳腺癌组织中(Fletcher G. C.，Br. J. Cancer2003,88(4) :579-585)、在各种乳腺癌细胞系中以及在与正常尿路上皮相比的尿路上皮癌中(Smith B. A.等，Cancer Res 2001,61 (4) : 1678-1685)，C4. 4a基因表达上调。在结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌的各种肿瘤细胞系中，通过用多克隆抗体的FACS证实了C4. 4a表达。在结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌样品的IHC研究中，人肿瘤细胞系中C4. 4a的可变糖基化干扰这些抗体的结合。因此，C4. 4a必须至少部分去糖基化以允许结合这些多克隆抗体。在结肠直肠癌患者中，C4. 4a表达是十分普遍的，且C4. 4a从细胞表面脱落，使之成为预后血清肿瘤标志物。侵袭前沿C4. 4a的表达是结肠直肠癌疾病复发的新的预后标志物(K. Konishi等,Cancer Science 2010)。未阐述针对可溶血清C4. 4a的诊断抗体(ParetC.等,British Journal of Cancer 2007,97:1146-1156)。在正常组织中，C4. 4a表达限于皮肤角质形成细胞、食管内皮细胞和胎盘细胞(WUrfel J.等，Gene 2001，262:35-41)，使之成为肿瘤疗法的理想靶标。W001/23553提出将降低或抑制C4. 4a表达或活性的C4. 4a抑制剂(例如抗C4. 4a抗体)用于治疗癌症。C4. a的确切功能未知；然而，它在伤口愈合的迁移性角质形成细胞中被上调(Hansen L.等，Biochem J. 2004，380:845-857)。根据与 uPAR 的转移关联性和结构同源性，提出了该分子可能通过与胞外基质的相互作用而参与肿瘤细胞侵袭OteselM.等，Oncogene 1998,17 (15) : 1989-2002 ；Paret C.等，British Journal of Cancer2007,97:1146-1156)。潜在配体是层粘连蛋白I和5、半乳凝素3 (Paret C., Int. J.Cancer 2005，115:724-733)以及 agr2 和 agr3 (Fletcher GC. , Brit. J. Cancer 2003，88:579-585)。用于免疫毒素癌症疗法临床结果的异种移植物鼠癌症模型的预测值常受缺乏治疗性抗体与其鼠直向同源物的交叉反应性的限制，这导致与正常组织的非特异性结合降低。另一方面，在用鼠抗体或嵌合抗体治疗的患者中形成的中和抗小鼠Fv抗体可引起剂量限制性毒性或治疗效力降低。因此，为了充分开发癌症治疗中特异性C4. 4a表达的潜力，需要这样的靶向抗体，其兼具以下优势与完全人或人源化抗体形式的高亲和力C4. 4a结合且具有鼠交叉反应性。新抗体的其它必要特征是与表达C4. 4a的不同癌细胞系的表面结合的高亲和力。在肿瘤细胞中，C4. 4a是差异糖基化的(Paret C.等，British Journal of Cancer 200797:1146-1156)。因此，有效的抗C4. 4a抗体必须独立于个体差异(包括但不限于糖基化模式的差异)而与不同患者的肿瘤细胞呈递的表位结合，这导致不同形式的C4. 4a的表达。本文提供这样的抗体、其抗原结合抗体片段或其变体，其以高亲和力与C4. 4a结合、有效内化且优选与另一物种的C4. 4a交叉反应。还提供用于癌症、特别是用于表达C4. 4a的肿瘤的基于抗体的疗法，所述肿瘤例如乳腺癌、消化道癌、脑癌、生殖器官癌、消化道癌、泌尿道癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头颈癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌及其远处转移，还包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。这些疗法使用有利于将治疗活性剂递送给癌细胞的抗体、其抗原结合抗体片段或其变体。发明概述
本发明的目的是提供这样的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体，其对患者血清中细胞表面上GPI锚定的C4. 4a多肽或对通过除去GPI部分而可溶的C4. 4a多肽有高度选择性，且其可用于检测与以下疾病状态有关的C4. 4a表达的方法和用于治疗这类疾病状态例如肺癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、肾癌、头颈癌或黑素瘤。为此，本发明的目的是提供与C4. 4a表位特异性结合的分离的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段，所述C4. 4a表位存在于不同形式的278个氨基酸的成熟人C4. 4a多肽(SEQ ID I)中，其通过表达C4. 4a的癌细胞系呈递，和/或其被这些抗体以高亲和力结合。本文所用的C4. 4a的不同‘形式’包括但不限于不同的糖形、不同的同工型或进行不同的翻译和翻译后修饰的C4. 4a多肽。本发明的另一个目的是提供对于人给药是安全的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的另一个目的是提供与人C4. 4a结合且对另一物种的C4. 4a有交叉反应性的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。优选所述其它物种是啮齿动物，例如小鼠或大鼠。最优选抗体或其抗原结合抗体片段或其变体与人C4. 4a结合并与鼠C4. 4a交叉反应。
本发明的另一个目的是提供与大范围的不同的表达C4. 4a的细胞系结合的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的另一个目的是提供抗体或其变体，其与不同的表达C4. 4a的癌细胞或肿瘤细胞结合，并且通过使用一种或多种本发明的抗体或其变体引发针对表达C4. 4a的癌细胞的免疫效应子活性(例如ADCC或OTC)。本发明的另一个目的是提供在与表达C4. 4a的细胞结合后被有效内化的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。本发明的抗体可与已知的药物共同给予，在一些情况下，抗体自身可被修饰。例如，抗体可与细胞毒性剂、免疫毒素、毒簇或放射性同位素缀合以潜在地进一步提闻功效。本发明的另一个目的是提供这样的抗体，其为用于诊断恶性病况或发育异常病况的工具，与正常组织相比在所述病况中C4. 4a表达提高或在所述病况中C4. 4a从细胞表面上脱落且在血清中可检出。提供了与可检测标记缀合的抗C4. 4a抗体。优选的标记为放射性标记、酶、生色团或荧光剂。
本发明还涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞、用于产生本发明的抗体或其抗原结合片段的方法、使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于抑制发育异常细胞的生长的方法以及使用本发明的抗体或其抗原结合片段用于治疗和检测癌症的方法。本发明提供区别于现有C4. 4a抗体的抗体(Paret C.等，British Journal ofCancer 2007 97:1146-1156)，因为它们a)与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4. 4a结合，优选与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4. 4a的结构域SI结合，b)与鼠C4.4a交叉反应，和c)有效内化到表达C4. 4a的细胞中。本文更完整地描述了本发明的这些目标和其它目标。一方面，本发明提供这样的分离抗体或其含有抗原结合区的抗原结合片段，其与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4. 4a特异性结合,优选与天然的细胞表面表达的和完全糖基化的C4. 4a多肽的结构域SI (C4. 4a的氨基酸1_85 ；SEQ ID NO: I)特异性结合。在另一个实施方案中，在抗体或抗原结合片段与前述细胞结合时，所述抗体或抗原结合片段被内化到表达C4. 4a的细胞中。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人和啮齿动物C4. 4a，又一个优选的实施方案是其中啮齿动物C4. 4a为小鼠C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:5 (H-CDRl)、SEQ ID NO:9(H-CDR2)和 SEQ ID NO: 13 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 17 (L-CDRl),SEQ ID NO:21 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:25 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID N0:6 (H-CDRl) ,SEQ ID NO: 10(H-CDR2)和 SEQ ID NO: 14 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 18 (L-CDRl),SEQ ID NO:22 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:26 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO: 7 (H-CDRl)、SEQ ID NO: 11(H-CDR2)和 SEQ ID NO: 15 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 19 (L-CDR1)、SEQ ID NO:23 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:27 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID N0:8 (H-CDRl) ,SEQ ID NO: 12(H-CDR2)和 SEQ ID NO: 16 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:20 (L-CDR1)、SEQ ID NO:24 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:28 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:45 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO:46 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:47 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:48(L-CDRl)、SEQ ID NO:49 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:50 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:55 (H-⑶Rl)、SEQ ID NO:56 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:57 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:58(L-CDRl)、SEQ ID NO:59 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:60 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:65 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO:66 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:67 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:68(L-CDRl)、SEQ ID NO:69 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:70 (L-CDR3)。在另外更优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:75 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO:76 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:77 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:78(L-CDRl)、SEQ ID NO:79 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:80 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:85 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO:86 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:87 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:88(L-CDRl)、SEQ ID NO:89 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:90 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO:95 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO:96 (H-CDR2)和 SEQ ID NO:97 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO:98(L-CDRl)、SEQ ID NO:99 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:100 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO: 105 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO: 106 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 107 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 108(L-CDRl)、SEQ ID NO:109 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:110 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO: 115 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO: 116 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 117 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 118(L-CDRl)、SEQ ID NO:119 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:120 (L-CDR3)。
在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO: 125 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO: 126 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 127 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 128(L-CDRl)、SEQ ID NO:129 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:130 (L-CDR3)。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链抗原结合区并包含轻链抗原结合区，所述重链抗原结合区包含SEQ ID NO: 135 (H-⑶Rl)、SEQ IDNO: 136 (H-CDR2)和 SEQ ID NO: 137 (H-CDR3)，所述轻链抗原结合区包含 SEQ ID NO: 138(L-CDRl)、SEQ ID NO:139 (L-CDR2)和 SEQ ID NO:140 (L-CDR3)。本发明的抗体可以是IgG (例如IgG1' IgG2, IgG3、IgG4)，而抗体片段可以是例如Fab、Fab’、F(ab’ )2或scFv。因此，本发明的抗体片段可以是或可含有以本文所述的一种或多种方式起作用的抗原结合区。
本发明还涉及分离的核酸序列，其每一种可编码对C4. 4a的表位有特异性的前述抗体或其抗原结合片段。本发明的核酸适于抗体或抗原结合抗体片段的重组产生。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。本发明的组合物可用于治疗性或预防性应用。因此，本发明包括包含本发明抗体(或其抗原结合片段)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在相关方面，本发明提供用于治疗与不希望存在的表达C4. 4a的细胞有关的病症或病况的方法。在优选的实施方案中，所述病症是癌症。该方法包括将有效量的含有本文所描述或预期的本发明抗体的药物组合物给予有此需要的受试者的步骤。本发明还提供使用抗体文库以分离与C4. 4a特异性结合的这种文库的一个或多个成员的说明书。附图
简述
图I表不米用夹心表面等离振子共振分析(sandwich surface plasmon resonanceanalysis)进行的表位分型实验的结果。Y是共振单位，X是时间(秒)。将本发明的抗体之一包覆在芯片上。A表不加入C4. 4a的时间。B表不加入本发明的其它抗体的时间。两种抗体不能与C4. 4a同时结合，这就表示至少有重叠表位。图2提供有关本发明的抗C4. 4a抗体与重组人(a)和呈人IgGl形式的小鼠(b)C4. 4a结合的数据。EC5tl值通过实施例4中描述的ELISA测定。M31-B01 (A)与人和鼠C4. 4a结合的EC5tl分别为O. 24和O. 29 nM。M20 B02 S-A (B)与人和鼠C4. 4a结合的EC5tl分别为
O.3 和 O. 38 nM。X 为 log nM ；Y 为 360 nm 下的消光值(Extinction)。图3提供有关本发明的抗体与用以下hC4. 4a转染的不同肿瘤细胞系特异性结合的数据如A549:hC4. 4a (a)或天然表达C4. 4a的肿瘤细胞系如NCI H322 (b)、NCI H292(c) ；H1975/BCRP (d)或 BxPC3 (e)。将 M31-B01 (空心圆)和 M20-D02 S-A (实心圆)结合的EC5tl值概括于(f)中。IgGl同种型对照(实心三角形)与细胞没有任何结合。所有数据通过FACS滴定法产生。X为浓度(log nM)，Y为几何平均荧光(xlO3)。图4(a)提供有关荧光团标记的抗C4. 4a抗体特异性内化至A549:hC4. 4a细胞内的数据。图4 (b)提供有关非转染的A549细胞作为阴性对照的数据。A为M31-B01 (实心矩形)；B为M20-D02 S-A (空心矩形)；C为hlgGl的同种型对照(星号)；X为时间(分钟)，Y为颗粒计数/细胞[*103]。两种C4. 4a抗体被特异性、有效并快速内化至携带C4. 4a的肿瘤细胞中。图4(c)和(d)提供有关M31-B01内化至A549:hC4. 4a细胞内的数据。5分钟后(c)，仅可观察到细胞表面的弱染色。90分钟后(d)，强烈着色的含有内化M31-B01抗体(其携带PH依赖性荧光染料)的内体清晰可见，表明有效内化。图5提供有关通过蛋白质印迹法测定的表位M31-B01和M20-D02 S-A所结合的数据。A)表示不同C4. 4a种类经考马斯250染色的SDS-PAGE (泳道2+7 hC4. 4a，泳道3+8mC4. 4a,泳道 4+9 hC4. 4a 结构域 Sl-Fc_his6，泳道 5+10 hC4. 4a 结构域 S2-Fc_his6 ;泳道
1、6和11含有分子量标记；泳道2-5含有未还原的样品；泳道6-10含有还原样品)。B)和C)表示具有与A)相同的样品加载的各个蛋白质印迹。B)与M31-BOI—起孵育而C)与M20-D02 S-A —起孵育作为检测抗体。两种抗体显示特异性还原依赖性染色，这表明构象表位。然而，两种抗体与人和小鼠全长C4. 4a及与人C4. 4a结构域SI结合，但不与人C4. 4a结构域S2结合。
图6提供有关通过用xCELLigence分析仪测量确定的本发明抗体(B01-3)体外抑制肿瘤细胞增殖的数据。在实施例15描述的条件下，将A549:hC4. 4a细胞与100 nM未结合的hlgGl同种型对照抗体(A)或100 nM B01-3 (B)在E板(E-plate)单个孔中共孵育所规定的时间。X为时间(小时)，Y为细胞增殖的相对速率。与对照IgGl相比，与B01-3孵育的A549:hC4. 4a细胞的细胞增殖降低。图7表示本发明的序列。发明详述
本发明基于对C4. 4a具有特异性或对C4. 4a具有高亲和力并可向受试者递送治疗益处的新抗体的发现。本发明抗体(其可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)可用于本文将更全面描述的许多情况中。定义
“人”抗体或其抗原结合片段在本文定义为不是嵌合的(例如非“人源化的”)且并非来自(完全或部分)非人物种的抗体或其抗原结合片段。人抗体或其抗原结合片段可来源于人或可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在本文定义为具有完全或部分来源于经由计算机模拟的(in si I i co)合成序列的序列的抗体,所述合成抗体基于对已知人抗体序列的分析。可通过例如分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从中获得的数据设计多肽序列，来实现人抗体序列或其片段的经由计算机模拟的设计。人抗体或其抗原结合片段的另一个实例是由自人源的抗体序列文库分离的核酸编码的人抗体或其抗原结合片段(例如该文库基于取自人天然来源的抗体)。人抗体的实例包括如SSderlind等，NatureBiotech. 2000, 18:853-856 中描述的抗体。“人源化抗体”或其人源化抗原结合片段在本文定义为如下的人源化抗体或其人源化抗原结合片段(i)来源于非人来源(例如携带异种免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列；(ii)其中非人抗体的构架区的氨基酸通过遗传工程改造部分转换为人氨基酸序列，或(iii) CDR移植的，其中可变结构域的CDR来自非人源，而可变结构域的一个或多个构架是人源的，且恒定结构域(如有的话)是人源的。“嵌合抗体”或其抗原结合片段在本文中定义为这样的嵌合抗体或其抗原结合片段，其中可变结构域来源于非人源，且一些或所有恒定结构域来源于人源。
本文所用术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即除可存在的少量可能突变(例如天然存在的突变)以外，包含该群的各个抗体是相同的。因此，术语“单克隆”表示不是无关抗体的混合物的抗体特征。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的各个单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。除其特异性以外，单克隆抗体制备物是有利的，因为它们通常未被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。术语单克隆抗体特别地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。本文所用抗体与目标抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标(在这里为C4. 4a)) “特异性结合”、对目标抗原“具有特异性”或“特异性识别”目标抗原，是以足够的亲和力与抗原结合的抗体，使得抗体可在靶向表达抗原的细胞或组织中用作治疗剂且不与其它蛋白质进行显著的交叉反应或不与前述抗原靶标的直向同源物(ortholog)和变体(例如突变体、剪接变体或蛋白水解截短形式)以外的蛋白质进行显著的交叉反应。可通过例如对抗原的一价Kd为以下的抗体或其抗原结合片段来表示本文所用术语“特异性识别”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上表位或者对特定多肽或特定多肽靶标上的表位“具有特异性”小于约1(Γ4 Μ、或者小于约I(T5 Μ、或者小于约I(T6 Μ、或者小于约I(T7 Μ、或者小于约I(T8 Μ、或者小于约10_9 Μ、或者小于约10, Μ、或者小于约10_η Μ、或者小于约10_12 M或更小。如果抗体能够将抗原与一种或多种参比抗原区别开来，则该抗体与该抗原“特异性结合”、对抗原“具有特异性”或“特异性识别”抗原。在其最普遍的形式中，“特异性结合”、“与……特异性结合”、“对……具有特异性”或“特异性识别”是指按照例如下列方法之一测定的抗体区别目标抗原与无关抗原的能力。所述方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA试验、RIA试验、ECL试验、IRMA试验和肽扫描。例如，可进行标准ELISA测定。可通过标准显色反应(例如第二抗体与辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺与过氧化氢)进行评分。在某些孔中的反应通过例如450 nm下的光密度来评分。典型背景(=阴性反应)可为O. I OD ;典型阳性反应可为I 0D。这意味着阳性/阴性的差异超过5倍、10倍、50倍并优选超过100倍。通常不使用单一参比抗原，而是约3-5个无关抗原的组，例如奶粉、BSA、运铁蛋白等，来进行结合特异性的测定。“结合亲和力”是指分子的单个结合部位与其结合配偶体之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则本文所用“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。解离常数“KD”通常用来描述分子(例如抗体)与其结合配偶体(例如抗原)之间的亲和力，即配体如何紧密地与特定蛋白质结合。配体-蛋白质亲和力受两个分子之间非共价分子间相互作用的影响。亲和力可通过本领域已知的常用方法、包括本文描述的方法测量。在一个实施方案中，采用实施例3的Biacore TlOO仪器(GE Healthcare Biacore, Inc.),通过表面等离振子共振测定法测量本发明的“KD”或“KD值”。简单地说，通过间接俘获试剂抗人IgG Fe，将抗体固定在CM5传感器芯片上。按照生产商所述，使用“人抗体俘获试剂盒(Human Antibody Capture Kit)”(BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.)的试剂。每细胞固定约 5000 共振单位(RU)单克隆小鼠抗人IgG (Fe)抗体。注入抗C4. 4抗体以达到约200-600 RU的俘获水平。在整个固定的抗C4. 4a抗体上注入各种浓度的人或鼠C4. 4a。线内参比细胞校正接着减去缓冲液样品后，生成传感图(Sensogram)。根据应用Biacore评价软件将传感图与一级I: I结合模型拟合得到的缔合(kj与解离速率Gwf)常数的比率，计算解离平衡常数(Kd)。其它合适的装置为 BIACORE (R)-2000、BIACORE (R) -3000 (BIAcore, Inc. , Piscataway, NJ)或 ProteOn XPR36 仪器(Bio-Rad Laboratories, Inc·)。本文所用术语“抗体”意欲指免疫球蛋白分子，其优选由4条多肽链，即2条重(H)链和2条轻(L)链(其通常通过二硫键相互连接)组成。每条重链由重链可变区(本文简写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区可包含例如3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链由轻链可变区(本文简写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由I个结构域(CL)组成。可将VH和VL区进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL通常由3个⑶R和至多4个FR组成。按例如下列顺序自氨基端向羧基端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文所用术语“互补决定区(CDR ;例如⑶R1、⑶R2和⑶R3)是指抗体可变结构域的氨基酸残基，其存在是抗原结合所必需的。每个可变结构域通常具有3个CDR区，被称为⑶R1XDR2和⑶R3。每个互补决定区可包含来自由Kabat限定的“互补决定区”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的大致残基24-34 (LI),50-56 (L2)和89-97 (L3)和重链可变结构域中的 31-35 (Hl) ,50-65 (H2)和95-102 (H3) (Kabat 等，Sequences of Proteinsof Immulological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutesof Health, Bethesda, MD. (1991))和/或来自“高变环”的残基(例如轻链可变结构域中的大致残基26-32 (LI),50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变结构域中的26-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3) (Chothia 和 Lesk J Mol Biol 196:901-917 (1987))。在一些情况下，互补决定区可包括来自由Kabat限定的⑶R区和高变环两者的氨基酸。可根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，将完整抗体分为不同的“类别”。有5个主要的完整抗体类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几种可进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为[α]、[S]、[ε]、[Y]和[μ]。不同免疫球蛋白类型的亚基结构和三维构型是众所周知的。本文所用抗体按惯例称为抗体及其功能片段。本文抗体/免疫球蛋白的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为保留抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，例如⑶RU⑶R2和/或⑶R3区；然而，可变“构架”区也可通过例如提供用于⑶R的支架，而在抗原结合中起重要作用。优选“抗原结合区”包含可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的5-109，更优选VL的氨基酸残基3-107和VH的4-111，特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸1-109位和VH的1-113 ;按照TO 97/08320编号)。用于本发明的优选的免疫球蛋白类别是IgG。本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；单结构域抗体(DAb)、线性抗体；单链抗体分子(scFv)和由抗体片段形成的多特异性(例如二特异性和三特异性)抗体(C. A. K Borrebaeck主编(1995) AntibodyEngineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press ；R.Kontermann 和 S. Duebel 主编(2001) Antibody Engineering (Springer LaboratoryManual), Springer Verlag)。非“多特异性”或“多功能性”抗体的抗体要理解为其各个结合部位相同。可对F(ab’)2或Fab进行工程改造以使在Cm和Q结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用降到最低或完全除去。本发明的抗体可来源于重组抗体文库，其基于自大量健康志愿者的抗体中分离的氨基酸序列。采用n-CoDeR 技术，将完全人CDR重组至新的抗体分子中。独特的重组方法允许文库含有比可通过人免疫系统天然产生的抗体更多种多样的抗体。本文所用的抗原(例如C4. 4a)的不同“形式”，在本文定义为来自不同的翻译和翻译后修饰的不同蛋白质分子，例如但不限于C4. 4a初级转录物的剪接差异、糖基化差异和翻译后蛋白酶剪切的差异。本文所用术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定子。表位决定子通常由化学活性表面分型的分子(例如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特性。如果通过本领域技术人员熟知的任何方法，一种抗体在竞争结合测定中显示与第二抗体竞争，则认为两种抗体“结合相同表位”。
“分离的”抗体是已经鉴定并且从表达该抗体的细胞组分中分离出来的抗体。细胞的污染物组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素和其它蛋白质性或非蛋白质性溶质。在优选的实施方案中抗体被纯化(I)至大于抗体重量的95%，在又一个优选的实施方案中，大于99%重量，这例如通过Lowry方法、UV-Vis光谱法或通过SDS毛细管凝胶电泳(例如在Caliper LabChip GXII>GX 90或Biorad Bioanalyzer装置上)测定，被纯化(2)至足以得到N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染色，通过SDS-PAGE被纯化至同质性。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离的抗体通�？赏ü辽僖桓龃炕街柚票�。“依赖抗体的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中存在于某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)中的与Fe Y受体(FcyR)结合的分泌Ig使这些细胞毒性效应子细胞能够与携带抗原的靶细胞特异性结合，随后用例如细胞毒素杀死靶细胞。为了评价目标抗体的ADCC活性，可进行例如美国专利号5，500，362或5，821，337或美国专利号6，737，056 (Presta)描述的体外ADCC测定法。对于这类测定法有用的效应子细胞包括PBMC和NK细胞。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。通过补体系统的第一组分(Clq)与抗体(合适亚类的抗体)结合启动经典补体途径的活化，所述抗体与其同族抗原(cognate antigen)结合。为了评价补体活化,可按例如Gazzano-Santoro等，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)中所述，进行CDC测定。在例如美国专利号6，194，551 BI和WO 1999/51642中，描述了 Fe区氨基酸序列改变(具有变体Fe区的多肽)且Clq结合增加或降低的多肽变体。术语免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)是指与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗体，例如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素、细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。免疫缀合物在癌症治疗中用于局部递送细胞毒性剂，即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物(例如 Liu 等，Proc Natl. Acad. Sci. (1996)，93，8618-8623))。免疫缀合物允许将药物部分定向递送至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，其中全身给予未缀合的药物可导致对正常细胞和/或组织的不可接受的毒性水平。用于抗体-毒素缀合物的毒素包括细菌毒素例如白喉毒素、植物毒素例如蓖麻毒蛋白、小分子分子毒素例如格尔德霉素。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性作用。有关参比多核苷酸或多肽序列的“百分比(%)序列同一性”分别定义为在比对序列和引入缺口(必要时)以达到最大百分比序列同一性后，分别与参比多核苷酸或多肽序列的核酸或氨基酸残基分别相同的候选序列的核酸或氨基酸残基分别的百分比。保守取代不视为序列同一性的部分。优选为无缺口的比对。为了确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可用本领域技术范围内的各种方式实现，例如，应用可公开获取的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的合适参数，包括在待比较序列全长内达到最大比对所需要的任何算法。本发明的抗体
本发明涉及通过提供抗C4. 4a抗体来抑制C4. 4a阳性癌细胞生长和肿瘤性疾病进程的方法。提供了与29 kDa人C4. 4a多肽(SEQ ID NO: I或其片段)特异性结合的抗体、其抗原结合抗体片段及该抗体和片段的变体。在优选实施方案中，所述抗体、其抗原结合片段或变体与C4. 4a多肽的胞外域SI特异性结合。C4. 4a多肽在本文中称为‘C4. 4a’。在另一个实施方案中，在抗体或其抗原结合片段与表达C4. 4a的细胞结合时，所述抗体或其抗原结合片段被内化到前述细胞中。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合人和啮齿动物C4. 4a，又一个优选的实施方案是其中啮齿动物C4. 4a为小鼠C4. 4a。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7所述的至少一个(优选相应的)CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链或轻链CDR序列，或者其包含分别与表7所述VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性的可变重链或轻链序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-BOI或M20-D02 S-A的至少一个(优选相应的)CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链和/或轻链⑶R序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-BOI或M20-D02 S-A的(优选相应的)重链和/或轻链CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链和/或轻链⑶R序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与重链CDR2和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的重链CDR2和CDR3序列及与抗体 M31-B01 的轻链 CDRl 和 CDR3 序列有至少 50%、55%、60%、70%、80%、90% 或 95% 同一1注的轻链CDRl和CDR3序列。在更优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与重链 CDR2 和 CDR3 序列有至少 50%、55%、60%、70%、80%、90% 或 95% 同一性的重链 CDR2 和 CDR3序列及与抗体M20-D02 S-A的轻链CDRl和CDR3序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性的轻链⑶Rl和⑶R3序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7或表4中公开的优选抗体] 31-801或120-002 S-A 的 VH 序列有至少 50%、60%、70%、80%、90%、92% 或 95%同一性的可变重链序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表7或表3中公开的优选抗体M31-BOI或M20-D02 S-A的VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%,92%或95%同一性的可变轻链序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含分别与抗体M31-BOI 或 M20-D02 S-A 的 VH 和 VL 序列有至少 50%、60%、70%、80%、90%、92% 或 95% 同一性
的可变重链和轻链序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含与表15所述的M31-BOI或M20-D02 S-A来源的(优选相应的)⑶R共有序列一致的重链和轻链⑶R序列。又一个优选的实施方案是这样抗体或其抗原结合片段，其包含与由共有序列SEQ ID NO:297 (CDR HI)、SEQ ID NO: 298 (CDR H2)和 SEQ ID NO: 299 (CDR H3)表示的相应重链CDR序列一致的重链CDR序列和与由共有序列SEQ ID NO: 300 (CDR LI)、SEQ ID NO: 22(CDR L2)和SEQ ID NO: 301 (CDR L3)表示的相应轻链CDR序列一致的轻链CDR序列，或者包含与由共有序列 SEQ ID NO: 302 (CDR HI) ,SEQ ID NO: 303 (CDR H2)和 SEQ ID NO:
304(CDR H3)表示的相应重链⑶R序列一致的重链⑶R序列和与由共有序列SEQ ID NO:
305(CDR LI)、SEQ ID NO: 306 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 307 (CDR L3)表示的相应轻链⑶R序列一致的轻链⑶R序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4中公开的或者优选表7或表3和表4所述抗体的至少一个(优选相应的)重链和/或轻链CDR序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4中公开的或者优选表7或表3和表4所述抗体的至少I个、2个、3个、4个、5个或6个(优选相应的)重链和轻链CDR序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链⑶R1XDR2或⑶R3序列、表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链⑶Rl和⑶R2序列、表7或表3和表4所述抗体的重链或轻链⑶Rl和⑶R3序列、表或表3和表4所述抗体的重链或轻链⑶R2和⑶R3序列、表或表3和表4所述抗体的重链或轻链⑶R1XDR2和⑶R3序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链⑶R序列⑶Rl和⑶R2及轻链CDR序列CDR1、CDR2、CDR3。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链⑶R1、⑶R2或⑶R3序列；表或表3和表4所述抗体的重链和轻链CDRl和CDR2序列；表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链⑶Rl和⑶R3 ;表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链⑶R2和⑶R3序列；表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链⑶R1XDR2和⑶R3序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的重链和轻链⑶R序列。在又一个实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4公开的VH和/或VL序列。在又一个优选的实施方案中，所述抗体或抗原结合抗体片段包含表7或表3和表4所述抗体的VH和VL序列。在优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是单克隆的。在又一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合抗体片段是人的、人源化的或嵌合的。本发明中预期的抗体或抗原结合抗体片段的变体是其中保持抗体或抗原结合抗体片段对C4. 4a的结合活性的分子。在优选的实施方案中，所述变体与表7所述抗体、优选与抗体M31-B01或M20-D02 S-A竞争结合C4. 4a。在本文件全文中，提及下列优选的本发明抗体“M31-B01”、“M20-D02 S_A”、“M60-G03” 和 “M36-H02，，、“B01-3，，、“B01-5，，、“B01-7，，、“B01-10，，、“B01-12，，、“D02-4，，、“D02-6，，、“D02-7，，、“D02-11，，和 “D02-13”。M31-B01 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 41 (DNA)/SEQ ID NO: 33(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 37 (DNA)/SEQ ID NO: 29 (蛋白质)的可变轻链区。M20-D02 S-A 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 42 (DNA) /SEQ ID NO:34 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 38 (DNA) /SEQ ID NO: 30 (蛋白质)的可变轻链区。
M60-DG03 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 43 (DNA)/SEQ ID NO: 35(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 39 (DNA)/SEQ ID NO: 31 (蛋白质)的可变轻链区。M36-H02 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 44 (DNA)/SEQ ID NO: 36(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 40 (DNA)/SEQ ID NO: 32 (蛋白质)的可变轻链区。B01-3表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 53 (DNA)/SEQ ID NO: 51 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 54 (DNA) /SEQ ID NO: 52 (蛋白质)的可变轻链区。B01-5表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 63 (DNA)/SEQ ID NO: 61 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 64 (DNA) /SEQ ID NO: 62 (蛋白质)的可变轻链区。B01-7表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 73 (DNA)/SEQ ID NO: 71 (蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 74 (DNA) /SEQ ID NO: 72 (蛋白质)的可变轻链区。B01-10表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 83 (DNA)/SEQ ID NO: 81(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 84 (DNA)/SEQ ID NO: 82 (蛋白质)的可变轻链区。B01-12表示这样的抗体，其包含对应于SEQ ID NO: 93 (DNA)/SEQ ID NO: 91(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 94 (DNA)/SEQ ID NO: 92 (蛋白质)的可变轻链区。D02-4 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 103 (DNA) /SEQ ID NO: 101(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 104 (DNA)/SEQ ID NO: 102 (蛋白质)的
可变轻链区。D02-6 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 113 (DNA)/SEQ ID NO: 111(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 114 (DNA)/SEQ ID NO: 112 (蛋白质)的可变轻链区。D02-7 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 123 (DNA)/SEQ ID NO: 121(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 124 (DNA)/SEQ ID NO: 122 (蛋白质)的可变轻链区。D02-11 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 133 (DNA)/SEQ ID NO: 131(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 134 (DNA)/SEQ ID NO: 132 (蛋白质)的可变轻链区。D02-13 表示这样的抗体，其包含对应于 SEQ ID NO: 143 (DNA)/SEQ ID NO: 141(蛋白质)的可变重链区和对应于SEQ ID NO: 144 (DNA)/SEQ ID NO: 142 (蛋白质)的可变轻链区。另一方面，本发明提供具有与C4. 4a的一个或多个区特异性结合和/或对C4. 4a的一个或多个区有高亲和力的抗原结合区的抗体或抗原结合片段，其氨基酸序列由SEQ IDNO: I描述。如果亲和力测量结果小于250 nM (抗体或抗原结合片段的一价亲和力)，则认为抗体或抗原结合片段对抗原有“高亲和力”。本发明的抗体或抗原结合区优选可与人C4. 4a结合，其作为对人C4. 4a的一价亲和力而测定的亲和力小于250 nM、优选小于100nM、更优选小于25 nM、甚至更优选小于11 nM。例如,本发明抗体对于C4. 4a的亲和力可为约220. O nM或I nM (抗体或抗原结合片段的一价亲和力)。表I提供通过表面等离振子共振(Biacore)在直接固定的人或鼠C4. 4a上测定的本发明代表性抗体的解离常数一览表。表I :通过表面等离振子共振测定的抗C4. 4a IgGl的一价解离常数
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IgGl形式用于通过与Scatchard分析结合的突光激活细胞分选术(FACS)的基于细胞的亲和力测定。图3f)表示转染的表达C4. 4a的A549肿瘤细胞和内源性表达C4. 4a的肿瘤细胞中代表性IgG抗体的结合强度。表8提供转染的鼠CH0-S:mC4. 4a细胞和内源性表达C4. 4a的NCI H292肿瘤细胞中代表性IgG抗体的结合强度(EC5tl) —览表。表8 :通过FACS测定的抗C4. 4a IgGl的EC5tl值
权利要求
1.分离的抗体或其抗原结合片段，其与C4.4a的结构域SI特异性结合。
2.权利要求I的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与啮齿动物C4. 4a交叉反应。
3.权利要求I或2的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在与表达C4. 4a的细胞结合后被内化。
4.权利要求1-3中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与抗体 M31-B01 或 M20-D02 S-A 竞争结合 C4. 4a。
5.权利要求4的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与表7中所述至少一个CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、 90%或95%同一性，或者与表7所述至少一个VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%同一性。
6.权利要求4-5中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的氨基酸序列与M31-BOI或M20-D02 S-A的至少一个CDR序列有至少50%、55%、60%、70%、80%、90%或95%同一性，或者与M31-B01或M20-D02 S-A的VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92% 或 95% 同一性。
7.权利要求4-6中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含与共有序列 SEQ ID NO: 297 或 SEQ ID NO: 302 (CDR HI)、SEQ ID NO: 298 或 SEQ IDNO: 303 (CDR H2)或者 SEQ ID NO: 299 或 SEQ ID NO: 304 (CDR H3) 一致的至少一个重链 CDR 序列，和 / 或与 SEQ ID NO: 300 或 SEQ ID NO: 305 (CDR LI)、SEQ ID NO: 22 或SEQ ID NO: 306 (CDR L2)或者SEQ ID NO: 301 或SEQ ID NO: 307 (CDR L3)的共有序列一致的至少一个轻链⑶R序列。
8.权利要求4-7中任一项的抗体或抗原结合片段， a)其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQID NO: 297 (⑶R HI)、SEQ ID NO:298 (CDR H2)和SEQ ID NO: 299 (CDR H3)—致的重链CDR序列及与SEQ ID NO: 300 (CDRLI)、SEQ ID NO: 22 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 301 (CDR L3) 一致的轻链 CDR 序列，或者 b)其中所述抗体或其抗原结合片段包含与SEQID NO: 302 (⑶R HI)、SEQ ID NO:303 (CDR H2)和SEQ ID NO: 304 (CDR H3)—致的重链CDR序列及与SEQ ID NO: 305 (CDRLI)、SEQ ID NO: 306 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 307 (CDR L3) 一致的轻链 CDR 序列。
9.权利要求4-8的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表7中所述的至少一个⑶R序列或至少一个可变重链或轻链序列。
10.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含表7的抗体的重链和轻链CDR序列或可变重链和轻链序列。
11.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含 SEQ ID NO: 75-77所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 78-80所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 5、9和13所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 17、21和25所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 6、10和14所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 18、22和26所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 7、11和15所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 19、23和27所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 8、12和16所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 20、24和28所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 45-47所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 48-50所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 55-57所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 58-60所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 65-67所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 68-70所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 85-87所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 88-90所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 95-97所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 98-100所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 105-107所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 108-110所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 115-117所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 118-120所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 125-127所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 128-130所示可变轻链CDR序列，或者 SEQ ID NO: 135-137所示可变重链CDR序列和SEQ ID NO: 138-140所示可变轻链CDR序列。
12.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其包含 SEQ ID NO: 81所示可变重链序列和SEQ ID NO: 82所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 33所示可变重链序列和SEQ ID NO: 29所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 34所示可变重链序列和SEQ ID NO: 30所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 35所示可变重链序列和SEQ ID NO: 31所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 36所示可变重链序列和SEQ ID NO: 32所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 51所示可变重链序列和SEQ ID NO: 52所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 61所示可变重链序列和SEQ ID NO: 62所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 71所示可变重链序列和SEQ ID NO: 72所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 91所示可变重链序列和SEQ ID NO: 92所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 101所示可变重链序列和SEQ ID NO: 102所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 111所示可变重链序列和SEQ ID NO: 112所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 121所示可变重链序列和SEQ ID NO: 122所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 131所示可变重链序列和SEQ ID NO: 132所示可变轻链序列，或者SEQ ID NO: 141所示可变重链序列和SEQ ID NO: 142所示可变轻链序列。
13.前述权利要求中任一项的抗体，其为IgG抗体。
14.前述权利要求中任一项的抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
15.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或抗原结合片段。
16.前述权利要求中任一项的抗体或抗原结合片段，其为人、人源化或嵌合的抗体或抗原结合片段。
17.抗体药物缀合物，其包含权利要求1-16的抗体或其抗原结合片段。
18.分离的核酸序列，其编码权利要求1-16的抗体或抗原结合片段。
19.载体,其包含权利要求18的核酸序列。
20.分离的细胞，其表达权利要求1-16中任一项的抗体或抗原结合片段，和/或包含权利要求18的核酸或权利要求19的载体。
21.权利要求20的分离的细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
22.用于产生权利要求1-16中任一项的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括培养权利要求21的细胞并纯化所述抗体或抗原结合片段。
23.权利要求1-16的抗体或抗原结合片段或者权利要求17的抗体-药物缀合物，其作为药物。
24.权利要求1-16的抗体或抗原结合片段，其作为诊断剂。
25.权利要求1-16的抗体或抗原结合片段或者权利要求17的抗体-药物缀合物，其作为用于治疗癌症的药物。
26.药物组合物，其包含权利要求1-16的抗体或抗原结合片段或者权利要求17的抗体-药物缀合物。
27.权利要求26的药物组合物和一种或多种治疗活性化合物的组合。
28.用于治疗与C4.4a的不希望的存在有关的病症或病况的方法，所述方法包括给予有此需要的受试者有效量的权利要求26的药物组合物或权利要求27的组合。
全文摘要
本发明提供重组抗原结合区以及含有所述抗原结合区的抗体和功能片段，其对膜锚定的29kDa的C4.4a多肽具有特异性，所述多肽在若干肿瘤例如肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌和乳腺癌中过量表达。因此，这些抗体可用于治疗这些和其它病症和病况。本发明的抗体还可用于诊断领域，以及用于进一步研究C4.4a在癌症相关病症进程中的作用。本发明还提供编码前述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、药物组合物和附有使用说明书的药盒。
文档编号G01N33/53GK102812047SQ201080063444
公开日2012年12月5日申请日期2010年12月8日优先权日2009年12月9日
发明者L.林登, 曹永江, G.莱德, B.施泰尔特-路德维希, A.哈伦加, R.芬纳恩, F.迪特默, A.迈耶-巴特施密德, J.弗兰茨, S.格雷文, J.维卢达, J.特比申请人:拜耳制药股份公司

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抗C4.4a抗体及其用途的制作方法