专利名称：一种黄曲霉毒素B<sub>1</sub>液相色谱检测用富集方法
技术领域：
本发明属生物检测领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法。
背景技术：
黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的高毒性次生代谢产物。自从I960年的“火鸡事件”开始，人们开始关注黄曲霉毒素，现在发现的黄曲霉毒素(AFT)有十几种，其中以黄曲霉毒素B1最常见、毒性最强。黄曲霉毒素广泛存在于玉米、花生、棉籽、杏仁、无花果等农产品和食品中，加之其污染情况可以发生在产前、产中、产后的多个环节，使得其成为农业产业和食品安全的巨大威胁。为此世界各国建立各种标准对食品和农产品中黄曲霉毒素总量(黄曲霉毒素B:、ByG1和62的总量)和黄曲霉毒素B1的最大允许含量都做了强制性的规定。我国国标GB 2761-2011规定花生及其制品中黄曲霉毒素总量不得超过20 U g/kg，黄曲霉毒素B1含量不得超过5 yg/kg。因此对食品和农产品中黄曲霉毒素检测方法的开发是目前科研人员的研究重点。 现有的黄曲霉毒素检测方法主要有薄层层析法、液相色谱法、酶联免疫法三种。薄层层析法作为传统方法，因为需要操作人员长时间暴露在有机溶剂和毒素中而逐渐被淘汰。酶联免疫分析法作为最新的分析方法，克服了薄层层析法对实验人员伤害大的缺点，且检测快速方便，在过去20年中发展迅速。但是这种方法涉及对温度敏感性强的抗体，且通常一种抗体只能测定一种黄曲霉毒素，在多种黄曲霉毒素待检的情况下，可能存在交叉反应而导致检测结果不准，均制约了该方法的推广和应用。所以，目前最能被大家认可的分析方法还是液相色谱分析法，它具有自动化程度高，定量定性准确，检测种类多元的特点，一直是世界各国官方检测方法。但是，目前针对黄曲霉毒素的高效液相色谱分析法均采用免疫亲和柱来富集毒素，酶联免疫分析法提及的抗体的缺点仍然无法避免，因此研究一种新的黄曲霉毒素B1富集方法以摆脱抗体的缺点，并使其能在黄曲霉毒素B1测中应用，对于监控食品和农产品中的黄曲霉毒素B1很重要的意义和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种在黄曲霉毒素液相色谱检测检测中得以应用的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法。该富集方法可用于黄曲霉毒素B1液相色谱检测时的富集处理，操作简单，快速，结果可靠。本发明为解决上述技术问题采用的技术方案如下
一种黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于它包括以下步骤
(I)黄曲霉毒素B1富集材料的制备
在鳞片石墨中加入硫酸和磷酸组成的混酸及高锰酸钾，进行初步氧化反应，然后通过水解反应形成膨胀的氧化石墨，后用双氧水、盐酸和去离子水依次多次洗涤纯化得到氧化石墨，然后将纯化后的氧化石墨通过高强度的超声解离成单层氧化石墨烯，再经离心选取2000rpm离心30分钟不沉降且在5000rpm离心30min沉降而得到的；(2)将上述制备的黄曲霉毒素B1富集材料加入待测样品的甲醇水溶液中，所述体系中甲醇的含量按体积百分数计最高不超出体系总体积的12. 5%，所述黄曲霉毒素&富集材料的质量与体系总体积比至少要达到O. 625g/mL，室温混合，震荡10_30min以进行黄曲霉毒素&的富集，离心，去掉上清液，然后用甲醇进行洗脱，以将黄曲霉毒素B1富集材料中富集的黄曲霉毒素B1洗脱至甲醇中，得到含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，液相色谱检测备用。
按上述方案，所述步骤(2)的体系在需要时加水进行稀释，以使体系中甲醇含量按体积百分数计最高不超出体系总体积的12. 5% ;所述待测样品的甲醇水溶液用量为4-8mL。
按上述方案，所述步骤(2)中黄曲霉毒素B1富集材料的质量与体系总体积比优选为 O.625-0. 75g/mL。
按上述方案，所述步骤(2)体系中黄曲霉毒素B1的含量应在O. 8-100ng/mL范围内，如超出，可对待测样品的甲醇水溶液进行相应浓缩或稀释处理后再进行富集。
按上述方案，所述步骤(2)中甲醇洗脱步骤为将甲醇加入到富集了黄曲霉毒素B1 的黄曲霉毒素B1富集材料中，混匀，离心，收集上清液，即为含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液。
按上述方案，所述步骤(2)中甲醇洗脱步骤还包括重复洗脱步骤，即在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将得到的上清液和前述上清液合并，得到含黄曲霉毒素 B1的甲醇洗脱液。
按上述方案，所述步骤(2 )还包括将甲醇洗脱液中的甲醇吹至近干后，加入三氟乙酸和正己烷衍生，然后加流动相进行定容，备用。
按上述方案，所述黄曲霉毒素B1富集材料的制备中高锰酸钾与鳞片石墨的质量比优选为6:1 ;硫酸和磷酸的体积比优选为9:1 ;所述的石墨在初步氧化过程中的质量分数优选为O. 709Γ0. 75%，在水解后的最终反应体系中的质量分数优选为O. 39ΓΟ. 375% ;所述的初步氧化反应条件优选为50°C搅拌反应12 48小时。
按上述方案，所述步骤(I)中超声功率为800W或以上，超声时间为Ih或以上。
上述步骤(I)中优选2000rpm离心30分钟不沉降且在5000rpm离心30min沉降进行筛�。纯杀苊饫胄乃俾使投赡苌秆〉玫降难趸┢憧赡芴蠡蛱瘢踔量赡芑购形囱趸耆氖贾缕溆糜诖庋分谢魄苟舅谺1的吸附效果不佳，又可避免离心速率过高而筛选得到的氧化石墨烯片层较�。赡芑岬贾伦詈笸迅绞被魄苟舅谺1 g集材料洗脱不完全。
该黄曲霉毒素B1富集方法黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集的工作原理本发明方法通过大量研究实验，采用合适的黄曲霉毒素B1富集材料，并确定体系中适当的甲醇含量范围，黄曲霉毒素B1富集材料适当的用量和富集时间等参数范围，而达到基于黄曲霉毒素&富集材料具有高比表面积和较好的吸附活性，可以直接吸附黄曲霉毒素，在含有黄曲霉毒素B1的一定含量的甲醇水溶液中较好地富集黄曲霉毒素B1的效果，同时由于黄曲霉毒素B1易溶于甲醇中，利用其在甲醇中溶解性高的特点用甲醇洗脱而将黄曲霉毒素B1从黄曲霉毒素B1富集材料中洗脱下来，达到液相色谱检测用黄曲霉毒素B1富集的目的。
本发明的有益效果(I)本发明提供的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法操作简单，快速，结果可靠， 整个过程仅需30分钟左右/样次。
(2)成本低廉，且可允许操作人员对批量样品同时进行处理，易于推广普及。
(3)其中使用的黄曲霉毒毒素B1富集材料性能稳定。与抗体或免疫亲和柱相比， 其不需要特别的存放条件，富集时也不需要其他特别的仪器辅助操作。
(4)污染少，安全性高。该富集方法所涉及的有机试剂和其他有毒试剂少，大大减 少了对操作人员和环境的污染。
具体实施方式
实施例1黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法中富集条件的确定(I)黄曲霉毒素B1富集材料的制备将3. Og鳞片石墨过325目筛后加入到400 mL硫酸和磷酸体积比为9:1的混和溶液 中，搅拌10分钟，然后在混合物中缓慢加入18. Og高锰酸钾，每次加入量不宜过多，避免反 应温度超过20°C。待高锰酸钾全部加完后，加热到50°C搅拌反应12小时。反应结束后，让 混合物自然冷却到室温，将其倒入IOOmL的冰水中，持续室温搅拌O. 5小时，最后将质量分 数为30%的双氧水逐滴加入反应体系到溶液转变为亮黄色停止。静置过夜，倒掉上清，用 IL质量分数为5%-10%的盐酸洗3遍，然后用IL去离子水洗5遍，以去掉金属离子、硫酸根 离子和氯离子，最后将得到的固体冷冻干燥，然后置于去离子水中，配成I mg/mL的水溶液， 用超声波超声lh，超声功率为800W，待氧化石墨烯解离成单层氧化石墨烯，用离心机2000 rpm离心30分钟，去掉沉淀物，然后将上清液5000 rpm离心30分钟，去掉上清，再将沉淀 50°C干燥，得到富集材料。
为便于使用，一般可在富集材料中加去离子水室温搅拌将其配制成含量为IOmg/ mL的水溶液。
(2)黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法中富集条件的确定通过预设适当长短的富集时间(30min)和体系中适当的甲醇含量(体积百分比为 12. 5%)的条件下，设定不同黄曲霉毒素BI富集材料的用量(2-6mg)，研究黄曲霉毒素&富 集材料的用量范围，具体如下黄曲霉毒素BI富集材料以固体形式或水溶液形式加入均可。考虑到下述黄曲霉毒素 B1富集材料以固体形式加入，其对体系总体积的影响可忽略不计，所以加入黄曲霉毒素B1 富集材料前的黄曲霉毒素B1的甲醇水标准溶液中甲醇的含量即体系中甲醇的含量，同样加 入黄曲霉毒素B1富集材料前的黄曲霉毒素B1的甲醇水标准溶液中黄曲霉毒素BI的含量即 体系中黄曲霉毒素BI的含量。当黄曲霉毒素BI富集材料以水溶液形式加入时，黄曲霉毒 素BI富集材料溶液的体积需计于体系总体积内。
①关于黄曲霉毒素B1富集材料的用量将黄曲霉毒素B1粉末标准品(sigma购买)溶解在甲醇中配成浓度为10 ng/mL的黄曲 霉毒素B1标准液。分别取Iml该标准液，加入7ml纯水，混合得到5份8ml含IOng黄曲 霉毒素B1的甲醇水标准液。然后在这5份含IOng黄曲霉毒素B1的甲醇水标准液中各加 入2mg、3mg、4mg、5mg及6mg黄曲霉毒素BI富集材料，室温混合，震荡30min,8000 rpm离 心30分钟，去掉上清液，加入2ml甲醇，混匀，离心，收集上清液，并在前述离心得到的沉淀 中加入甲醇，混匀，离心，将此次得到的上清液和前述上清液合并，即含黄曲霉毒素B1的甲 醇洗脱液，氮吹、衍生并上机检测黄曲霉毒素B1含量。回收率由测得的黄曲霉毒素B1的实 际值与已知的黄曲霉毒素B1含量值IOng之比求得，具体黄曲霉毒素B1富集材料用量和回 收率的关系如
图1所示。由图1可知当黄曲霉毒素B1富集材料的用量增加到5mg时，回收率达到平台区，即富集材料含量至少要达到5mg。然后具体研究体系中甲醇含量的变化对回收率的影响，实验如下
②关于体系中甲醇的含量
取Iml 10 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准液,加入14ml纯水,混合得到15ml含IOng黄曲霉毒素B1的6. 25%甲醇水标准溶液。取Iml该标准液,加入7ml纯水,混合得到8ml含IOng黄曲霉毒素B1的12. 5%甲醇水标准溶液。取2ml该标准液,加入6ml纯水,混合得到8ml含IOng黄曲霉毒素B1的25%甲醇水标准溶液。取3ml该标准液,加入5ml纯水,混合得到8ml含IOng黄曲霉毒素B1的37. 5%甲醇水标准溶液。取4ml该标准液，加入4ml纯水，混合得到8ml的含IOng黄曲霉毒素B1的50%甲醇水标准溶液。分别在上述5份含黄曲霉毒素B1的不同比例的甲醇水待富集标准液中加入5mg黄曲霉毒素BI富集材料，室温混合，震荡30min，8000 rpm离心30分钟，去掉上清液，加入2ml甲醇，混匀，离心，收集上清液，并在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将此次得到的上清液和前述上清液合并，即含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，然后氮吹、衍生并上机检测黄曲霉毒素含量。回收率由测得的实际值与已知的黄曲霉毒素B1含量值IOng之比求得。黄曲霉毒素B1的甲醇水溶液中甲醇比例和回收率的关系如图2所示。结合图2表明当富集材料为5mg时，待富集液的甲醇含量由50%逐渐低至12. 5%时，回收率达到平台区，则要求待富集黄曲霉毒素B1标准品溶液中的甲醇的含量最高不得超过12. 5%。除此，关于该富集方法的富集时间研究，具体实验如下
③关于富集时间
分别取Iml lOng/mL的黄曲霉毒素B1标准液,加入7ml纯水,混合得到5份8ml含IOng黄曲霉毒素B1的12. 5%甲醇水标准溶液。在上述含黄曲霉毒素B1的甲醇水待富集的标准液中加入5mg黄曲霉毒素BI富集材料，室温混合，分别震荡5min、10min、20min、30min及40min,8000 rpm离心30分钟,去掉上清液,加入2ml甲醇,混勻，离心,收集上清液,并在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将此得到的上清液和前述上清液合并，即含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，氮吹、衍生并上机检测黄曲霉毒素含量。回收率由测得的黄曲霉毒素B1实际值与已知的加标值黄曲霉毒素B1含量值IOng之比求得，具体富集时间和回收率的关系如图3所示。结合图3可知当富集时间达到IOmin时回收率最佳,达到30min之后回收率则达到平台区，即富集最佳时间段为10-30min。在富集条件初步确定后，关于该富集方法可适用的体系中黄曲霉毒素B1含量范围进行了具体研究
④将黄曲霉毒素B1粉末标准品(sigma购买)溶解在甲醇中配成浓度分别为0.8、1、5、10、20、50、100 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准液。各取Iml上述标准液，加入7ml纯水，混合得到8ml含不同量黄曲霉毒素B1的12. 5%甲醇水标准溶液。分别在上述7份含不同量的黄曲霉毒素B1的甲醇水待富集标准液中加入5mg黄曲霉毒素BI富集材料，室温混合，震荡30min,8000 rpm离心30分钟,去掉上清液,加入2ml甲醇,混勻，离心,收集上清液,并在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将此次得到的上清液和前述上清液合并，即含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，然后氮吹、衍生并上机检测黄曲霉毒素含量。回收率由测得的实际值与已知的黄曲霉毒素B1含量值之比求得。黄曲霉毒素B1的甲醇水溶液中甲醇比例和回收率的关系如图4所示。结合图4表明当富集材料为5mg时，待富集液体系中甲醇含量低于12. 5%时，回收率均在80-120%之间。实施例2黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法在加标花生样品黄曲霉毒素B1液相色谱检测中的应用
(1)黄曲霉毒素B1富集材料的制备
采用实施例1所述的方法制备富集材料；
(2)取5g空白花生样品加入一定量IOOML黄曲霉毒素B1标液(531.25 ng/mL浓度的甲醇溶液)，放置半小时，待甲醇挥发干。然后加入15mL 70%甲醇水，涡旋混匀，50°C超声12分钟，定量滤纸过滤，取滤液4mL加入2m L石油醚(沸点60-90°C ),涡旋I分钟,静置分层，取下层甲醇水3m L,加入14mL水,过0. 22Mm有机膜,取8mL滤液与5mg氧化石墨烯室温混合，震荡30min。13000 rpm离心15分钟,弃去上清液,加入2ml甲醇,混勻，离心,收集上清液，并在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将此得到的上清液和前述上清液合并，即含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，氮吹至甲醇洗脱液中的甲醇近干，加入100ML三氟乙酸和200ML正己烷，涡旋混匀30秒，40°C衍生20分钟，氮吹有机相，加入ImL 15%乙腈水，混匀，经液相色谱测定黄曲霉毒素的峰面积，由标准曲线定量。回收率由测得的实际值与已知的加标值之比求得。检测结果经过3次重复，求得变异系数。作为对比实验，取5g同样的花生样品加入15ml 70%甲醇水，涡旋混匀，50°C超声12分钟，定量滤纸过滤，取滤液4mL加入2m L石油醚(沸点60-90)，涡旋I分钟，静置分层，取下层甲醇水3m L，加入8mL水，过0. 22Mm有机膜，取8mL滤液过免疫亲和柱，用ImL甲醇洗脱，氮吹甲醇洗脱液至近干，加入100ML三氟乙酸和200ML正己烷，涡旋混匀30秒，40°C衍生20分钟，氮吹有机相，加入ImL 15%乙腈水，混匀，经液相色谱测定黄曲霉毒素的峰面积，由标准曲线定量。回收率由测得的实际值与已知的加标值之比求得。检测结果经过3次重复，求得变异系数。两方法的回收率和成本对比如下:__
权利要求
1.一种黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于它包括以下步骤 (1)黄曲霉毒素B1富集材料的制备 在鳞片石墨中加入硫酸和磷酸组成的混酸及高锰酸钾，进行初步氧化反应，然后通过水解反应形成膨胀的氧化石墨，后用双氧水、盐酸和去离子水依次多次洗涤纯化得到氧化石墨，然后将纯化后的氧化石墨通过高强度的超声解离成单层氧化石墨烯，再经离心选取2000rpm离心30分钟不沉降且在5000rpm离心30min沉降而得到的； (2)将上述制备的黄曲霉毒素B1富集材料加入待测样品的甲醇水溶液中，所述体系中甲醇的含量按体积百分数计最高不超出体系总体积的12. 5%，所述黄曲霉毒素&富集材料的质量与体系总体积比至少要达到0. 625g/mL，室温混合，震荡10_30min以进行黄曲霉毒素&的富集，离心，去掉上清液，然后用甲醇进行洗脱，以将黄曲霉毒素B1富集材料中富集的黄曲霉毒素B1洗脱至甲醇中，得到含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，液相色谱检测备用。
2.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)的体系在需要时加水进行稀释，以使体系中甲醇含量按体积百分数计最高不超出体系总体积的12. 5% ;所述待测样品的甲醇水溶液用量为4-8mL。
3.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)中黄曲霉毒素B1富集材料的质量与体系总体积比为0. 625-0. 75g/mL。
4.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)体系中黄曲霉毒素B1的含量应在0. 8-100ng/mL范围内，如超出，可对待测样品的甲醇水溶液进行相应浓缩或稀释处理后再进行富集。
5.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)中甲醇洗脱步骤为将甲醇加入到富集了黄曲霉毒素B1的黄曲霉毒素B1富集材料中，混匀，离心，收集上清液，即为含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液。
6.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)中甲醇洗脱步骤还包括重复洗脱步骤，即在前述离心得到的沉淀中加入甲醇，混匀，离心，将得到的上清液和前述上清液合并，得到含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液。
7.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(2)还包括将甲醇洗脱液中的甲醇吹至近干后，加入三氟乙酸和正己烷衍生，然后加流动相进行定容，备用。
8.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述黄曲霉毒素B1富集材料的制备中高锰酸钾与鳞片石墨的质量比为6:1 ;硫酸和磷酸的体积比为9:1 ;所述的石墨在初步氧化过程中的质量分数为0. 709T0. 75%，在水解后的最终反应体系中的质量分数为0. 39TO. 375% ;所述的初步氧化反应条件为50°C搅拌反应12-48小时。
9.根据权利要求1的黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于所述步骤(I)中超声功率为800W或以上，超声时间为Ih或以上。
全文摘要
本发明涉及一种黄曲霉毒素B1液相色谱检测用富集方法，其特征在于它包括以下步骤(1)黄曲霉毒素B1富集材料的制备；(2)将上述制备的黄曲霉毒素B1富集材料加入待测样品的甲醇水溶液中，所述体系中甲醇的含量按体积百分数计最高不超出体系总体积的12.5%，所述黄曲霉毒素B1富集材料的质量与体系总体积比至少要达到0.625g/mL，室温混合，震荡10-30min以进行黄曲霉毒素B1的富集，离心，去掉上清液，然后用甲醇进行洗脱，以将黄曲霉毒素B1富集材料中富集的黄曲霉毒素B1洗脱至甲醇中，得到含黄曲霉毒素B1的甲醇洗脱液，液相色谱检测备用。该富集方法可用于黄曲霉毒素B1液相检测时的富集处理，操作简单，快速，结果可靠。
文档编号G01N30/08GK103018377SQ201210507390
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者李培武, 喻理, 张奇, 丁小霞, 张文, 马飞, 张兆威 申请人:中国农业科学院油料作物研究所
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