专利名称：胶体金层析法检测血液hiv1/2抗体的试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层析技术检测HIV1/2抗体的试纸条。
背景技术：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，又称获得性免疫缺陷综合症，是一类世界范围内严重�：θ死嘟】岛蜕牟《拘源拘约膊�。在不到20年中，已使3000万人受到感染，1000万人失去生命。目前，世界上每天有万余人新感染艾滋病病毒。据统计，至2001年底，我国艾滋病的感染人数为100万左右，现进入快速增长期，根据卫生部的资料，2001年上半年报告的艾滋病病毒感染者数量与上一年相比上升了67.4％。全球的研究结果表明HIV1/2是通过被污染的血液、血液制品、输血或密切个体间接触而传播传染的，在特殊的人群中甚至出现交叉感染的迹象。不但医学界在竭尽全力研究诊断预防治疗艾滋�。鞴缁岣鹘撞愣挤追淄度氲娇够靼痰脑硕�。但到目前为止，人类还没有找到一种治疗此病的方法。因而早期诊断及时发现感染病人，控制其进一步传播仍然是艾滋病防治的重要手段之一。
近年来，国内外主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)、PCR、细胞培养等方法检测HIV1/2抗体或病毒。这些方法都不同程度的存在一些缺点。
如ELISA法操作程序较复杂，易造成假阳性和假阴性，并易造成操作者受害和环境污染，试验时间较长，需要两个小时以上才能得出检测结果。同时必须具备酶标仪和洗板机，这在基层实验室和小型门诊较难达到，且试验受温度等条件限制，给检测带来不便。
分子测试(简称PCR法)其检测时间长，试验步骤繁琐，同时需要使用特殊的仪器和设备，试剂需要冷藏，同时检测费用昂贵，限制了试剂的普及应用。
IFA(荧光免疫检测法)必须具备荧光免疫显微镜和暗室条件，为获得良好的荧光观察效果必须配合合适的滤光片，实验时间需要两个小时，结果检测在荧光显微镜下进行，必须由有经验的专业技术人员判定检测结果。阴性的抗体测试结果不能排除是否感染，需要在超过21天后仍然阴性才能确定没有受到HIV1/2感染。
细胞培养是一种无菌操作技术，要求具备很高的实验工作环境和条件(无菌操作间、超净工作台、操作间等)，需要大量的仪器设备(培养箱、离心机、显微镜等)，需要大量的专业实验器材，实验技术复杂，需要有经验的技术人员操作，且实验周期很长，不适宜疾病的快速检测。
凝聚试验包括明胶颗粒(PA)和乳胶颗粒(LAT)属半定量测定，须多次倍比稀释测定费试剂，且结果重复性差，且灵敏度低。
而免疫金标法技术(Immunochromatography Assay)是上世纪九十年代中期发展起来的，因其快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点得到广泛的应用。它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的组合。将包被抗体，胶体金标记抗体固相化，与样本吸附材料等组合在一起，制备为免疫层析诊断试条/板，使用时只需要把试纸条下插入样本溶液，数分钟就可以判断结果。与免疫渗滤法比较，稳定性好，操作更简便、快速，且由于为干试条/试板形式，无需低温保存，储运方便。
目前，免疫胶体金技术在检测HIV1/2抗体的应用上具有如下缺点(1)检测局限于血清样本，不是同时实现血液或者血浆的检测。因此对于某些样本溶血或者样本量不够的情况下，由于灵敏度的限制，会出现错检或者漏检。
(2)特异性抗原仅能采用gp36和gp41，检测窗口期长。
(3)检测血清时需要对样本进行处理，整个检测时间长，费时费力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到HIV1/2抗体快速检测试纸条中，能实现HIV1/2抗体的血液、血浆以及血清检测，提高检测的窗口期，节约样本，减少操作人员劳动强度，省时省力。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被HIV1/2抗原，控制区包被抗鼠抗体。
所述的样品垫是经过样品垫处理溶液浸制处理的玻璃纤维膜，所述的样品垫处理液为含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
所述的包被膜上，检测区所包被的HIV1/2抗原为HIV1/2的特异性抗原gp36，gp41以及gp24，其来源于商品化的纯化基因工程重组抗原，或者自行制备；控制区所包被的抗鼠抗体，是用纯化的IgG免疫小鼠得到的。
本发明的另一目的在于提供一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法，包括以下步骤A.抗原的制备选用纯化的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原；B.包被膜的制备用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；C.金标抗原的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；D.将制备好的金标抗原涂覆在玻璃纤维膜上；E.样品垫的处理将样品垫的材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理；样品垫处理液中含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂；F.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
其中，所述的步骤D中，金标抗原的涂覆方法是将制备好的金标抗原均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测血液HIV1/2抗体的试剂盒。
与现有的检测试纸条相比较，本发明具有以下优点(1)通过对试纸条的改进，首次将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到检测试纸条中，能实现HIV1/2抗体的快速检测。
(2)对样品垫进行了特殊的预处理，因此在加样血液或血浆时，样品垫能够将样本中血清和血红细胞分离，血红细胞被吸附在样品垫上，血清在毛细作用下继续移动，从而实现检测血液和血浆的功能。
(3)本发明所述的试纸条提高了HIV1/2检测的窗口期，具有高度特异性、灵敏度、检测速度快等优点，节约样本，减少了操作人员劳动强度。
本发明成本低廉，操作简便，在检测时不需要特殊的仪器设备，因此能广泛应用于医院、血站、防疫站、卫生检疫部门、大专院校和科研机构的疾病诊断、流行病学调查和科学研究，特别适用于现场、农村和基层单位使用。这对于控制上述病毒性疾病的流行和传播有着极为重要的意义。
图1为本发明的结构示意图；图2为本发明的检测结果示意图。
具体实施例方式
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，如图1所示，该试纸条是在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而形成的膜条，包被膜4有检测区6和控制区7，检测区6包被HIV1/2抗原，控制区7包被抗鼠抗体。
在具体实施例中，所采用纯化的HIV1/2病毒基因工程重组抗原gp36，gp41和gp24作为包被抗原，该抗原可以实验室自制，也可以是购自美国亚利斯达生物技术公司(aristabiologicals)的商品化抗原。利用双抗原夹心法原理检测血清中是否含有HIV1/2抗体。当待测样本中含有HIV1/2抗体，抗体先和金标抗原结合，由于层析作用反应复合物沿包被膜向前移动，当遇到包被抗原时，形成抗原-抗体-金标抗原复合物而富集在包被线上，形成紫红色沉淀线，为阳性结果，从而快速诊断HIV1/2患者。
如图2所示，加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T区)6和控制区(C区)7相应的位置上出现紫红色条带，如图2(a)所示，如果C区7和T区6均出现紫红色条带，结果为阳性，说明样品含有HIV1/2抗体；如图2(b)所示，C区7出现紫红色条带，而T区6不出现紫红色条带，结果为阴性，说明样品不含HIV1/2抗体。如果C区7不出现紫红色条带，说明试纸条失效。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法见以下实施例实施例一本实施例的制备方法包括以下步骤A.抗原制备购买高纯度的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原gp36、gp41和gp24。HIV gp36的商品编号为AGHIV-0210，或AGHIV-0215；HIV gp41的商品编号为AGHIV-0220，或AGHIV-0225；HIV gp24的商品编号为AGHIV-0245。
B.抗原包被膜的制备包被缓冲液的制备0.05M pH9.6硫酸盐缓冲液为包被溶液，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。
封闭液的配制配制0.01M pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备用，有效期一周。配制封闭工作液2％BSA，2％脱脂奶，0.01MpH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)，0.22μ膜过滤后，置2℃～8℃备封闭包被膜用，有效期一周。
包被膜制备调试喷膜机(Bio-Dot)，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原，浓度为5～20μg/ml，机器划线，两线间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟。25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋备试纸板贴板用。
C.胶体金、胶体金标记抗原的制备氯金酸的配制用双蒸水溶解氯金酸，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％氯金酸溶液配方10g氯金酸溶解于1000ml双蒸水。
柠檬酸三钠的配制用双蒸水溶解柠檬酸三钠，配成1％溶液，置2℃～8℃备用，有效期三天。1000ml 1％柠檬酸三钠溶液配方10g柠檬酸三钠溶解于1000ml双蒸水。
0.1M碳酸钾的配制用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 0.1M碳酸钾溶液配方13.8g碳酸钾溶解于1000ml双蒸水。
3％PEG-20000的配制用双蒸水配制，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期一周。1000ml 3％PEG溶液配方30Gpeg-20000溶解于1000ml双蒸水。
标记洗涤液的配制2％牛血清白蛋白BSA，0.01M pH7.0 PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期两周。1000ml标记洗涤液配方20gBSA溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
金标物保存液的配制1％牛血清白蛋白BSA，0.5％脱脂奶，5/万叠氮钠NaN3，1％吐温-20(Tween-20)，0.01M pH7.0PBS溶液，0.22μ膜过滤，置2℃～8℃备用，有效期十五天。1000ml金标物保存液配方10gBSA；5g脱脂奶；1ml Tween-20；0.5g NaN3溶解于1000ml 0.01M pH7.0 PBS溶液。
胶体金的烧制用双蒸水将1％氯金酸溶液稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入4ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足失水。外观应纯净、透亮，无沉淀和漂浮物。
金标抗原的制备用0.1M碳酸钾调胶体金pH值至7.0～8.0，按照9～15μg抗体/ml胶体金加入gp36、gp41、gp24重组抗原，混匀，静置30分钟，13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤液洗涤两次，最后一次弃去上清，将沉淀用十分之一初始胶体金体积的金标物保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆硝酸纤维素膜用，有效期一周。
D.金标抗原的冻干将标记好的胶体金均匀地铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
E.样品垫的处理将样品垫材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理。
样品垫处理液的配方为含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
F.试纸板的生产金标抗原玻璃纤维膜的裁切根据滴配实验确定的宽度，将金标抗原玻璃纤维膜进行裁切，置干燥房间备贴板用。
吸水纸的操切用裁纸机将吸水纸切成35厘米长，4.2厘米宽，置干燥房间备贴板用。
玻璃纤维膜的裁切将玻璃纤维膜切成35厘米，宽2厘米的长条，置干燥房间备贴板用。
大板的粘贴按要求把包被膜、吸水纸、金标抗原、玻璃纤维膜粘贴在塑料底板上，组成大板。组装车间温度控制在25℃～30℃，湿度20％～30％。
G.切条用切条机将大板切成单个人份，每人份宽度按照一定要求2.5mm～4mm，随机抽检，灵敏度能检出室内质控，条带显色程度达到一个“+”号，无非特异性条带，能够通过卫生部质控标准panel。
H.组装、包装将1人份已切好的试纸条与一包干燥剂封装在铝箔塑料袋内，将50人份放入一包装盒，每盒一份说明书。于4-25℃避光保存，不得冻存。
将本发明所述的试纸条固定在试剂盒的底板上，合上上盖板，使上盖的加样窗对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应检测区和控制区，就成为可检测血液HIV1/2抗体的试剂盒。
实施例二本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于步骤B中，包被膜的制备方法是用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
实施例三本实施例的制备方法与实施例一基本相同，不同点在于步骤C中，金标抗原的制备方法是用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
权利要求
1.胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(2)、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)而形成的膜条，包被膜(4)有检测区(6)和控制区(7)，检测区(6)包被HIV1/2抗原，控制区(7)包被抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于所述的样品垫(2)是经过样品垫处理溶液浸制处理的玻璃纤维膜，所述的样品垫处理液为含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，其特征在于包被的HIV1/2抗原为HIV1/2的特异性抗原gp36，gp41以及gp24，为纯化的基因工程重组抗原。
4.如权利要求1所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A.抗原的制备选用纯化的基因工程表达的HIV1/2病毒重组抗原；B.包被膜的制备用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为5～20μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用；C.金标抗原的制备用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按9～15μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用；D.将制备好的金标抗原涂覆在玻璃纤维膜上；E.样品垫的处理将样品垫的材料玻璃纤维膜放入样品垫处理溶液中处理；样品垫处理液中含1％～5％BSA的0.01M PBS溶液，并含0.01％～0.5％PEG和0.01％～0.05％TWEEN-20表面活性剂；F.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，包被膜的制备方法是用包被膜缓冲液稀释抗原至浓度为10μg/ml，喷印在包被膜上，凉干后在25℃～37℃封闭液中浸泡60分钟，取出后于25℃～37℃烘干2小时，封袋备试纸板贴板用。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，金标抗原的制备方法是用0.1M碳酸钾调节胶体金pH值至7.0～8.0，按12μg蛋白/ml胶体金加入HIV1/2gp36，gp41和gp24重组抗原，混匀后静置，离心处理，弃去上清，将沉淀用标记洗涤液洗涤，将沉淀用十分之一初始胶体金的金标抗原保存液溶解，置2℃～8℃备涂覆玻璃纤维膜用。
7.根据权利要求4或5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤D中，金标抗原的涂覆方法是将制备好的金标抗原均匀的铺在玻璃纤维膜上，每毫升溶液铺4～8平方厘米，25℃～40℃干燥16小时，封袋，置2℃～8℃备试纸板贴板用。
全文摘要
本发明公开了一种胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条及其制备方法。本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条，是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆金标抗原的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被HIV1/2抗原，控制区包被抗鼠抗体。本发明将艾滋病的特异性抗原gp36，gp41以及gp24引入到HIV1/2抗体快速检测试纸条中，并改进了样品垫的处理，能实现HIV1/2抗体的血液、血浆以及血清检测，提高检测的窗口期，节约样本，减少操作人员劳动强度。
文档编号G01N33/531GK1580777SQ20041002729
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者王继华, 李文美 申请人:王继华
专业数控铣床产品供应商
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