专利名称：采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法
技术领域：
采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，涉及一种采用秀丽线虫对可溶性重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应的方法。属于环境保护、生态毒理学研究、生态风险评价等技术领域。
背景技术：
秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)对外界环境的变化非常敏感，环境胁迫会改变它们的生殖速度、生命周期等发育特征以及其他行为学特征。毒理学研究经常采用秀丽线虫作为毒性测试模式动物，但是对于低浓度、连续性地暴露多个世代周期的持久性毒性的研究并没有先例。用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质世代毒性的方法已经有所研究，其方法涉及不同世代的秀丽线虫经过相同的暴露后的效应之间的比较，虽然能够对重金属在世代之间的毒性效应得到一定的比较结果，但是该效应及其比较结果相对于真实环境依旧存在差异和不足，主要表现在其一，暴露时间的不连续，每一世代的线虫其生命周期只有某一段时间接受暴露，并不是全生命阶段的暴露，尤其是没有涵盖秀丽线虫对外界环境变化更加敏感的、从虫卵到成虫的发育阶段；其二，并不能够反映实际环境下食物与重金属共存的真实条件，已有研究表明，食物能够改变秀丽线虫对重金属的响应，不考虑食物对秀丽线虫的影响并不能够为真实环境条件下的风险进行有力的说明。
发明内容
本发明的目的是公开一种采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，具体是以虫卵作为起始受试生物，确定了不影响虫卵正常孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形，与现有采用秀丽线虫进行毒性测试方法比较，具有明确的针对性，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。为了达到上述目的，本发明采用秀丽线虫对重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应。本发明确定了不影响虫卵孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形。本发明所用秀丽线虫以及 E. coli 0P50均由复旦大学发育生物学研究所惠赠。具体包括如下步骤A，依照传统急性毒性测试方法，以秀丽线虫成虫作为受试生物，测得该可溶性重金属的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下设置4个浓度梯度，其中包括3个重金属浓度， 1个空白对照；其中，测定LC5tl的具体步骤是按照B步骤获得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50并37°C培养过24h的NGM固体培养基上，置于20°C培养48h，获得同步化的秀丽线虫成虫，然后以96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒24h后采用体视显微镜对96孔板中的秀丽线虫进行观察，虫体僵直且对轻微触碰无反应则认定其死亡，分别记录秀丽线虫成虫的总数与死亡数，计算死亡率；若所设定的浓度梯度没有同时涵盖30% 至70%的死亡率，则根据情况调整重金属的浓度梯度若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均小于70%，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最低浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于30%，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最高浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度。然后再次以96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒 24h后采用体视显微镜对死亡率进行观察；重复此操作直至获得的死亡率同时涵盖30%至 70%，然后以浓度对数为横坐标、死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得其急性LC5tl值；B,按照传统方法，在20°C条件下将秀丽线虫培养三天后，用2mL无菌水将NGM培养基表面的秀丽线虫冲洗至15mL具刻度的离心管中，静置30min，去除上清液至虫液小于 1.5mL，根据传统同步化方法，按照虫液clorox溶液=1 7的体积比，将clorox溶液加入虫液中，混合摇勻，反应20min，每五分钟摇勻一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心;3min，弃上清液，再加入无菌水至离心前相同的刻度，摇勻， 2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后向离心管中加入IOmL按照传统配方获得的无菌K-溶液后混勻，采用体视镜观察40 μ L该混合液的虫卵数量，若虫卵数量多于500 枚，则向离心管中再加入2mL无菌K-溶液再混勻、观察，若虫卵数量少于300枚，则静置沉淀lOmin，去除2mL上清液再混勻、观察，直至将虫卵浓度稀释为每40 μ L含有约400枚虫卵为止，该密度能够不影响虫卵的正常孵化，此为第一批进行染毒的虫卵，标记为卵液Ptl,待用；C，采用依传统配方获得的LB液体培养基在37°C、200rpm条件下将E. coli0P50培养24h至48h，混勻后倒入已灭菌的15mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入8mL无菌K-溶液混勻，以M孔板为容器、以酶联免疫检测仪为检测仪器，测定每300 μ L该混合液在570nm处的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，则将混合液重新离心，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入6mL或IOmL无菌K-溶液混勻，再次测定混合液在570nm处的吸光度，通过减少或增加无菌-K溶液的体积将吸光度值调整至1. 1 与1. 3之间，此时E. coli 0P50的总量约为IO8至IO9个，该数量条件下的菌个数能够为B 步骤所得秀丽线虫虫卵的正常生长发育提供足够的食物，标记为菌液，待用；D，采用无菌透明的M孔板进行染毒，先将C步骤获得的菌液摇勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L该菌液，将B步骤稀释好的卵液摇勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L该卵液，将M孔板划分为4行、6列，这些含有虫卵的M孔，每行作为一组、4行共4组对应于 A步骤确定的4个浓度梯度，对秀丽线虫进行染毒；在对孔板的孔与孔之间加入ImL无菌 K-溶液以减少染毒期间，蒸发对染毒体系的影响；可根据实际需要对所采用的M孔板的个数及相关布局进行调整；将M孔板置于20°C条件下培养并开始计时；E，在D步骤计时的后，从每行中随机移取1孔中的秀丽线虫用于测定相关指标，均标记为Ptl的各指标值；Fdf M孔板中4个浓度梯度对应的混合液分别吸取到4个无菌的15mL离心管中， 并用ImL无菌K-溶液冲洗M孔板每一孔中残留的虫体，并将冲洗液转移至相应的离心管中，静置沉淀15min，弃上清液保留沉淀，根据传统同步化方法，加入clorox溶液至12mL刻度线，混合摇勻，反应20min，每五分钟摇勻一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心3min，弃上清液，再加入无菌水至离心前相同的刻度，摇勻，2500rpm 离心;3min，弃上清液，重复该操作两次，然后按照步骤B中的方法，以无菌K-溶液为稀释液， 将4个离心管中的虫卵浓度分别稀释为每40 μ L含有400枚虫卵，此批虫卵为母代的子一代虫卵，标记为卵液F1，待用；重复步骤C获得菌液，按照与步骤A相同的受试浓度梯度、重复步骤D、Ε，获得标记为F1的各指标值；G，重复步骤F，获得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指标；H，依照Ε、F、G步骤中获得的各代秀丽线虫的指标值之间的显著性差异分析结果， 参照用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质的世代毒性的方法将该可溶性重金属的持久性毒性类别分为不具有明确的持久性毒性、有延迟性的持久性毒性、具有可被修复的毒性、具有明确并且不可修复的持久性毒性。本发明的效果和优点是1.与先前采用秀丽线虫测定药品与个人护理品世代毒性的方法相比，本发明步骤更少、操作更简单，不仅保持了接近实际环境浓度的暴露水平，而且实现了暴露时间的连续性，使得多个连续世代的秀丽线虫的整个生命周期都涵盖在暴露时间中，尤其是涵盖了秀丽线虫对外界环境变化更加敏感的、从虫卵到成虫的发育阶段，本发明的暴露时间更加接近实际环境条件下的暴露。2.与先前采用秀丽线虫测定药品与个人护理品世代毒性的方法相比，本发明考虑到食物能够改变秀丽线虫对重金属响应的研究，确定了不影响孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，实现了食物与重金属的共存，暴露情形更加接近实际环境条件下的暴露。3.该方法秉承了对秀丽线虫行为学、发育学、神经学等丰富指标的可用性，秀丽线虫个体水平、生理生化水平、分子水平等多层面的各项毒性指标均可以与本方法相兼容。秀丽线虫在经过接近实际环境的有食物共存、低浓度、长时间的暴露之后，不同世代(母代P。、 子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx)之间相同指标的相互比较结果，不仅能够获得该重金属的毒性是否传递给后代，此种毒性传递的强弱、传递的途径，以及不同世代对该重金属的敏感性是否发生变化等结果，使得所进行的毒性研究更加系统、全面，对于判断毒性产生作用的顺序及机理提供明确的指导方向；而且能够为该重金属的评价与管理提供更为合理、更加接近实际环境暴露情形的数据基�。兰鄹弥种亟鹗舻纳缦仗峁└涌煽康氖�。
具体实施例方式实施例1配制LB(Luria Bertani)培养基、NGM(Nematode Growth Medium)固体培养基、 K-溶液和clorox溶液。①根据《分子克隆试验指南》(J.萨姆布鲁克，D. W.拉塞尔等)配制LB培养基 (IL) :10g胰蛋白胨、5g酵母浸膏、IOg氯化钠，用lmol/L NaOH溶液将pH值调为7. 0，在 121°C、0. 105MPa 灭菌 20min。另配制 lmol/L NaOH 溶液(IOOmL) :4g 氢氧化钠，IOOmL 水。②根据S. Brenner在1974年Genetics刊物上发表的论文(The genetics ofCaenorhabditis elegans)配制 NGM 固体培养基(IL) 17g 琼脂粉、2. 5g 蛋白胨、3g 氯化钠、25mL pH = 6. 0 的 K2HPO4-KH2PO4 溶液；121°C、0. 105MPa 高压灭菌 20min，冷却至 50°C 左右时，加入经抽滤灭菌处理过的lmol/L MgS04、lmol/LCaCl2、5mg/mL胆固醇/乙醇溶液各lmL，混合均勻后倒入灭菌后的培养皿中，静置冷却至室温凝固后，待接种。另配制 lmol/L K2HPO4-KH2PO4 缓冲液(pH = 6. 0，150mL) :11. 4g K2HPO4 · 3H20，50mL 蒸馏水；6. 8g KH2PO4, 50mL蒸馏水；按前者比后者为2 1比例配成pH = 6. 0的缓冲液。配制胆固醇溶液 (IOOmL) :0. 5g胆固醇，IOOmL无水乙醇溶解；抽滤灭菌。配制lmol/L MgSO4(IOOmL) :24. 6g MgSO4 · 7H20, IOOmL 蒸馏水；抽滤灭菌。配制 lmol/L CaCl2 :11. Ig CaCl2, IOOmL 蒸馏水；抽滤灭菌。抽滤除菌用无菌Φ 13mm孔径0. 45 μ m的硝酸纤维素膜过滤菌类。将滤膜装在高温灭菌处理过的容量为5mL的玻璃注射器靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，压出液膜的溶液即抽滤除菌后的溶液。③根据 P. L.Williams 等人在 1990 年 Environemtnal Toxicology and Chemistry 干丨J 物上发表的论文(Aquatic toxicity testing using the nematode, Caenorhabditiselegans)配制 K-溶液(IL) :3. OOg NaCl，2.36g KCl ；在 121°C、0. 105MPa 灭菌20min。(4) S. W. Emmons ^Λ 1979 Proceedings of the National Academyof Sciences 干^|物上发表白勺论文(An analysis of the constancy of DNA sequencesduring development and evolution of the nematode Caenorhabditis elegans)配fj^clorox溶液(30mL) :5mL NaOCl溶液(有效成分6% )，0. 6g NaOH，25mL蒸馏水。根据需要的量现用现配。将大肠杆菌0P50(E. coli 0P50)接种至灭菌后恢复至室温的LB培养基中，37°C培养Mh即可使用。将培养好的0P50 E. coli接种至NGM培养基上，37°C培养24h即可使用； 将秀丽线虫接种至该NGM培养基上，20°C常规培养。本发明所用秀丽线虫以及E. coli 0P50 均由复旦大学发育生物学研究所惠赠。采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，具体步骤如下A，依照传统急性毒性测试方法，以秀丽线虫成虫作为受试生物，测得该重金属的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下设置8个浓度梯度，其中包括7个重金属浓度，1个空白对照；其中，测定LC5tl的具体步骤是按照B步骤获得同步化的卵液，在覆有E. coli 0P50 并37°C培养Mh的NGM固体培养基上，20°C培养48h，获得同步化的秀丽线虫成虫，然后以 96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒24h后采用体视显微镜对96 孔板中的秀丽线虫进行观察，虫体僵直且对轻微触碰无反应则认定其死亡，分别记录秀丽线虫成虫的总数与死亡数，计算死亡率；若所设定的浓度梯度没有同时涵盖30%至70%的死亡率，则根据情况调整重金属的浓度梯度若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均小于 70%，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最低浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较高的浓度梯度；若所设定的浓度梯度所产生的死亡率均大于30%，则保持空白对照不变，将重金属浓度梯度中的最高浓度不变，增加所采用的等对数间距，设定较低的浓度梯度。然后再次以96孔板为染毒环境，向每孔中加入15条秀丽线虫成虫，染毒24h后采用体视显微镜对死亡率进行观察；重复此操作直至获得的死亡率同时涵盖30%至70%，然后以浓度对数为横坐标、死亡率为纵坐标，采用直线内插法获得其急性LC5tl值；B，按照传统方法，在20°C条件下，将秀丽线虫常规培养三天后，用2mL无菌水将NGM培养基表面的秀丽线虫冲洗至15mL具刻度的离心管中，静置30min，去除上清液至虫液小于1.5mL，根据传统同步化方法，按照虫液clorox溶液=1 7的体积比，将clorox溶液加入虫液中，混合摇勻，反应20min，每五分钟摇勻一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心;3min，弃上清液，再加入无菌水至离心前相同的刻度，摇勻， 2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后向离心管中加入IOmL无菌K-溶液混勻，采用体视镜观察40 μ L该混合液的虫卵数量，若虫卵数量多于500枚，则向离心管中再加入2mL无菌K-溶液再混勻、观察，若虫卵数量少于300枚，则静置沉淀lOmin，去除2mL上清液再混勻、观察，直至将虫卵浓度稀释为每40 μ L含有约400枚虫卵为止，该密度能够不影响虫卵的正常孵化，此批虫卵为第一批进行染毒的虫卵，标记为卵液Ptl，待用；C，采用按照传统配方获得的LB液体培养基在37°C、200rpm条件下将E. coli0P50 培养24h至48h，混勻后倒入已灭菌的15mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入8mL无菌K-溶液混勻，以M孔板为容器、以酶联免疫检测仪为检测仪器，测定每300 μ L该混合液在570nm处的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，则将混合液重新离心，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入6mL或IOmL无菌K-溶液混勻，再次测定混合液在570nm处的吸光度，通过减少或增加无菌-K溶液的体积将吸光度值调整至1. 1 与1. 3之间，此时E. coli 0P50的总量约为IO8至IO9个，该数量条件下的菌个数能够为B 步骤所得秀丽线虫虫卵的正常生长发育提供足够的食物，标记为菌液，待用；D，将M孔板划分为4行、6列，采用两个无菌透明的M孔板进行染毒，先将C步骤获得的菌液摇勻，向两个M孔板共48孔中加入300 μ L该菌液，将B步骤稀释好的卵液摇勻，向以每个M孔板的前三列共12孔、两板共M孔中加入200 μ L该卵液，这些含有虫卵的24孔，同一行的3孔作为一组、两板共8组对应于A步骤确定的8个浓度梯度，对秀丽线虫进行染毒；向每个M孔板的后三列共12孔、两板共M孔中加入200 μ L无菌K-溶液作为补充液，这些无虫卵的M孔，同一行的3孔作为一组、两板共8组对应于A步骤确定的 8个浓度梯度，用于提供菌液在此受试条件下变化的对照；然后将C步骤准备好的重金属以每行一个浓度梯度、两板共8个浓度梯度，向两板共48孔中分别加入500 μ L重金属，混勻后立即利用酶标仪测定每孔在570nm处的吸光度值，记为ODfe ；在M孔板的孔与孔之间加入ImL无菌K-溶液以减少染毒期间，蒸发对染毒体系的影响；将对孔板置于20°C条件下培养并开始计时；E，在D步骤计时的后，利用酶标仪测定每孔在570nm处的吸光度值，记为0D#， 每一个孔OD值的变化值为Δ OD = ODfe-OD^ D步骤中含有卵液的8个梯度、共M孔的AOD 均要减去同一浓度梯度、不含有卵液的参照孔的Δ( ，记为饮食量抑制率(Ptl)；从每一浓度梯度中含有卵液的三孔中随机移取1孔中的秀丽线虫，测定秀丽线虫的身体大小、身体弯曲频率、逆向运动等指标的检测，具体实施步骤是用移液枪从8组浓度分别取少量秀丽线虫至1.5mL离心管中，沉淀15min，采用移液枪去除上清液，再加入无菌蒸馏水清洗秀丽线虫身上黏附的0P50E. coli以及重金属，沉淀15min，将底部秀丽线虫转移至无0P50E. coli 的NGM培养基上，置于20°C培养箱中，池后，水分蒸发并且秀丽线虫已经适应环境之后，采用体视显微镜附带的成像软件对秀丽线虫进行照相并进行60seC的录像，根据文献对秀丽线虫的体长、身体弯曲频率、逆向运动频率等指标进行检测。各项指标均以其占空白对照组的秀丽线虫相同指标的比例表示。各项指标分别标记为“体长(Ptl) ”、“身体弯曲频率(Ptl) ”、“逆向运动频率(P0)，，； F，将经过E步骤后的2个M孔板中含有卵液的8个浓度梯度对应的混合液分别吸取到8个无菌的15mL离心管中，并用ImL无菌K-溶液冲洗M孔板每一孔中残留的虫体， 并将冲洗液转移至相应的离心管中，静置沉淀15min，弃上清液保留沉淀，加入clorox溶液至12mL刻度线，混合摇勻，反应20min，每五分钟摇勻一次，杀死母体，留下对clorox溶液有抵抗能力的虫卵，2500rpm离心;3min，弃上清液，再加入无菌水至离心前相同的刻度，摇勻， 2500rpm离心3min，弃上清液，重复该操作两次，然后按照步骤B中的方法，以无菌K-溶液为稀释液，将8个离心管中的虫卵浓度分别稀释为每40 μ L含有400枚虫卵，此批虫卵为母代的子一代虫卵，标记为卵液F1,待用；重复步骤C获得菌液，按照与步骤A相同的受试浓度梯度、重复步骤D、E，获得标记为F1的各指标值，包括“饮食量抑制率(F1) ”、“体长(F1) ”、 “身体弯曲频率(F1) ”、“逆向运动频率(F1)，，;G，重复步骤F，获得子二代F2的各指标值，包括“饮食量抑制率(ig ”、“体长(ig ”、 “身体弯曲频率(F2) ”、“逆向运动频率(F2)，，；子三代F3的各项指标值，包括“饮食量抑制率 (F3) ”、“体长(F3) ”、“身体弯曲频率(F3) ”、“逆向运动频率(F3) ” ；以及子四代F4的各指标， 包括“饮食量抑制率(F4) ”、“体长(F4) ”、“身体弯曲频率(F4) ”、“逆向运动频率(F4) ”等；H，依照用秀丽线虫测定药品与个人护理品类物质的世代毒性的方法对重金属的持久性毒性进行评价，采用美国OriginLab公司推出的数据分析和制图软件Origin 7. 5以及满足该软件要求的电脑，对包括子一代F1、子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx等的毒性结果与秀丽线虫母代Ptl的毒性结果进行比较并进行显著性分析，具体实施步骤如下将 E、F、G步骤获得的“饮食量抑制率(Ptl) ”、“饮食量抑制率(F1) ”、“饮食量抑制率(F2) ”、“饮食量抑制率(F3) ”的数据输入Origin 7. 5数据列表，在statistics下打开anova的下拉按钮中的one-way anova，从候选列表中将“饮食量抑制率(Ptl) ”与“饮食量抑制率(F1)"的数据选择，并将“显著性参数”设定为0.05，点击“计算”，即可获得饮食量抑制率(F1)与饮食量抑制率(Pq)的显著性差异结果；若计算结果显示为“At the 0. 051evel,thepopulation means are not significantly different. ”，即“二者在 0. 05 的水平下，不存在显著性差异，，；若结果显不为 “At the 0. 051evel, the population means aresignificantIy different. ”，即“二者在0. 05的水平下，存在显著性差异”。然后再次在statistics下打开anova的下拉按钮中的one-way anova,从候选列表中将“饮食量抑制率(I3tl)，，与“饮食量抑制率(ig，，的数据选择，并将“显著性参数”设定为0. 05，点击“计算”，即可获得饮食量抑制率(F2)与饮食量抑制率(Ptl)的显著性差异结果；以此类推，获得饮食量抑制率(F3)与饮食量抑制率(Ptl)的显著性差异结果以及饮食量抑制率(F3)与饮食量抑制率(Ptl)的显著性差异结果。若“饮食量抑制率”的比较结果包括"F1与P0”、“F2与P0”、“F3与P0”、“F4与 Po”，均未得到显著差异的结果，则说明该重金属对该指标不具有明确的持久性毒性；若"F1 与P0”、“F2与P0，，的比较结果为“不存在显著性差异”，而"F3与P0”、“F4与P0，，的比较结果为“存在显著性差异”，而且&、&表现出更为严重的毒物抑制效应，则说明该重金属对该指标有延迟性的持久性毒性；若"F1与WF2与P。”的比较结果为“存在显著性差异”，而"F3 与Po”、"F4与P/的比较结果为“不存在显著性差异”，而且F3、F4表现出较为轻微的毒物抑制效应，则说明该重金属对该指标具有可被秀丽线虫修复或适应的毒性；若"F1与ΡΛ“Ρ2 与P。”、“F3与P0”、“F4与Ptl”的比较结果均为“存在显著性差异”，而且"F2与F/，、“F3与F/，、"F4与F,的比较结果，"F3与Π与F2"的比较结果，"F4与F,的比较结果也都为“存在显著性差异”，而且Pp F1, F2, F3, F4受到的毒物抑制效应也更加严重，则说明该重金属对该指标具有明确的、不可修复的持久性毒性。 对其他的指标进行相同的显著性差异分析，并对持久性毒性进行评价。综合考虑各项指标对持久性毒性的评价结果，判断受到该重金属的持久性暴露后，秀丽线虫所表现的毒性效应的先后顺序，饮食首先受到影响、行为学活性进而受到影响，或者行为学活性首先受到影响、饮食继而受到影响，或者其他顺序，根据不同的毒性效应的先后顺序，可以推断该重金属是通过饮食、体表或是其他途径产生的毒性效应，为研究产生该持久性毒性的致毒机理提供方向。
权利要求
1.采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，包括A，依照急性毒性测试方法，以秀丽线虫成虫作为受试生物，测得该重金属的急性LC5tl值，在急性LC5tl值的1/10下设置3个重金属浓度和1个空白对照，其特征是B，利用无菌具刻度的15mL离心管，采用同步化方法获得秀丽线虫虫卵，然后向15mL 离心管中加入IOmL无菌K-溶液，混勻，采用体视镜观察40 μ L该混合液的虫卵数量，若虫卵数量多于500枚，则向离心管中再加入2mL无菌K-溶液后再混勻、观察；若虫卵数量少于300枚，则静置沉淀lOmin，去除2mL上清液后再混勻、观察；直至将虫卵浓度稀释为每 40 μ L含有400枚虫卵为止，此批虫卵为第一批进行染毒的虫卵，标记为卵液Ptl，待用；C，采用LB液体培养基在37°C、200rpm条件下将E. coli 0P50培养24h至48h，混勻后倒入已灭菌的15mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入SmL 无菌K-溶液混勻，以M孔板为容器、以酶联免疫检测仪为检测仪器，测定每300 μ L该混合液在570nm处的吸光度，若吸光度值小于1. 1或大于1. 3，则将混合液重新离心，弃上清液， 保留沉于底部的菌体，加入6mL或IOmL无菌K-溶液混勻，再次测定混合液在570nm处的吸光度，通过减少或增加无菌-K溶液的体积将吸光度值调整至1. 1与1. 3之间，此时E. coli 0P50的总量为IO8至IO9个，该数量条件下的菌个数能够为B步骤所得秀丽线虫虫卵的正常生长发育提供足够的食物，标记为菌液，待用；D，采用无菌透明的M孔板进行染毒，先将C步骤获得的菌液摇勻，向M孔板的每孔中加入300 μ L该菌液，将B步骤稀释好的卵液摇勻，向M孔板的每孔中加入200 μ L该卵液， 将M孔板划分为4行、6列，这些含有虫卵的M孔，每行作为一组、4行共4组对应于A步骤确定的4个浓度梯度，对秀丽线虫进行染毒；在M孔板的孔与孔之间加入ImL无菌K-溶液以减少染毒期间，蒸发对染毒体系的影响；可根据实际需要对所采用的M孔板的个数及相关布局进行调整；将M孔板置于20°C条件下培养并开始计时；E，在D步骤计时的后，从每行中随机移取1孔中的秀丽线虫用于测定相关指标，均标记为Ptl的各指标值；F，将M孔板中4个浓度梯度对应的混合液分别吸取到4个无菌的15mL离心管中，用 ImL无菌K-溶液冲洗M孔板每一孔中残留的虫体，并将冲洗液转移至相应的离心管中，静置沉淀15min，弃上清液保留沉淀，采用同步化方法，获得4个浓度梯度对应的4组虫卵，然后依照步骤B中的方法，以无菌K-溶液为稀释液，将4个离心管中的虫卵浓度分别稀释为每40 μ L含有400枚虫卵，此批虫卵为母代的子一代虫卵，标记为卵液F1，待用；重复步骤C 获得菌液，按照与步骤A相同的受试浓度梯度、重复步骤D、Ε，获得标记为F1的各指标值； G，重复步骤F，获得子二代F2、子三代F3直至第χ代子代Fx的各指标； H，依照E、F、G步骤中获得的各代秀丽线虫的指标值之间的显著性差异分析结果，参照传统方法将该可溶性重金属的持久性毒性类别分为不具有明确的持久性毒性、有延迟性的持久性毒性、具有可被修复的毒性、具有明确并且不可修复的持久性毒性。
全文摘要
采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，涉及一种采用秀丽线虫对可溶性重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应的方法。本发明确定了无重金属存在下、不影响虫卵正常孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形，不同世代之间相同指标的相互比较，获得该重金属在长期实际环境暴露情形下的毒性传递的强弱、传递的途径等。本发明弥补了现有采用秀丽线虫进行毒性测试方法的不足，具有明确的针对性，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。
文档编号G01N33/48GK102183627SQ20111004576
公开日2011年9月14日 申请日期2011年2月25日 优先权日2011年2月25日
发明者于振洋, 尹大强, 张晶 申请人:同济大学
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