专利名称：在流式芯片检定中对核酸目标的实时扩增和微阵列检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于进行目标多核苷酸分子的快速检测和/或定量的方法。本发明涉及一种结合微阵列和流通式装置的用于快速扩增(优选通过PCR进行)可能存在于溶液中的多个目标多核苷酸分子以及实时定量扩增这些目标物的方法。该方法适用于分子生物学中复杂样品的诊断应用。本发明还提供简单且不昂贵的设备和仪器，来执行基于经由扩增的实时追踪而快速检测和/或定量多种目标的方法。
背景技术：
核酸序列的扩增使用多种扩增反应来进行，在多种扩增反应中，最突出的是聚合酶链式反应(PCR)。PCR是用于扩增特定核酸序列的方法。当实时监测扩增过程时，将PCR用来定量分析。实时PCR通常利用溶液中的荧光报告物质，例如嵌入染料、TaqMan探针、Scorpion引物、分子信标。当在实时PCR中分析多个核酸目标序列时，提议两种方法。第一种是使反应平行化，即，在独立的隔间中进行各自的反应。第二种方法是使反应多重化，即，在相同的隔间中进行反应并对于各种反应使用不同的荧光染料报告物质。这种分析受到能有效分辨的荧光染料数量的限制。现有技术的状态是通常在同一溶液中进行2个、有时候为4个、偶尔6个反应。近来提出捕捉分子(capture molecule)用于检测在PCR过程中扩增的多核苷酸的用途(W02006/053770)作为多重实时PCR的第三种替代方法。该方法基于光学块(optical block)的表面的使用,捕捉分子固定在该表面上。它们在不同的PCR循环之间捕获所扩增的多核苷酸，从而可以检测它们随循环进行的出现情况，并绘制各个目标物的实时曲线。该方法使用在不同温度相继加热的盒体(cartridge)以进行4步骤的过程:变性、退火、延伸和杂交。PCR过程和表面杂交过程的热学要求非常不同。PCR扩增需要的温度循环为，变性步骤在非·常高的温度(约95°C)下进行，从而在dsDNA (双链DNA)的熔解温度之上。另一方面，表面杂交需要在低于核酸熔解温度的精确温度下进行，并且为了优化性能，应该避免在扩增子在捕捉探针位点上的扩散有限原位耗尽。该方法已经被提议使用不同的杂交扩增子检测方法:共聚焦扫描(W006053770)、倏逝场(evanescence field)(W02008/034896)和禁止角((forbidden angle)) (W02009/013220)。已建议该方法可以在约3hr或更长时间内检测多个目标扩增子。需要改进用于多个目标物的实时扩增方法，以获得具有所需的敏感度、再现性和定量性的完全自动、快速(例如，少于I或2小时)且简单的检测。已经描述过在相对快速的循环时间中的单个或少数目标物PCR。例如，Kopp等人1998 (Science280,1046 1048)提议一种具有数次通过变性、退火和延伸用的3个不同温度区的通道的用于流通PCR的芯片。该通道具有用于注射扩增溶液的入口以及用于回收所扩增产物的出口，所扩增产物在之后通过标准方法进行分析，例如凝胶电泳。而且，US6, 960，437描述了一种具有旋转的微流体通道和多个沿着该旋转通道存在于不同位置的温度区的微流体装置。微流体通道由弹性体材料制得，当施加力时，该种材料变形，但在移除力时会回复到原始形状。通过循环到通道，溶液经过3个扩增步骤并进行PCR。该专利描述用于获得良好扩增的循环装置的不同部件和特征。使用TaqMan探针(实施例3)或SYBRGreen在溶液中或在凝胶电泳之后进行检测。专利提到微阵列的使用，其可以结合到循环通道中从而进行所扩增目标物的检测。然而，没有提到也没有指示怎样在这样的系统中在微阵列上进行检测。专利申请EP-A-2138587还提议通过将溶液连续通过3个温度区来扩增核酸序列，并在具有固定的捕捉分子的微阵列上进行检测。该方法和装置的特征在于，在指定的杂交区进行杂交和检测，从而可以独立于扩增过程来调节杂交和检测。本发明提供这两个过程的解耦优化。优选的实施方式是单向非循环地流过用于不同循环的通道的不同部件，各个循环具有专用杂交区。专利描述通过不同温度区的通道的不同构造。优选地，在与给定循环对应(对于给定循环和给定杂交时间的杂交扩增子的静态点图)的经过多个杂交区的PCR检定的最后进行单次扫描，以避免在各个循环中快速扫描的需要。在单向流式装置的方法中呈现一个结果。该文件未提及怎样在扩增过程中在微阵列表面上的不同离散区域进行同源杂交。
发明内容
本发明的方法涉及一种通过生物样品在循环的流式芯片(flow chip)溶液中流经扩增所需的不同温度进行扩增以及在特异捕捉分子的微阵列上对其进行实时检测，从而从可能的其他化合物中对存在于生物样品中的至少一种多核苷酸目标化合物进行识别和/或定量的方法。如权利要求1所述，本发明涉及一种对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的方法，其包括以下步骤:a)提供流式芯片装置，包括:-流动通道，其截面在0.01与IOmm2之间且容积为VI，其中流动通道被配置成:弓丨入流动通道中的溶液经由流动通道循环；-检测室(detectingchamber),与流动通道流体连通,该检测室具有光学透明的固体支持物(support)以及微阵列，微阵列含有多于4种的固定在该透明固体支持物表面的局部区域(localized area)中的捕捉分子,其中该检测室具有低于Imm的高度且容积为V2，且其中V2/V1的比率在0.001与0.5之间;-至少2个，优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于流动通道的不同位置，其中一个温度区包括检测室且具有允许目标多核苷酸分子杂交到捕捉分子的温度；b)将体积为V3且含有目标多核苷酸分子的溶液引入到流动通道和用于多核苷酸分子扩增的试剂，其中V3/ (V1+V2)的比率高于0.02并低于I ;c)将溶液进行至少5个扩增循环，以获得标记的目标多核苷酸分子，其中通过使溶液经过流动通道和相同检测室在不同温度区之间循环，从而得到一个扩增循环，其中扩增循环进行少于3分钟；d)通过检测从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出且在经由光束激发荧光染料之后测量到的荧光，从而在至少3个、优选为至少5个不同的扩增循环中从杂交的目标多核苷酸分子测量不同扩增时点的荧光信号；e)分析从局部区域得到的信号值，从而对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。本发明还涉及用于实施该方法的装置。该装置是用于对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的流式芯片装置，其包括:-流动通道，布置在基部(substrate)内，该流动通道的截面在0.01与IOmm2之间且容积为VI，其中流动通道被配置成:引入流动通道中的溶液经由流动通道而循环；-检测室，与流动通道连接，该检测室具有固定在其一个表面上的微阵列，该微阵列含有多于4种的固定在该表面的局部区域中的捕捉分子，其中该检测室具有低于Imm的高度且容积为V2，且其中V2/V1的比率在0.001与0.5之间；-至少2个，优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于流动通道的不同位置，其中一个温度区包括检测室且具有允许目标多核苷酸分子杂交到捕捉分子的温度；-入口，与流动通道流体连通，溶液经该入口引入流动通道中；其中捕捉分子固定在光学透明固体支持物的表面(SI)上，其中支持物具有高于1.3的折射率和至少0.5mm、优选为至少3mm的厚度，其中该固体支持物具有相对于固定有捕捉分子的支持物表面为倾斜的两个面(S2和S3)，一个面(S2)是光学透明的并用于聚集从捕捉分子的局部区域发射的光，其与固体支持物表面相比倾斜90 60°的角度，另一个相对的面(S3)为黑色或涂覆有黑色或涂覆有具有与发射光波长对应的吸收作用的颜色。本发明还保护一种用于对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的设备，包括: a)流式芯片装置，包括:-流动通道，其截面在0.01与IOmm2之间且容积为VI，其中流动通道被配置成:弓丨入流动通道中的溶液经由流动通道循环；-检测室，与流动通道连接，该检测室具有固定在其一个表面上的微阵列，该微阵列含有多于4种的固定在该检测室表面的局部区域中的捕捉分子，其中该检测室具有低于Imm的高度且容积为V2，且其中V2/V1的比率在0.001与0.5之间；-至少2个，优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于与流动通道对应的不同位置，其中一个温度区包括检测室且具有允许目标多核苷酸分子杂交到捕捉分子上的温度；b)用于流式芯片装置的夹持器(holder)；c)加热系统，在至少两个不同温度区的前面；d)温度控制器，布置为调节至少2个不同温度区内的温度；e)任选的流式芯片传感器；f)照射灯源；g)操作地布置成经流动通道输送流体的系统；h)检测器，用于测量来自杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号，其中局部区域的发射表面在约0.1mm2和约75mm2之间,其中对于从具有杂交的目标多核苷酸分子的表面局部区域发出的荧光的检测，以禁止角之内的观测角通过载有固定的捕捉分子的光学透明固体支持物进行检定；
其中不同的部件整合到同一设备中，其中流式芯片装置相对于检测器的位置是固定的。
以下是对于本发明多种实施方式的说明，仅以实施例的方式并参考附图给出。这些附图没有按比例画出，仅意在用于说明目的。图1示出扩增目标物(GUT)在微阵列的对应捕捉探针上的杂交荧光信号随着扩增PCR循环增加的图表。使用在实施例1中描述的流式芯片装置进行PCR。目标物以100拷贝的量存在于溶液中。在PCR中还追踪两个对照:阴性捕捉探针(背景)和标记的捕捉探针(阳性检测对照)。图2示出校正局部背景之后的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的扩增目标DNA在微阵列的对应捕捉探针上的荧光信号随PCR循环进行而变化的图表。使用实施例2中描述的流式芯片装置进行多重PCR。图3a、3b示出扩增目标P35的DNA在微阵列的对应捕捉探针上的荧光信号随着PCR循环进行而变化的图 表。使用实施例3中描述的流式芯片装置进行PCR。图3a示出在不同PCR循环中得到的结合目标物P35的信号。具体地，图中示出给定点的像素的原始值和标准差以及其局部背景的原始值和标准差。图3b示出当通过扣除循环数3的图像并增加1500的补偿(使用Maxim DL5软件的“pixel math”功能)来校正各个循环的不同图像时的点的信号值和局部背景以及点的信号值及背景的标准差。图4a示出根据本发明的优选整合流式芯片装置I的示例图。装置的上侧包括布置在基部3中的流动通道2。流动通道2包括相互隔开以允许通过外部加热系统(未示出)在不同温度进行加热的四个不同温度区域4 (4a用于变性，4b和4c用于退火/杂交，4d用于延伸)。装置还包括泵口 5和通道与检测室之间的连接口 7。图4b示例性地示出装置I的底面的视图。装置I包括流动通道的两端，包括用于将通道连接到蠕动泵(未示出)以及用于引入样品溶液的端口 5。流动通道通过连接口 7与检测室6连接。微阵列8的捕捉分子固定在光学透明固体支持物9的表面上。整合流式芯片装置的设计在实施例4中描述。图5不出根据本发明的优选设备20的不例图。在图5b和5c中呈现不出加热系统11、其调控器和布置成经流动通道(泵)输送流体的系统的仪器放大图。设备20包括用于流式芯片装置I的夹持器(holder)10，包括上部12a和下部12b的加热系统11。上部和下部12a、12b由多个加热块13构成，在示例性实施方式中等于四，其位于流式芯片装置I的不同温度区域的前方，并固定在一起。加热系统的温度由温度控制器14调节。具有一个用于单独调控各个加热块13的温度的温度控制器14。流式芯片装置经由泵管16连接至蠕动泵15。流式芯片传感器21固定在泵管上，用于测量从气相到液相的流通。流式芯片仪器(F-RAP)也在实施例5中描述。图6a、6b分别示出流式芯片装置I的夹持器10的示意性顶视图和底视图。当位于仪器中时，检测室具有面向接收来自光源22的光照束17的方向的外光学块9面以及经狭缝面向检测器23以使微阵列面的激发光在光发射18的禁止角之内被检测到的侧面。图7a_7c示出根据本发明的优选检测室的示例图。图7a示例性地示出检测室的几何造型的前视图。图7b示例性地示出基于沿检测室纵轴的位置具有不同高度的检测室横向视图。图7c示例性地示出在连接口 7之间的检测室的液体流，其中端口 7a表示注射连接口，端口 7b表示输出连接口，且微阵列用附图标记8表示。微阵列侧的液体的流动方向通过附图标记19来表示。图8示出荧光信号演变的图表，当固定扩增子浓度的溶液在整合流体系统中循环时，荧光信号随着循环而积累。荧光信号用局部背景来校正。流式芯片整合设备的实施方式参考图4说明，且流式芯片仪器(F-RAP)的实施方式参考图5和图6说明。扩增子GUT和鲍曼不动杆菌(A.Baumanii)以两个不同的浓度引入流动装置杂交缓冲液中，且溶液经流动通道和检测室在PCR必需的不同温度区域之间而循环。在各个循环之后在微阵列上检测杂交。观察到不同浓度的两个扩增子的信号积累。实验在实施例6中说明。图9示出根据本发明用于使实时检测与PCR的不同循环在微流体系统中共同进行的方法的不同步骤的一般流程图。该一般流程图对应于实时PCR设备通过可编程计算机控制的实施方式(如实施例7所述)，并在本发明的文本中解释。图1Oa呈现示出用局部背景校正后的流感嗜血杆菌(H.1nfluenzae)扩增目标DNA在其对应的微阵列捕 捉探针上的荧光信号随着PCR循环演变的图。使用参考图4讨论的整合流式芯片装置以及参考图5和图6讨论的流式芯片仪器(F-RAP)来进行多重PCR。实验在实施例7中说明。图1Ob示出使用热电偶探头进行扩增循环计数的显示。箭头指示在哪个循环进行荧光信号的测量。从循环21开始，在每个循环进行信号检测。图11呈现示出PCR溶液体积对于局部背景校正后的流感嗜血杆菌的扩增目标DNA在其相应的微阵列捕捉探针上的荧光信号随着PCR循环的演变的作用的图。使用参考图4讨论的整合流式芯片装置以及参考图5和6讨论的流式芯片仪器(F-RAP)来进行多重PCR。包括检测室的流式装置总容积为240 μ L0实验在实施例8中进行描述。图12示出流式芯片装置I的优选检测室6的横向视图。检测室通过连接两个部件(例如通过焊接)而形成，一个部件为优选黑色的部件，流动通道盖在其上侧，并在底侧具有腔室，如图4a和4b所示，另一个部件为光学透明固体支持物(块)，其密封该腔室(参见图6b)。图12示出所形成的检测室6，在底部具有光学透明固体支持物9。微阵列8的捕捉分子固定在固体支持物的面SI上。表面S4面向其接收来自光源22的光照束17的方向。表面S2面向检测器23，从而在光发射18的禁止角内检测微阵列的激发光。固体支持物的表面S3为黑色或涂覆有黑色或涂覆有具有与发射光波长对应的吸收作用的颜色，该表面与表面S2相对。检测室的上部包括连接口 7以使检测室6与流动通道2 (未示出)之间流体连通。端口 7和流动通道2通过覆盖物(cover) 24 (可以为膜，优选为使装置隔热的透明膜)与外部隔开。
具体实施例方式定义除非另外定义，所有本文中使用的技术和科技术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。术语“核苷酸序列、微阵列、目标(和捕获)核苷酸序列、基本上结合、特异性杂交至、背景、定量”如在W097/27317中所描述的，其通过引用的方式合并入本文作为参考。
术语“核苷三磷酸、核苷酸、引物序列”如在欧洲专利申请EP1096024中所描述的，其通过引用的方式合并入本文作为参考。术语“基因”表示遗传的基本物理和功能单位，其携带从一代到下一代的信息；位于染色体特定位置上编码特定功能产物的DNA片段。DNA片段由转录区和使转录成为可能的调控序列(在编码DNA之前和之后的区域，以及外显子之间的内含子)组成。术语“基因座”表示基因序列上的单核苷酸多态性(SNP)的位置。“同源序列”表示在对应位置上具有高于单纯随机比对情况的一定比例的相同核苷酸的核苷酸序列。当考虑所要比较的两个序列之一中的增加或缺失(例如间隔)进行最优序列比对之后，在两个序列之间显示出由在各个位置找到的相同核苷酸相对于总核苷酸的百分比定义的最小同源性(或序列一致性)，则两个序列被认为是同源。同源性(或序列一致性)的程度可以大范围变化，因为同源序列可以仅在序列的一部分、一些部分或所有上同源。仅有一个碱基不同的核苷酸序列是高度同源的序列并被限定为单核苷酸多态性(SNP)。两个序列中相同的序列部分被称为是保守的。呈现出保守三维结构的蛋白结构域通常由同源序列编码，甚至经常是由唯一的外显子编码。在其序列中表现出高度恒定性(invariance)的序列被认为是高度保守，它们呈现出高度同源性。序列比对方法基于已经计算机化的局部同源性算法，并且是可得的，例如(但不限于)Clustal 、(丨ntelligenetics、Mountain Views、California)、或GAP 、BESTFIT Λ FASTA 和 TFASTA (Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group Madison, Wisconsin, USA) 5 Boxshade o术语“共有序列”是在比对多个被考虑的同源序列之后确定的序列(计算为碱基，其最常在进行比较的、进行比对的、同源序列中的各个位置上找到)。共有序列表示一种从所有比较 序列而言的尽可能接近的“平均”序列。对于高度同源序列，或者如果共有序列足够长且反应条件不很严格，其可以结合到所有同源序列上。这在使用称为共有引物的相同引物进行的同源序列扩增方面非常有用。在实验上，从以上程序计算出来的共有序列可以进行改变以获得这样的特性。“微阵列和阵列”表示其上固定有单种捕捉探针或捕捉探针种类以能够结合给定的特定目标物(优选为蛋白或核酸)的固体支持物。微阵列优先得自(但不限于):通过物理方法例如针(pin)或针环接触表面、或通过例如压力方法或纳米分配器(nanodispenser)方法释放溶液微滴而完成在基部上沉积捕捉分子。或者，在基部上原位合成捕捉分子是本发明的一种实施方式，(如由US-P-5，744，305和US-P-6，346，413提供的)在预定位置上合成空间分辨率低的寡核苷酸或多核苷酸。微阵列优选由沉积在表面的给定位置上或在固体支持物内或在覆盖固体支持物的基部上的捕捉探针的点(spot)构成。然而，捕捉探针可以以多种方式呈现在固体支持物上，不限于点。在附着有捕捉探针的固体表面上的点的空间分布优选但不限于几何顺序，例如正方形、长方形或甚至单排的点。微阵列应用的一种具体形式是捕捉探针存在于每孔具有一种或多种不同捕捉探针并为同一支持物的一部分的孔中。有利地，捕捉探针的微阵列也提供在不同的支持物上，只要不同支持物包括特定的捕捉探针并能相互区分以能够对特定目标序列进行定量。这是通过使用具有特定特征并能够从彼此中识别出以对结合的分子进行定量的珠(bead)混合物而实现的。术语“捕捉分子”涉及能够特异性结合至给定的多核苷酸或多肽或蛋白或其家族的分子。优选地，通过两个多核苷酸之间的碱基配对获得多核苷酸的结合，其中一个多核苷酸是固定的捕捉探针或捕捉序列，另一多核苷酸是要检测的目标分子(序列)。术语“入射角”是指入射到表面的方向与在入射点垂直于表面的线(称为法线)之间的角度。在本发明中，入射角被认为是在支持物内部，因为检测到发射的光通过支持物。本发明中的术语“临界角”是支持物中的基于固体支持物表面相对于法线的角度(以度数给出)，由Θ fsirT1 (η2/ηι)定义，其中，ηι是固体支持物的反射系数且n2是外部的反射系数。在本发明中，n2优选为水溶液(n2为约1.33)。临界角是在支持物中发生全内反射时的入射角的值。临界角可以以相同的方式进行计算和以弧度表示。术语“观测角”(Θ obin)是用于观察支持物中的发射光的角度，并表示为基于承载目标分子的固体支持物表面相对于支持物中的法线。术语“ Θ obout”是对于位于支持物外部的检测装置而言相对于透明光学块侧面的法线的观测角。本发明的“禁止角”是对于与来自给定溶液且被检测到通过给定支持物的发射光对应的波长的光束而言的角，在临界角与90°之间。术语“倏逝波稱合”或“倏逝稱合”(evanescent coupling)是一种方法,通过该方法，电磁波以瞬逝(或衰减)电磁场的方式从一种介质传递到另一介质。以其通常的含义，术语“倏逝场”或“倏逝波”是指在入射光源所照射的全内反射界面的远侧产生的以指数方式衰减的电磁场。倏逝波给出与全内反射的入射光的波长的能量相同的激发能。该能量使得固定在发生全内反射的表面上的分子激发(诱发的倏逝)。倏逝场从界面的远极面传播，显著能量仅持续比较短的距离(例如，以其波长的数量级)。术语“ 发出的倏逝”(emittedevanescence)或“逆倏逝”(reverse evanescence)是所诱发的倏逝的逆过程，即，从距离全反射面的远侧(在支持物外部)特别近(在一个或数个波长之内)的物体发射的光被传播到近侧(在支持物内部)的过程。术语“光学透明支持物”是指具有让光以非常低的吸收率传导并不对光束的均匀性造成影响的特征的支持物。优选地，“光学透明支持物”是指允许至少90%、优选至少95%和甚至更优选至少99%的光透过的支持物。常规的光透明支持物由高等质量的玻璃或材料例如Zeonex或Topas制得。荧光标记包括结合到扩增产物中的经荧光标记的核苷酸。这是通过使用荧光标记的核酸引物或标记的脱氧核苷酸来实现的。荧光标记也包括插入荧光染料例如SYBRGreen0术语“实时PCR”是指允许在PCR循环过程中对扩增子的存在进行检测和/或定量的方法。在实时PCR中，在至少一个扩增循环中检测和/或定量扩增子的存在。PCR循环过程中扩增子或与扩增子的形成量相关的信号的增加被用来对PCR溶液中的指定核苷酸序列进行检测和/或定量。本发明中的术语“扩增子”涉及作为酶促核酸扩增产物的目标多核苷酸分子拷贝。“生物学目标分子”是指参与生物过程的分子。目标分子限于核酸。本发明提出一种全溶液，用于在完全自动的封闭装置中对多种多核苷酸进行快速的实时扩增和在线检测和/或定量。本发明通过对共同工作的系统的不同部件给出详述并通过具有固定化捕捉分子的检测室的特定特征来解决问题。本发明最好在与如下装置相适的仪器中进行，该设备包括不同特征并控制用于在该装置中进行检定的具体参数。这样的仪器通过合适的软件加以控制，该软件将检定所需的测量与数据分析和/或对存在于溶液中的目标物的定量相结合。该方法和装置用于可能的多种目标物的检测。“可能的”是指当它们存在于样品中时，检定可以检测出它们。然而，在最常见的情况中，仅有一种或有限数量的目标物存在于指定样品中。当目标物存在于指定样品中时，该方法和装置检测出一种、更好地为至少4种、更好地为多于10种的不同目标物。总体检定以非�？斓姆绞浇校桓隼┰鲅方猩儆�3分钟，优选少于2分钟，甚至少于I分钟，这样，35个循环的典型扩增/检测实验可在105分钟内，甚至在70分钟内，更好地在35分钟内进行。在如此复杂的检定中，检定的速度是出人预料的，因为用于检测所扩增目标物的杂交的时间非常短，优选为一个循环少于I分钟，或甚至少于30秒、或者更好地为少于20秒。通常而言，时间将会是约2秒以上，优选为5秒以上。如在实施例4中对具有约240 μ L容量的流式装置所示例的，50 μ L溶液在微阵列检测室中流通的时间约为每循环16秒。在静态微阵列中，用于微阵列的常规杂交时间通常长于数个小时，比如在标准的操作规程中为14 16小时(Ideker et al2002, Hybridization andpost-hybridization washing, in “DNA Microarrays，，D.Bowtell and J.Sambrook, coldspring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, New York.Pg228-239)。通过基于混沌混合器的动态杂交来加强反应，其使得微阵列杂交的速度和信号强度与静态杂交相比有所改善(McQuain 等人,2004, Analytical Biochemistry, 325, 215-226)。然而，即使使用动态杂交，所需的时间为I小时甚至更长，在流通式检定(flow through assay)中为5 20分钟的级别(Mocanu et al2008, Anal.Biochem.，380，84-90)。该特征使得本检定非常有竞争力，快速PCR与检测一起在溶液中进行，由于使用含多种捕捉探针的微阵列，其优势在于多种目标物的实时扩增/检测。这些得益于本发明中提议作为完整解决方案的一部分的总体特征。反应时间短的一个特征是，因为微阵列是流式系统的一部分，全部溶液在各个循环均经过相同的微阵列。·而且优选检测室的容量是有限的，且优选配置成含有在I μ L和ImL之间的溶液容量，优选为I 20 μ L之间，更优选I 10 μ L之间。优选地，反应室的高度低于1mm，优选低于250 μ m。在检测室的检测部中的液体高度优选在10 250 μ m之间，优选在50 150μπι之间。同时，流式装置的不同固体部件保持在指定温度下。仅有体积有限的溶液随循环被加热和冷却，得到快速的扩增循环。具有短的杂交时间有意料之外的优点，其可以以小的溶液体积工作。当根据不同扩增步骤所需的温度而从一个区域移动到另一区域时，小体积容易加热或冷却，因为其热容低。同时，小体积使得可以从样品中取得目标物以溶于浓缩的溶液，从而增加方法的灵敏性。样品稀释成大体积将增加杂交的时间，但是如上所述，这是不必需的。本发明的另一优点是，检测被完全整合到连续的过程中。没有特殊的单独的杂交步骤，其如同在现有技术中描述的逐步的PCR/微阵列需要操作装置和时间。本方法使得目标物累积，以在溶液与捕捉分子接触的各个循环中在微阵列上杂交。意料之外的是，即使在相当高的杂交温度下、以及当液相被移除使得捕捉探针成为气态时，所杂交的目标物在它们的捕捉分子上仍是稳定的。在没有溶液停留在相当高的温度下之后，在下一循环中捕捉分子也依然能够以非常有效的方式固定目标物。本发明的一个特征是所杂交的扩增子随着扩增循环而积聚到特定点，因为多个扩增循环共用同一微阵列表面。选择温度和溶液组成，以有利于指定目标扩增子特异性杂交到存在于微阵列的指定离散区域(点)中的特定捕捉分子。溶液组成对有利于或不利于指定多核苷酸序列杂交到另一多核苷酸序列上的影响包括溶液的严格度(stringency)或特定化合物例如尿素或清洁剂(detergent)的存在。条件最好选择为可以进行杂交而不除去连续循环之间的杂交扩增子，以在特定点积聚杂交的扩增子，并因此增加方法的检测灵敏性。该特征使得本方法特别灵敏，即使在溶液与捕捉分子之间的接触时间很短时也如此。解决的另一与PCR相关的问题是，在变性步骤中于高温下在加热过程中形成泡(bubble),以及因流体方法的不同相的温度变化而引起的压力变化。在本发明中，整个系统优选以两个相存在，优选为液相和气相。形成的泡大多数进入气相而不干扰液相，从而使得所有点的杂交均匀。而且，因高温下液体膨胀引起的压力增加通过气相的存在得到缓解。在优选的实施方式中，本发明还通过提供用于检测溶液位置或存在或其流动或液/气相转变的芯片传感器并由此可以对在溶液的存在下或在气相中的阵列的检测时间进行控制，从而来解决位置随时间变化的具有两相的流体的异质性的问题。分析传感器信号以检测与液体的存在或移动或流动相关的变化，优选对溶液前或后的流动和/或流通中的相转变的检测。对于液体在检测室中出现的时点(timing)优选从对不同参数(包括传感器在流式芯片上的位置、信号变化的时机和液体的流动速率)的分析中推断。液体的体积用来确定在检测室中出现液 体的持续时间。流体的速度检测的实例示于GB2433259中，使用在紫外线照射流动通道下的DNA吸收。而且，传感器使得可以通过确定在与传感器位置处的液体流通相关联的传感器中随时间记录的变化数来对循环数进行计数。优选地，液体到气体的相转变的次数与循环数对应。如果必要的话，通过第一标准化的数据处理，在计算中引入矫正。对循环计数允许提供点值与扩增循环之间的关系，这是实时扩增和/或定量的一个要求。优选地，通过将与目标物检测对应的点值表达为扩增循环的函数来进行目标物的定量。在优选的实施方式中，在气相中测量来自杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号，因为其可能降低溶液的背景信号。在可替换的实施方式中，在含有标记的目标多核苷酸分子的扩增溶液的存在下，对来自杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号进行检测。在具有均匀相的溶液的存在下的杂交目标物检定给出局部区域的比较信号。优选地，在均匀溶液相的存在下进行检测。另一个意料之外的结果是，可以在循环的过程中在含有高含量的在扩增过程中并入或结合到目标物的荧光染料标记的溶液的存在下获得扩增目标物的检测。本发明的一个意料之外的结果是探针的极高稳定性。该稳定性在图1中示例，其中检测对照点的信号随着循环非常稳定，即使它们受到导致一定程度变白的多种连续光照。基于该特征，这种方法明显地不同于现有技术(RAP技术)。检测对照的稳定性是对捕捉分子在过程中的稳定性的清晰指示，并证实对于不同捕捉分子获得的信号的定量比较分析是合理的。微阵列的一个具体问题是，为使结果与存在于微阵列的不同位置中的不同捕捉分子相关，所有具有固定化捕捉分子的点或局部区域必须在方法的所有步骤中以相同方式处理。本发明解决与液体在微阵列上连续流通相关的问题。优选地，在各个扩增循环中，液体与不同局部区域接触相同的时间，从而使得对于所有点对于各个循环有相同的杂交时间。优选地，从位于微阵列表面上的不同位置的重复点得到的信号的标准差低于测试值的20%，甚至低于10%。优选进行一次光学块相对于检测器的定位(之后可以在一段时间内检查一次，例如每个月内检测一次；或者，如果预期到更多的变化，每个流式芯片一次，或者之间的任何时间)，以获得微阵列的最好表面分辨率。具有捕捉分子的光学块的厚度优选为至少0.5mm,优选为1mm，更优选为3mm以上，甚至约5mm以上。本发明具有未预料到的优点，即，允许光学块较厚，从而使得以禁止角检测比使用薄的光学块时更加容易。给定检测室的固定温度，这是可能的。通常而言，厚度将小于20mm，优选为小于10mm。未预想到的另一特征是检测系统相对于所要检测的具有不同捕捉分子的局部区域的表面的位置稳定性。该物理稳定性引起微阵列表面随循环进行而具有的图像，其完全地相互重叠，具有相同的几何关系，这样，点处于相同位置且容易对不同图像进行比较和分析。在一个优选实施方式中，在拍摄的第一张图像上进行一次微阵列图像的网格化(gridding)，之后相同的网格被用于接下来的图像，从而可以完全地进行比对。这使得可以避免同一实验中对于不同图像的不同网格化和在数据比较中的困难。同时，图像容易叠加或进行扣除，而无需像素定位的复杂矫正。本发明的附带特征是，液体经由封闭系统的流动通道和微阵列而循环。封闭系统具有防止扩增产物在周围环境中被污染的优点，并防止对于其它检定的污染。完成检定后，将整个装置从仪器中移除并原样丢弃而无需打开。然而，如果需要的话，进行进一步的关于杂交目标物在其捕捉分子上的存在情况的读�。缬糜诩於ǖ目刂苹蛑な怠＜觳馐液土魍�(flux)在装置和方法的具体实施方式
中，检测室具有选自椭圆形、卵形、长斜方形、六边形、八边形、菱形的形状。检测室被配置为产生液体流到微阵列的均匀重分配。具体地，检测室的几何形状考虑液体的通 量、检测室的高度及其长宽比，用于将检测室设计为使得流入液体均匀分布到微阵列表面上、并且还使流出液体从检测室中均匀去除从而在气相流经检测室的过程中没有液体留在检测室中。检测室被配置成，考虑微通道中的液体相对于检测室主方向的角度、液体的流速、检测室的高度和检测室表面的亲水性/疏水性。当检测室表面高度亲水时，溶液平稳并快速地流到检测室中而不产生气泡。最好通过固体表面上的溶液-气体界面的接触角来测量亲水性/疏水性。带有微阵列的检测室的表面具有优选为低于100°的接触角，更优选低于80°，更优选低于60°。检测室的优选几何形状呈现在图7a中。优选地，对于指定的检测室、和具有特定疏水特性和指定流动速率的微阵列表面，调整检测室的宽度和液体的高度，以获得沿着检测室的宽度向前均匀分布的液体/气体，如图7b所示。在优选实施方式中，检测室内部的流入方向最好是相对于检测室纵轴为0°，且检测室的侧边相对于液体流为对称的。在另一优选实施方式中，检测室的注入部的高度被调整从而具有与检测室内部的截面相等的截面，如图7c中所示。在某些实施方式中，检测室具有线圈形状或者直的通道状形式。在具体实施方式
中，微阵列为分布在通道内部的线性阵列。优选地，当进入检测室相同时间时，所有局部区域被溶液覆盖。而且，优选各个局部区域上的液体流相同，或者从一个局部区域到另一局部区域的变化不多于20%，更好为不多于10%。重复点值的再现性是控制流动室中的液体均匀重分配的最佳方式。优选重复点值在扩增循环中的变化不多于20%，更优选不多于10%。在具体的实施方式中，在检测室中的流体是层流(laminar flow),且流体的雷诺数(ReynoId number)低于区分层流与瑞流的固定值。更精确地，雷诺数低于约2300。在另一实施方式中，流式芯片装置配置成含有在20μ L和2mL之间的溶液体积。通过反复地使溶液流经流动通道，获得溶液的循环。扩增溶液在流式芯片装置的温度区域之间单向或双向输送。在某些实施方式中，以环形方式(单向)(图4)或来回方式(双向)在温度区域之间输送扩增溶液。存在多种经通道输送溶液的方法。输送是主动输送(例如通过施加压力)，或者是被动输送(例如，通过毛细管力驱动的扩散或输送)。因此，当扩增溶液流经温度区域时，这意味着主动以及被动地在区域中输送。本文中的输送系统是，例如固有地包含在流式芯片装置中的被动系统，例如，输送仅基于物理作用例如对流或扩散的输送的情况。微流体装置中的主动输送依赖于两种方式的流体输送中的一种:压力驱动或电动驱动的流动。电动输送是指电渗和电泳输送的结合。电渗是指，由外部施加的电场引起的水性溶液经静态固体表面大量移动。电渗需要在固-液界面处存在带电双层。电泳描述 在所施加电场的作用下，浸在流体中的带电表面的移动。优选地，通过使用压力驱动流反复地使溶液经流动通道输送来获得溶液在流式芯片装置中的循环，其中压力驱动流包括但不限于泵、压缩元件的作用、磁珠的使用等或其组
口 ο优选泵是具有I和500rpm之间的转速的蠕动泵。液体流在流动通道中的速率优选在6 μ L/min和3000 μ L/min之间，优选在50和500 μ L/min之间。在另一具体实施方式
中，液体流的速率随着实验的时间和液体在流式装置中的位置而变化。对液体流做出调整，以获得液体与区域之间指定时间的接触，以调节对于扩增过程最优的给定温度的时间用于PCR变性、退火和延伸的温度步骤。在具体的实施方式中，在扩增的特定循环中，液体流停在流式装置的特定区域持续给定的时间。在PCR中，液体在第一循环中在变性区停留给定时间，以获得用于起始第一退火步骤所需的基因组DNA的适当变性。在另一特定实施方式中，检测室处于与退火区域相同的温度下，于是被认为是PCR循环的退火步骤的一部分。与扩增溶液接触的流式芯片的表面优选涂覆有封闭剂以降低表面对目标DNA以及PCR试剂(引物、dNTP、DNA聚合酶)的亲和性。封闭剂优选选自:吐温型(Tween-type)表面活性剂(聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、聚(氧代-1，2-乙烷二基)衍生物、吐温)、Triton X-100 (聚乙二醇对-(1，1，3，3-四甲基丁基)-苯基醚、(辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚、Mono30、TX-100、叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇、辛基酚聚醚-9)、聚乙二醇(PEG)和血清白蛋白(人血清白蛋白、牛血清白蛋白或BSA)。吐温型表面活性剂(聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、聚(氧代-1，2-乙烷二基)衍生物、吐温)是水溶的非离子聚合清洁剂，由得自六元醇、烯化氧和脂肪酸的复合酯和酯醚构成，通过将聚氧乙烯链加至山梨醇以及得自山梨醇的己糖醇酐(己糖醇酐和己糖二酐)的羟基上并用常用脂肪酸例如月桂酸、棕榈酸、硬脂酸和油酸进行部分酯化。在一个实施方式中，吐温型表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温60或吐温80(在药物领域也称为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60和聚山梨醇酯80)中的一种或多种。聚山梨醇酯20 (聚氧乙基化的脱水山梨醇单月桂酸酯)是月桂酸酯，聚山梨醇酯60 (聚氧乙基化的脱水山梨醇单硬脂酸酯)是硬脂酸酯和棕榈酸酯的混合物；以及聚山梨醇酯80 (聚氧乙基化的脱水山梨醇单油酸酯)是油酸酯。这样的吐温型表面活性剂市售可得和/或可以通过领域内已知的技术制备得到。在优选的实施方式中，吐温型表面活性剂是聚氧乙基化的脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨糖醇20，吐温20)。封闭剂的浓度优选在0.0I 2%之间。优选以0.01% 0.05%的浓度进行涂覆，但不限于蛋白质例如BSA (牛血清白蛋白)用作涂覆剂。高分子量分子例如PEG (聚乙二醇)也以0.05% 2%的浓度用作涂覆剂。当以约0.1%的浓度使用时，清洁剂例如吐温20或Triton XlOO具有涂覆作用。
在优选的实施方式中，封闭剂是用于多核苷酸分子扩增的试剂的一部分，该封闭剂优选选自吐温型表面活性剂、Triton X-100、PEG和血清白蛋白。或者，使用封闭剂的预涂覆在扩增之前进行。封闭溶液经流式芯片装置的流动通道和反应室而循环。在一个实施方式中，在扩增之前，与溶液接触的流式芯片的表面进行I 90分钟的预涂覆，其中封闭剂选自:吐温型表面活性剂、Triton X-100、PEG和血清白蛋白。在另一替换实施方式中，流动通道和流式芯片可以被流式芯片的制造商进行预处理，且流式芯片可以被递送为待用。在具体实施方式
中，本发明涵盖一种检定微流体装置内的相变用于跟踪实时PCR循环的方法，包括以下步骤:a)提供流式芯片装置，包括-流动通道，具有在0.01与IOmm2之间的截面且容积为VI，其中流动通道被配置成:引入流动通道中的溶液经由流动通道循环；-检测室，与流动通道流体连通，该检测室具有光学透明固体支持物，该透明固体支持物包含至少一种固定在透明固体支持物表面的局部区域中的捕捉分子，其中该检测室具有低于Imm的闻度和容积V2 ；-至少2个，优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于流动通道的不同位置，其中一个温度区包括检测室且具有使目标多核苷酸分子杂交到捕捉分子上的温度；b)流式芯片传感器，用于检测液体/空气和/或空气/液体的相变；c)将体积为V3且含有目标多核苷酸分子的溶液引入到流动通道和用于多核苷酸分子扩增的试剂，其中V3/ (V1+V2)比率高于0.02并低于I (从而空气存在于溶液周边的装置中)；d)将溶液进行至少5个扩增循环，以获得标记的目标多核苷酸分子，其中通过将溶液经过流动通道和相同检测室在不同温度区之间循环，从而得到一个扩增循环，其中扩增循环进行少于3分钟；e)通过流式芯片传感器的数据分析来确定扩增循环；f)通过检测从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出且在通过光束使荧光染料激发之后测量到的荧光，从而在至少3个、优选为至少5个不同的扩增循环中从杂交的目标多核苷酸分子中测量不同扩增循环中的荧光信号；g)分析随着扩增循环从局部区域得到的信号值，以对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。具体的应用还包括检测室中的微阵列，该微阵列包含多于4种、优选为多于20种被固定在固体支持物的表面的局部区域中的捕捉分子。扩增溶液优选地在流动通道有两相，即气相和液相。在具体的实施方式中，流式系统的两相由扩增的水类溶液以及油相构成。V2/V1比率优选在0.001 0.5之间，更优选在
0.01 0.1之间。出乎意料的是，当流式芯片装置近乎完全填充有扩增溶液(V3)时，与使用小体积的情况相比，在较早的循环中检测到目标扩增子，如图11中所示。优选地，气相留在封闭装置中，即使其非常少。气相的存在使得可以从一个循环到另一循环对液体进行物理分离，以及通过在各个循环中检测相转变的传感器对扩增循环进行简单计数。在优选的实施方式中，V3/ (V1+V2)比率高于0.5，优选高于0.75，甚至高于0.9并低于I。V3/ (V1+V2)比率低于I意味着优选低于0.999，优选低于0.99，例如0.95以下。在优选实施方式中，液体流动随时间是恒定的，通过对流动通道中液相位置的时间控制，流动通道和/或检测室中的扩增`溶液(液相)的位置是已知的。优选地，根据在流动通道的至少一个位置得到的信号测量，根据气/液相变来得知液相位置，该测量由温度变化、荧光信号变化、电信号、发光或光吸收变化获得。扩增在方法和装置的具体实施方式
中，多核苷酸分子扩增必需的至少一种试剂被固定在流动通道和/或检测室内，从而当溶液经温度区域输送时，试剂与目标多核苷酸分子接触。有利地，通过已知的扩增规程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环状探针技术(CPT)、核酸序列依赖型扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、自主序列复制(3SR)、解链酶扩增(HAD)，从而获得用在本发明的方法中的扩增。扩增方法还细分为两类:热循环法(PCR、LCR)和恒温法(CPT、NASBA, SDA、LAMP、3SR、HAD)。同时，根据本发明的方法或在根据本发明的装置/设备中进行这些扩增方法的变型的应用，例如反转录PCR、实时PCR、不对称PCR、或热启动PCR。优选地，通过PCR进行扩增，且扩增溶液包括DNA聚合酶和基本与目标多核苷酸分子互补的引物。在优选的实施方式中，通过包括变性、退火和延伸步骤的PCR获得扩增。优选地，在将溶液进行扩增循环的步骤之前，溶液先进行多于I分钟，优选为多于2分钟，甚至多于4分钟的变性步骤。优选地，扩增循环需要4个不同的温度步骤:变性、退火、杂交和延伸。
在可替换的实施方式中，扩增循环包括3个温度步骤:变性、退火/杂交和延伸。在该实施方式中，退火步骤在与杂交步骤相同的温度下进行。优选地，退火步骤在检测室中进行，且退火和杂交步骤在相同的温度区中进行。在另一具体的实施方式中，扩增循环包括2个温度步骤:变性和退火/杂交/延伸。在这个具体实施方式
中，退火和延伸步骤在与杂交步骤相同的温度下进行。优选地，退火和延伸步骤在检测室中进行，且退火、延伸和杂交步骤在相同的温度区域中进行。优选地，用于多核苷酸分子扩增的试剂包括引物、dNTP、热稳定DNA聚合酶和缓冲液。优选地，引物和/或dNTP包括荧光染料标记的扩增前体以形成标记的目标物。优选地，通过引入荧光染料标记的扩增前体，使得(扩增的)标记目标多核苷酸分子被荧光标记。优选地，扩增前体的荧光染料包括Alexa衍生物、氨基香豆素、CY3、CY5、CY7、荧光素、若丹明、德克萨斯红(Texas Red),Pacific Blue染料、Pacific Orange染料、藻红蛋白衍生物、青色素衍生物、吖啶衍生物、或香豆素衍生物。在可替换的实施方式中，通过在双螺旋中引入插入染料，将(扩增的)标记的目标多核苷酸分子进行荧光标记，引起荧光增加。在具体的实施方式中，用于多核苷酸分子扩增的试剂包括插入荧光染料，优选选自SYBR Green、溴化乙锭、吖啶橙、SYTOX Blue。在优选的实施方式中，目标多核苷酸分子(有机体或部分有机体中特定的核苷酸序列)是DNA核苷酸序列。在可替换的实施方式中，目标多核苷酸分子是PCR之前反转录为cDNA的mRNA。在具体的实施方式中，本发明的方法包括从生物有机体或部分有机体中提取该有机体特异性的核苷酸序列的步骤。缓冲剂优 选包括由阳离子和阴离子构成的盐，其中该阴离子具有两个羧酸基和一个氨基，其中在组合物中的盐浓度在IOmM和400mM之间，并为消泡剂(exclusion agent)的I重量％ 20重量％。阴尚子优选为谷氨酸根。优选地，用于多核苷酸分子扩增的试剂包括热启动系统。获得热启动系统的一个特定方法是通过将至少一种PCR试剂物理地分离到流式芯片装置中。或者，通过使用热启动Taq聚合酶来获得热启动系统。 在另一实施方式中，至少一个PCR循环包括热稳定DNA聚合酶的使用，其中热稳定DNA聚合酶在盐中浓度为25 300mM时具有活性。优选的盐是谷氨酸钾、氯化钾和氯化钠。聚合酶优选为Thermus aquaticus DNA聚合酶。热稳定是指在一个PCR循环之后仍保持其初始活性的至少50%。在盐中有活性(在盐中的浓度在25和300mM之间)是指，与其在低于25mM的盐溶液中的活性相比，表现出优选为其活性的至少5%、优选为至少20%、更优选至少50%的活性的酶。在本发明的优选实施方式中，使用从扩增开始就存在的加尾引物和第二引物，对加尾引物没有任何破坏。该方法需要使用合适比率的加尾引物与第二引物，前者比后者低至少5倍，优选低10倍。本发明的方法完全适用于自动化的在微阵列上进行的多重实时PCR反应。根据存在于微阵列上的固定化捕捉分子的数量，要检测的目标物的数量非常大。在一个实施方式中，微阵列与用于进行一种或多种多核苷酸目标分子的扩增的试剂相接触。在优选实施方式中，在相同检定中对存在于溶液中的I 4种目标多核苷酸分子，优选为I 10种目标多核苷酸分子，更优选I 20种目标多核苷酸分子进行扩增和检
测和/或定量。在另一实施方式中，优选在同一检定中对存在于溶液中的至少2种以上、更优选3种以上、甚至更优选4种以上的目标多核苷酸进行扩增和/或定量。在另一个实施方式中，在同一检定中对存在于溶液中的20 1000种目标多核苷酸分子进行扩增和检测和/或定量。本发明还适用于DNA甲基化的检定，特别是在Cp-G 二核苷酸中发现的胞嘧啶-5DNA甲基化。在具体的检定中，首先用重亚硫酸盐处理DNA，以将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。基于完全匹配相对于错配引物的退火的差异，在PCR扩增的水平上进行序列识别(参见Eads et al., 2000Nucleic Acids Res28, e33，并入作为参考)。在另一具体方法中，使用匹配胞嘧啶的探针和另一匹配尿嘧啶的探针，在固定于阵列上的探针的水平上获得识别。在引物扩增两种序列的情况下，根据匹配或不匹配扩增子的存在，从2种探针的不同信号强度获得辨别。本发明也特别适用于向DNA或RNA序列中辨别SNP。在具体的实施方式中，基于对固定在完全匹配探针或非匹配探针上的扩增子的解离温度的差别的检定，确定扩增子中突变或缺失的存在。优选通过逐渐加热杂交室区域并记录匹配和非匹配探针的信号，来获得解离温度的差异。 随温度而变的解离速率和/或信号值的差异将指示出溶液中相对于不匹配序列存在完全匹配序列。如果在指定温度得到完全匹配与错配信号之间的至少4种、更好为10种、甚至更好为20种的差异，则算得到较好结论。微阵列根据方法和装置的微阵列优选是，以每cm2包含多于4种、优选多于10种、多于20种、甚至多于50种捕捉分子的微阵列形式具有固定在固体支持物的特定局部区域上的捕捉分子的低或中密度微阵列。局部区域的表面优选在10 μ m2和Imm2之间，优选在I μ m2和100 μ m2之间。微阵列优选包括4 100000种捕捉分子，优选多于10，更优选多于20。优选地，微阵列包含约1000种以下捕捉探针，更优选200以下捕捉探针，例如12、25、40、80或160。微阵列的密度优选在每cm2为4 100000个点，优选为每cm2为10 1000个点，各个点为对于一个捕捉分子的定位区。固定在支持物上的捕捉分子的量优选在每cm220和2000fmole 之间。微阵列的表面优选为0.1 IOcm2,更优选在0.2和4cm2之间，甚至更优选为0.5和2 cm2之间。在优选的实施方式中，微阵列是2D阵列或线阵列。捕捉分子优选具有间隔部(spacer portion)和捕捉部。仅捕捉分子的捕捉部是对扩增子特异的。捕捉分子以间隔部位于固体支持物与捕捉部之间的方式固定到固体支持物。优选地，捕捉分子的捕捉部通过长至少6.Snm的间隔部与固体支持物的表面隔开，其优选长度为至少20个核苷酸的序列，优选为多于40个核苷酸的序列长，更优选为至少90个核苷酸的序列长，且在约20和约120个碱基之间。间隔部最好是核苷酸序列，且间隔部的远端的核苷酸被用于将捕捉分子结合至固体支持物。出于该目的，间隔部远端的核苷酸有氨基，其与存在于预处理的固体支持物的表面上的例如环氧基或醛基等形成共价键。捕捉分子在支持物表面上的固定化的化学关系必须足够稳定以承受扩增所需的温度压力。在扩增过程中或之后控制捕捉分子在支持物上的保留率的方法为，将荧光标记的捕捉分子的阳性检测对照弓丨入到微阵列中。在具体的实施方式中，微阵列包括荧光标记的捕捉分子(阳性检测对照)，其在扩增的循环35中保持高于50%的荧光，优选为高于80%，甚至更优选高于90%(与循环I相比)。捕捉分子的捕捉部包含对在PCR过程中所产生的扩增子特异的优选为10 100个的核苷酸，优选为15 40个核苷酸,更优选为20 30个核苷酸。优选地，捕捉分子的捕捉部在10和600个碱基之间，优选在20 50个碱基之间，更优选在15 40个碱基之间。在具体的实施方式中，捕捉分子包括与扩增子的特定序列互补的10 100个核苷酸的捕捉部，从而该捕捉部定义扩增子的两个非互补端以及具有至少20个核苷酸的间隔部，其中扩增子的两个非互补端分别包括间隔端和非间隔端，从而间隔端与捕捉分子的间隔部不互补，该间隔端超过该非间隔端至少50个碱基。在优选的实施方式中，通过监控微阵列的不同位置的信号来对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行识别和/或定量，其中在至少两个循环的扩增过程中在每个位置进行至少两次测量。接下来处理数据。在另一实施方式中，对有机体特异的扩增子杂交到至捕捉分子，在预定位置形成一处点信号，其中该单点信号的检测使得可以从来源于其他有机体的其他同源扩增子中辨别出特定扩增子。标记和检测丨
通过一系列所描述的方法(但不限于以下所呈现的这些)，来检测杂交的目标物，只要它们与PCR给出的限制(constraint)相容。已经提出，非标记方法可用于微阵列，其是基于通过适用于微阵列的质谱进行的目标物识别(美国专利第5，821，060号，其通过引用的方式全文并入本文)。标记相关的检测方法有很多。对不同标记分子的回顾在W097/27317中给出，其通过引用的方式全文并入本文。使用已经被标记的引物、或者通过在复制或扩增步骤中酶促引入标记的核苷酸、或者通过插入剂(intercalating agent)之后进行突光检测来得到标记分子(W097/27329，其通过引用的方式全部合并入本文)。最常用的标签是突光染料,例如适合于使用微阵列扫描仪(General Scanning,Genetic Microsystem)来分析微阵列的Cy3、Cy5和Cy7。使用突光、比色、扩散、电致发光、生物发光或化学发光、磁、电类阻抗法或伏安法(参见美国专利第5，312，527，其通过引用的方式全部并入本文)、或放射检测来检测微阵列上的目标物固定的所得信号。优选的标签是荧光检测器可高灵敏度检测到的荧光染料。荧光染料包括但不限于适合于使用市售可得的微阵列扫描仪(例如，从General Scanning, Genetic Microsystem可得到)来分析微阵列的花青染料(Cy3、Cy5和Cy7)。优选地，对于Cy3的激发波长为约540和558nm之间，峰值在550nm，发射波长在约562和580nm之间，峰值在570nm。优选地，对于Cy5的激发波长在约639和659nm之间，峰值在649nm，发射波长在约665和685nm之间，峰值在670nm。优选地，对于Cy7的激发波长为约733和753nm之间，峰值在743nm，发射波长在约757和777nm之间，峰值在767nm。也可以通过化学反应例如带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)基团的荧光染料与目标物的氨基之间的反应将荧光染料引入目标物中。本发明中其他可用的荧光染料包括花青染料、荧光素、德克萨斯红、若丹明、绿色荧光蛋白。教导这些标签的使用的专利包括美国专利第 3，817，837,3, 850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149 和 4，366，241 号。在本发明的优选实施方式中，与捕捉分子上存在扩增子相关的荧光信号的检测涉及微阵列上相对于溶液中的荧光的信号增加。在具体实施方式
中，对存在于微阵列上的荧光染料的检测的差异是基于，与结合分子杂交到捕捉分子上作为DNA双螺旋相关的荧光染料的各向异性相对于溶液中游离分子的差异。各向异性取决于将要检测的荧光染料的流动性和使用寿命。对微阵列上的各向异性的检定方法现在可从得自BlueshiftBiotechnologies Inc.,238East Caribbean Drive,Sunnyvale, Calif.94089(http://www.blueshiftbiotech.com/dynamicf1.html)。优选的检测方法基于禁止角的使用来辨别由表面发射的荧光(结合的目标物)和溶液中(游离目标物)存在的荧光。
优选地，对从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发射的荧光进行检测是以观测角通过承载固定化捕捉分子的光学透明固体支持物来检定的，其中观测角在禁止角内。在优选的实施方式中，相对于表面的法线以观测角Θ obin在禁止角内检测信号，使得90° > 0obin>sin-l(n2/nl)，其中光学透明的固体支持物具有折射率nl，并与具有折射率n2的溶液接触，其中nl>n2。优选地，观测角在临界角加10°，优选加5°，更优选加3°的范围内。另一个用于辨别从表面(结合的目标物)发出的荧光和溶液(游离目标物)中存在的荧光的具体检测方法为倏逝场。在这样的具体实施方式
中，当照射具有杂交的目标多核苷酸的表面引发倏逝场之后，对从局部区域发出的荧光进行检测。使用倏逝场的检测在例如美国专利申请第11/526，159中有过描述。本文中的“倏逝场”或“倏逝波”以其通常所理解的意义进行使用，即，是指在被入射光源照射的全内反射面的远端产生的以指数方式衰减的电磁场。通常而言，倏逝波的激发能与发生全内反射的入射光的波长的能量相同。常规而言，倏逝场从界面的远端面传播，其显著的能量仅持续比较短的距离(例如，以其波长的量级)。优选如下方式照射，从而在其上固定有捕捉分子的固体支持物的表面上得到全内反射荧光(TIRF)和均匀的倏逝场。优选地，激发光源(I)产生倏逝场。倏逝场优选是由照射固体支持物的表面的入射光源产生，其中入射角在约60° 90°之间。倏逝场激发被标记扩增子的标签，且通过检测器检测所发出的信号。另一个用来辨别从表面(结合的目标物)发出的荧光和溶液(游离目标物)中存在的荧光的可替换检测方法，是基于聚焦于表面上的照射和/或检测。在这样的实施方式中，当在具有杂交的目标多核苷酸的表面进行调焦照射之后，对局部区域发出的荧光进行检测。优选通过在微阵列表面上聚焦的激光束来获得激发。具有激光束聚焦的扫描方法使用包括针孔的共聚焦扫描法。很多这样的扫描器都市售可得，例如PerkinElmer.RTM.Life 的 PROSCANARRAY.RTM.系扫描器、Affymetrix428 扫描器、Virtek Vision Chipreader系等等。一些基于突光激光的检测现在以多种形式可得，例如Tecan的Safir (TecanTrading AG, Mannedorf, Switzerland ；www.tecan.com)。它们适用于本发明。在具体的实施方式中，优选以时间分辨方式获得对突光染料分子的检测。突光分子具有与发射过程相关的荧光寿命。通常小荧光染料例如荧光素和若丹明的寿命在2 10纳秒的范围内。时间分辨荧光(TRF)检定使用长时的OlOOOns)荧光染料从短暂干扰辨别检定信号，短暂干扰为，例如寿命几乎都远小于IOns的基质(matrix)或荧光样品的自体荧光。在一个具体的实施方式中，通过使用PLEXOR.TM.技术(Promega)来进行荧光染料的检测。优选地，通过荧光共振能量转移(FRET)获得荧光发射的波长差异。在一个具体实施方式
中，引物被标记有具有给定的最适荧光发射波长并作为供体的荧光染料(F1)，当在溶液中以其激发波长激发时，其有荧光。在优选的实施方式中，用于检测信号的装置包括照射不溶固体支持物的侧面的光源。光源优选为非准直激光源或具有一对光纤束的发光二极管，如Aurora Photonics Inc.(26791ffest Lakeview, Lake Barrington, USA:infoiauroraphotonics.com)所建议的。某些荧光标签特别令人感兴趣，例如具有荧光特性的纳米晶体颗粒。最常用的是量子点(Han et al., Nature Biotechnology, Vol.19，ρ.631，2001)。它们是突光的且不会随时间或受照射而变白(b I each )。它们的稳定性使得它们特别适合于在连续的读取中使用，如在本发明中所建议的。同时，它们包含赋予这些颗粒特定特性的金属，从而除荧光之外的其他方法也可以用来监测它们对捕捉分子的附着。这些颗粒变热最好随时间检测的参数之一。金属吸收光束、优选激光束的能量并引起颗粒变热的事实已经被用作检测载体上的低密度金颗粒的基�。踔良觳獬龅ジ隹帕�(Boyer et al., Science, Vol.297, p.1160,2002)。该方法被称为光热干涉对比(Photothermal Interference contrast)。检测目标分子结·合到微阵列的捕捉分子上的直接方法是基于非线性发生频率光谱(generation frequency spectroscopy, GFS)的光学方法的化学制图法(L.Dreesenet al., Chem Phys Chem, Vol.5，ρ.1719，2004)。该技术可以进行表面和界面的振动特性的实时成像，且具有亚微级的空间分辨率。通过在基部的表面混合两个激光束而得到测量，其中一个在可见光(绿)具有固定频率，另一个在红外部具有可变频率。通过在红外激光束的频率函数中测量样品发出的光，从而获得界面上的振动特征。该方法避免标记将要检测的目标物，代表一具体的实施方式。直接测量纳米颗粒的另一技术是瑞利散射(Rayleigh scattering)。该方法基于被改造以在金属颗粒中获得电子振荡的光束的使用，从而从颗粒中得到电磁福射，其可被检测到(Stimpson et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.100, p.11350，2003)(real-time detection of DNA hybridization and meltingon oligonucleotide micro-arrays by using optical wave guides)。然而，直到现在，该方法仍缺乏应用于生物样品的必要灵敏度。或者，瑞利散射和表面等离子共振是具体应用在本发明中的方法，这种技术已经被广泛用于检测抗体/抗原的结合，但是也非常适用于微阵列的多参数测量以及对生物样品而言所需的灵敏度非常适合(Thiel et al.，AnalyticalChemistry, Vol.69，p.4948，1997)。在另一实施方式中，应用石英晶体微天平，现在其足够灵敏来测量小于I纳克的质量变化(cf.Caruso et al., AnalyticalChemistry, Vol.69, p.2043, 1997)0这是对于实时微阵列检测的一个提案。悬臂梁(cantilever)是检测微阵列上 DNA 的另一选择(McKendry et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, Vol.99，p.9783, 2002)。并且，另一种技术是纳米颗粒的电检测，其考虑它们的金属特性。电化学检测为首次应用，但是灵敏度低。更加先进且更加灵敏的方法是通过微分脉冲伏安法进行的检测(Ozsoz et al., Analytical Chemistry, Vol.75，ρ.2181，2003)。金属的电阻率和电容特性是电子芯片最佳被检测的特性之一。金属的电阻率和电容特性也是电子芯片最佳被检测的特性之一。两个电极之间存在金属将引起电阻率和电容的变化。当捕捉分子存在于一个电极上时，于是观察到DNA或蛋白的检测(Moreno-Hagelsieb et al Sensors andActuators B-Chemical, 98，269-274，2004)。金标记的 DNA 的电容检定已经在 Guiducci etal.ESSDERC2002中有过描述。因为电子芯片可以由多个点构成，在不同的点上检测到不同的目标物，并记录电阻率和电容的变化。如果方法还不能够产生生物样品所需的可靠且灵敏的检测，然而，预计一些将能成功满足实时检测的要求。用于测量目标分子结合微阵列的捕捉分子的另一个可靠的技术是基于非线性发生频率光谱(GFS)的光学方法的化学制图((L.Dreesen et al.Chem Phys Chem, 5，1719-1725，2004)。该技术允许对表面和界面的振动特性的实时成像，且具有亚微级的空间分辨率。通过在基部的表面混合两个激光束而得到测量，其中一个在可见光(绿)具有固定频率，另一个在红外部具有可变频率。通过在红外激光束的频率函数中测量样品发出的光，从而获得界面上的振动特征。该方法可以避免为了检测出目标物而对其进行标记。在优选的实施方式中，在微阵列的不同位置上监测到的信号选自:比色法、荧光、时间分辨荧光、光热干涉对比、瑞利散射、拉曼散射、表面等离子共振、质量变化、石英晶体微天平、悬臂梁、微分脉冲伏安法、基于非线性发生频率光谱的化学绘图、光学变化、电阻率、电容、各向异性、 折射率和/或纳米颗粒计数。在一个实施方式中，一些捕捉分子通过聚合酶延伸，其他一些同时与热循环过程中积聚在溶液中的扩增产物进行杂交。在一个实施方式中，在变性的温度步骤中检测所延伸的捕捉分子。在另一个实施方式中，延伸的捕捉分子和结合在其捕捉分子上的标记核苷酸分子都在退火和/或延伸的温度步骤中进行检测。在另一实施方式中，捕捉分子同时含有突光粹灭剂或突光受体和突光供体。突光猝灭剂或荧光受体因捕捉分子中的切割而被释出，支持物上的荧光供体被检测和/或定量。优选地，猝灭剂的释放由酶活性引起。优选地，酶对于双链DNA或DNA-RNA是特异的并包括但不限于具有尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG)、限制性内切酶、3’，5’核酸外切酶、5’，3’核酸外切酶、RNAseH的活性的酶。优选地，酶在60°C、更优选80°C，更优选94°C下稳定。在具体的实施方式中，通过猝灭剂和荧光供体之间的小距离来获得对于捕捉分子的猝灭效果。捕捉分子优选包括或不包括发夹，只要猝灭剂和荧光剂保持邻近。在优选的实施方式中，猝灭剂为1.4nm直径的金纳米颗粒，且荧光染料是荧光素、罗丹明6G、德克萨斯红或Cy5。猝灭剂优选位于捕捉探针的游离端，且荧光染料位于固定在支持物上的捕捉分子的末端或接近末端。
本发明使得可以通过使用具有不同的结合的单链捕捉多核苷酸序列的微阵列，通过确定因捕捉序列与目标序列之间结合而引起的单信号，从而识别多态性的存在，其中使用目标序列作为模板在3’-5’方向在捕捉序列的3’端核苷酸之外延伸其至少一个核苷酸，其中该延伸在聚合剂和核苷酸前体的存在下实现，其中引入到延伸的捕捉序列中的至少一个核苷酸是可检测到的修饰核苷酸。一个优选的支持物包括具有化学和热稳定性、低荧光性和光学稳定性的聚合物，优选为环烯经聚合物例如 Zeonex.RTM 或 Zeonor.RTMCZeon Chemicals, Louisville, USA),但不限于 Topas、Udel、Radel 或 THV。数据分析和定暈公近在优选的实施方式中，通过在微阵列的不同局部区域上监测不同时点的扩增信号来执行本方法，在至少5个、优选至少10个不同的扩增循环、更优选为至少20个不同的扩增循环中在每个局部区域进行至少5次测量。接下来，处理数据。在具体的实施方式中，方法包括多于20个的不同扩增循环，且/或在首个20扩增循环过程中不进行测量。在优选的实施方式中，用于测量荧光信号的不同扩增时点与扩增循环对应。优选地，通过流式芯片传感器的数据分析来确定扩增循环。对传感器信号进行分析来检测与液体的存在或移动或流动相关的变化，优选是在溶液前部或后部的流动和/或流通中的转变相的检测。传感器使得可以 通过确定由与传感器位置处的液体流通相关联的传感器随时间记录的变化数来对循环数进行计数。优选地，液体到气体的相变次数与循环数相对应。对循环计数使得可以提供点值与扩增循环之间的关系，其是实时扩增和/或定量的一个要求。或者，在流式芯片装置中不存在气相，从流式芯片装置特征的V1+V2和流速计算扩增循环。循环持续时间为，溶液完整循环经过流动通道和检测室的时间。扩增循环的持续时间根据装置的特征V1+V2 (VI是流动通道的容积，V2是检测室的容积)来确定或计算，其主要取决于流动通道截面及其在盒体(cartridge)的不同温度区域内的长度以及检测室的容积(V2)。流式装置中的流速取决于泵或用于使装置中的液体流动的其他系统的速度。优选在实验之前确定指定工作条件下的流速和/或进行一个循环的时间，作为标准化过程的一部分。在可替换的实施方式中，在每个扩增循环进行至少两次测量，以随时间监测信号。在另一实施方式中，使用至少5个、更好为10个、甚至更好为20个扩增循环来得到扩增，各个循环包括变性、退火和延伸三个步骤，其中各个循环在3分钟内进行，优选在2分钟内，甚至在I分钟内进行。在另一实施方式中，对来自杂交的目标多核苷酸分子的突光信号进行的测量还包括测量各个局部区域的背景信号并从各个局部区域的荧光信号中扣除背景信号。优选地，背景信号是在结合有捕捉分子的局部区域周边的局部背景。优选地，如de Longueville etal, 2002 (Biochem.Pharmacol.64，137-149)所描述的那样进行点的定量和/或数据分析。在优选的实施方式中，对微阵列图像进行信号值分析，该微阵列图像具有通过在扩增之前或在前十次扩增循环的一次中摄取的图像(参考图像)的像素值而校正的像素值。优选地，在图像校正之后，信号/背景比率增加2倍，优选为5倍、甚至为10倍。有利地，在图像校正之后，在65000灰度级范围中的背景信号低于500，甚至低于200。另一个优点是，在图像校正之后，点的局部背景内的像素值的标准差至少低2倍，甚至低5倍。参考图像是指定装置的微阵列的图像，其包括所有参考点，例如检测对照或杂交对照，但其中与目标物相关的点是阴性的并被认为是空白。在实验开始之前或在扩增目标物浓度还很低以至于无法给出点信号的数个循环内，目标物点为阴性。优选地，最初循环(first cycle)是循环I,还是循环5之前或循环10之前的循环之一。在具体的实施方式中，参考是根据最初循环中的一些循环而得到的数据结果，例如多个图像的总和或平均值。从测试图像扣减参考图像使得可以校正缺陷以及特定实验中源于装置的大部分非特异信号。优选在通过较早循环的图像进行图像校正之后进行网格化。优选地，对于给定实验必需的各个图像，微阵列表面相对于检测器的位置保持恒定。而且，优选仅进行一次图像的网格调整，且对于在一个实验中和特定装置中摄取的各个图像使用相同的网格参数。之后，将装置的位置相对于检测器的位置固定。在又一优选实施方式中，对微阵列进行信号值分析，其中将从扩增循环η中得到的微阵列图像的像素值加到从扩增循环η-l中得到的微阵列图像的像素值中。优选对从连续循环的图像得到的数据进行分析。在优选的实施方式中，将不同图像的像素值相加，并将所得的累加点值作为溶液中出现指定目标物的量度。在优选的实施方式中，用累加的点值随扩增循环进行制图，以对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。优选地，用累加的点值随扩增循环进行绘图，和/或用于确定临界值(Ct值)和目标物定量。目标物的定暈在定量中不仅要考虑杂交收率和微阵列的检测范围(对于目标物和参考序列是相同的)，还考虑提取、扩增(或复制)和标记步骤。在优选的实施方式中，通过比较(不同位置的)信号值与固定值，来对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行定量。在另一个实施方式中，通过比较为达到固定值(CT)和参考多核苷酸分子的CT值所必需的扩增循环数来对存在于样品中的目`标多核苷酸分子进行定量，参考多核苷酸分子优选为在相同溶液中被扩增并在与目标多核苷酸分子相同的微阵列上被检测到的多核苷酸分子。或者，通过比较为达到固定值(CT)与标准曲线所必需的扩增循环数，来对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行定量，在标准曲线中以CT值相对于标准浓度进行绘制。在另一可替换实施方式中，通过比较至少两个扩增循环的信号的动力学常数来对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行定量。在另一实施方式中，通过将目标多核苷酸分子的信号值与对于将预定量的标准多核苷酸分子以已知拷贝数加入到扩增溶液中而获得的信号值进行比较，来获得对存在于样品中的目标多核苷酸分子的拷贝数定量。有利地，将标准多核苷酸分子加到初始生物样品中，或者在提取步骤之后加入初始生物样品中，并用相同引物进行扩增或复制，且/或具有与目标多核苷酸分子相同、或差异不多于20%的长度和GC含量。优选地，标准多核苷酸分子(在其特异捕捉分子上)的杂交收率与目标多核苷酸分子的杂交收率相同、或差异不多于20%。具体地，将标准多核苷酸分子设计为具有在文件W098/11253中出现的内标物的特征的竞争性内标物，该文件通过引用的方式全部合并入本文。基于这些标准物的使用的定量也在W098/11253中有过描述。
所述标准多核苷酸分子、外标物和/或内标物，也有利地包括在根据本发明的试剂盒中，可能还有所有进行本发明不同步骤所需的介质和工具(means)(杂交和培养介质、聚合酶和其他酶、标准序列、标记分子等等)。装置和试剂盒根据本发明的方法优选通过使用生物有机体或部分有机体的特异性识别(诊断和/或定量)试剂盒进行，该试剂盒包括用于执行本发明方法的工具和介质。具体地，优选的试剂盒包括:根据本发明方法的流式芯片装置，用于扩增的试剂包括引物、dNTP、DNA聚合酶和缓冲剂。引物和/或dNTP包括荧光染料标记的扩增前体，以标记扩增产物。在具体的优选实施方式中，装置包括4个分隔开以独立加热的区域。一个区域是专用于PCR的变性步骤，温度在85和100°C之间，优选为95°C 99°C，第二区域专用于退火步骤，温度在37 °C和70 V之间，优选在50 °C和65 °C之间，且第三区域专用于延伸步骤，温度在60°C和80°C之间，优选在68°C和75°C之间。第4个区域是以任何温度加热以调节其他3个区域中的一个的大小的区域。细的流动通道经过装置的4个区域，该通道具有1_2、优选为0.25mm2的截面，且在各个区域中具有特定长度。流动通道的总容积在2mL和20 μ L之间，优选在300yL和IOOyL之间。优选地，在第一区域中的通道的尺寸在流动通道总尺寸的约5 40%之间，优选为10 30%之间，例如为约25%，在第二区域中为，约10 60%之间，优选为20 50%，例如为约35%，在第三区域中为，约10 50%，优选为约15 40%，例如为约25%，以及在第四区域中为，在0%和约40%之间，优选为0% 30%，例如为约15%。第二区域还包括与通道连接的检测室。该检测室包括点状微阵列。优选地，布置有流动通道的基部包括不透明聚合物。优选地，除了受到照射和发射光的面外，所有检测室的侧面都是黑色或着黑色。在具体的实施方式中，流式芯片装置与溶液接触的面是环烯或弹性体聚合物。环烯聚合物优选选自 Zeonex.RTM 或 Zeonor.RTMCZeon Chemicals, Louisville, USA)、Topas、Ude1、Radel 或 T HV。在另一具体实施方式
中，包括检测室的温度区的表面为温度区总表面的至少40%。在试剂盒的优选实施方式中，捕捉部的特定序列的长度在约10个和600个碱基之间，优选为15个和50个碱基之间，更优选为15个和40个碱基之间。在试剂盒的优选实施方式中，能够与其对应的目标核苷酸序列杂交的捕捉分子(捕捉部)的特异序列，包含具有15 50个碱基的通过至少6.8nm的间隔部与固体支持物的表面隔开的序列。在试剂盒的另一实施方式中，间隔部是具有多于20个碱基的核苷酸序列，优选为多于40个碱基，更优选多于90个碱基。优选点样液中捕捉分子的浓度为约600nM至约3，OOOnM0然而，低至约IOOnM的浓
度在有利的情况下(当共价固定的收率较高或者当将要检测的目标物是单链并以高浓度存在)仍给出阳性结果。这样的低点样浓度对应于每cm2低至20fmole的捕捉分子密度。另一方面，更高的密度仅在检定中受到捕捉溶液浓度的限制。高于3，OOOnM的浓度给出良好结果。在根据本发明的试剂盒中，捕捉分子存在于不溶固体支持物上，在具有Iym2 75mm2、优选为0.005 0.2mm2的表面积的局部区域中。在优选的实施方式中，微阵列包括每cm2至少20、优选50、更优选100个局部区域。优选地，微阵列将包括约1000个以下的局部区域。微阵列覆盖固体支持物的至少0.1、更好为1、甚至更好为至少4cm2的表面。通常而言，微阵列将覆盖约IOcm2以下的表面积。在具体的实施方式中，支持物和/或检测室材料选自玻璃、电子装置、硅支持物、塑料支持物、二氧化硅、金属及其混合物，其中支持物以滑片(slide)、圆盘、凝胶层和微珠的形式进行制备。在另一具体实施方式
中，支持物和/或检测室材料包括环烯聚合物，优选为 Zeonex.RTM 或 Zeonor.RTM (Zeon Chemicals, Louisville, USA)> Topas>Udel> Radel 或THV。流式芯片装置优选为一次性装置。优选地，温度控制器和调节器例如加热器和/或冷却器不是这种装置特别是一次性装置的一部分。在可替代的实施方式中，加热器和/或冷却器是这种装置的一部分。在特定的实施方式中，该装置包括另外的隔间，例如用于制备扩增溶液(即，制备样品)。同样，优选地，流体输送系统或输送系统的部件，例如泵，不是一次性装置的一部分。在某些实施方式中，流体输送系统包括在装置内。检测室的温度区的结构或式样优选反映在温度控制和调节系统的加热器和/或冷却器的结构或式样中。同时，优选该装置具有传热和/或绝热表面的样式。设备
在优选的实施方式中，用于进行本发明方法的设备包括可操作地布置成经流动通道输送流体以及使溶液在装置内循环的系统。优选地，该系统包括泵、压缩元件、磁珠等或其组合。在另一优选的实施方式中，液体在流动通道中流动的速率在6 μ L/min和3000 μ L/min之间，优选在50和500 μ L/min之间。在优选的实施方式中，设备包括流式芯片传感器，优选为热检测器、荧光检测器或光吸收检测器。流式芯片传感器优选为固定在流式装置上且可以记录物理参数的传感器，所记录的物理参数包括但不限于温度、光密度、光散射、荧光、折射率和电阻。通过设备来分析传感器信号，以检测与液体的存在或移动相关的变化，优选检测溶液前部在流动和/或流通中的相变。对于在检测室中出现液体的时点，优选根据对不同参数(包括流式芯片上的传感器位置、信号变化的时点和液体的流量)的分析中进行推测。使用液体的体积来确定检测室中出现液体的持续时间。确定流速的实例示于GB2433259中，使用在用UV灯照射流动通道时DNA的吸光度。优选根据在与传感器位置处的液体流通相关联的传感器中随时间记录的变化数计数结果而获得循环数。在另一特定实施方式中，从检定的时点和装置中的液体流速来计算出液体在流式装置中的位置。为根据时间和距离计算装置中的流体位置，针对区域温度而校正流动速率。在优选的实施方式中，流式芯片装置的不同温度区域通过双层隔离物(优选包括空气层)而相互隔开。优选加热系统选自:Peltier设备、电阻加热器、热交换器和铟锡氧化物元件。扩增步骤的不同区域优选被区域两侧(一边低于且另一边高于流式芯片区域)的加热工序所环绕。检测室最好在检测室的一侧被加热，另一侧开放以照射微阵列。在具体的实施方式中，退火区域与检测室相同，且覆盖退火区域的加热器元件之一以使得照射束达到微阵列以进行检测的方式断开。在具体的实施方式中，单个温度控制器调控所有温度区的温度。在可替换的实施方式中，温度控制器是多个温度控制器中的一个，各个温度控制器单独调控一个温度区的温度。温度控制器能够调节至少两个不同温度区域内的温度，以实现包括变性、退火和延伸步骤的PCR。最简版本的加热系统优选由以下相关部件构成:热电偶、传感器(transmitter)、转换器和加热器。加热系统是为了在装置的各个温度区域产生基本恒定的温度，以进行精确的扩增和/或杂交。在各个温度区域中产生的温度在扩增过程中保持基本恒定。热电偶尽可能贴近所要加热的区域，并经传感器测量温度。该温度信息通过转换器提供到计算机。软件以一定间隔例如每秒将测得的真实温度与最终使用者要求的温度设置点进行比较。如果所测量的温度高于要求的温度，则简单地停止加热器。如果所测量的温度低于所要求的设置点，系统继续加热过程。优选加热和冷却系统允许小于1°C、更优选小于0.250C的温度变化。优选地，检测室表面上的热均匀度是至少1°C，优选为至少0.1°C。优选地，温度的精确性好于0.5°C，优选好于0.1°C。除加热系统外，检测还需要照射光源和用于测量来自结合的标记目标多核苷酸分子的信号的检测器。优选地，光源生成光束，以激发结合在反应室的平面上的结合标记目标物。检测必须以如下方式设置，即，在所要分析的微阵列覆盖到的整个表面上获得相同的检测效率。在本文中使用的典型检测器是能够拍摄整个微阵列的CCD相机。在另一优选的实施方式中，光学系统的分辨率在0.1微米和500微米之间，更优选在10和100微米之间。在一个优选实施方式中，激发光是(红)激光二极管，优选具有635nm±5nm的波长。激光二极管是，例如，在10 35°C之间的温度下工作并具有10 2000mW的输出功率的PearlTM2W639nm。优选激光具有低散热元件，以减少形变。优选地，照射来自微阵列下方。激光束还优选与具有固定的捕捉分子的平面垂直(+/-10° )。还优选在激光束和平面之间放置镜子以降低直 线束长度。优选地,谱线宽 度为最大5nm，甚至3nm，以避免非特异性激发和发射重叠。优选地，光束均匀地照射微阵列的整个表面，优选为例如20X IOmm的表面。均匀的照射应该为整个表面的至少95%，甚至至少98%。在另一实施方式中，激光扫描微阵列表面。通过空间滤波器或结合至单模光纤或者通过使用固态激光例如DPSS来获得近高斯分布(near gaussian profile)。优选地，由光源产生的激光束为近准直的和近高斯的。在优选的实施方式中，使用光学元件例如折射或扩散光学元件来使整个微阵列表面上的照射强度均匀化。可替换的激发过滤器被用来只收集感兴趣的波长。优选放置额外的滤光轮并将其用作衰减滤波器以精确调节激光功率。该滤光轮以多种已知的吸收能级被不同地遮挡。抗反射涂覆的透镜用于在反应室的平面上聚集激光束。在优选的实施方式中，检测器包括光学透镜。发出的光经光学透镜聚焦到检测器，用于检测存在其中的光子数量。检测器优选为冷冻CCD相机。相机优选为黑白CCD。选择相机，以在发射波长(优选为670nm)提供最大量子效率。C⑶量子效率优选在670nm为至少20%，优选为至少50%。优选像素大小为8 24 μ m。CXD传感器面积为至少20 X 10mm，以获得1:1比例和最佳的图像全景。CXD相机优选为全画幅相机(full frame camera)。图像数字化优选为至少12位，以得到充分的量化水平，更好是至少14位。曝光时间优选为至少I秒钟并优选为短于10秒，更优选少于5秒，更好少于3秒，以进行实时定量。优选避免镜子，以防止灰尘积聚和图片劣化。优选透镜具有以下特征:大的像圈(即，43.2mm的直径)、大光圈:f/2.8往下到f/16、短焦距(SP，40mm)、小于IOcm适用于1:1尺寸比的微距能力。在具体的实施方式中，加入传输波长大于约665nm的光的发射过滤器。发射过滤器优选放置在透镜上或接近于透镜。优选发射过滤器具有以下特征:低频率通过的带通、665nm的起始频率(cut on frequency)和700nm的截止频率、高于0.8T的带宽透射率和带宽外低于0.0OlT的透射率、500 665nm之间低于0.0001T的透射率、带宽±3nm的精确度。在优选的实施方式中，照射光源产生直接聚焦在反应室的平面上的激发光，其中激发光以45 135°之内的角度达到微阵列表面。优选地，激发光以约90°的角达到支持物的表面，因此是垂直的。以法线进行计算，该角可以是约0°。因此，激发光在如下角度内达到反应室的平面，该角度不引起光线内反射(如倏逝波提供)。在优选实施方式中，使用在W02009/013220中描述的禁止角方法来进行检测。流式芯片装置(放置在设备中)包括固定在折射率高于1.30且厚度为至少0.5mm、优选至少3mm的光学透明固体支持物的表面上的捕捉分子，其中该固体支持物具有相对于支持物的固定有捕捉分子的面(SI)倾斜的两个面(S2和S3)，一个面(S2)为光学透明的，并用于聚集以禁止角(Θ obin)从捕捉分子的局部区域发出的光，并相对于固体支持物表面倾斜90 60°的角度，另一个相对的面(S3)为黑色或涂覆有黑色或涂覆有具有与发射光的波长对应的吸收的颜色，其中装置位于设备之上，以使以禁止角(Θ obin)发出的光经过倾斜面S2而达到检测器。优选地，观测角在临界角加10°、优选加5°、更优选加3°的范围内。优选相机相对于支持物侧面的法线以固定的观测角Θ obout进行安放,0° > Θ 0bout> Θ c out,其中0C OUt=Arcsin (nl/n3cos ( Θ c) )。nl是光学块的折射率,n2是溶液(优选为水溶液(n2为约1.33 的折射率，n3是空气的折射率。在另一实施方式中，信号是来自结合的标记目标多核苷酸分子响应于照射的散射光。在可替换的实施方式中，信号是来自结合的标记目标多核苷酸分子响应于照射产生的光衍射的结果。在优选的实施方式中，在检测过程中，入射光源、固体支持物和检测器相对彼此不移动。这是最简单的系统。C CD相机在单次采集中收集从固体支持物表面发出的光。在整合的系统中进行用于扩增和检测的加热过程。在实施例5中描述的特定仪器中，光源直射在支持物的与接触恒温加热器的面相对的面上。本发明还涵盖在进行主要用于对可能存在于样品中的有机体(微生物)或部分有机体进行诊断和/或定量的方法中的多个步骤时所必须的机器和设备，包括:a)根据微阵列在特定位置结合到不溶固体支持物表面上的捕捉分子；b)用于热调节的装置；c)用于检测在扩增子与捕捉分子结合处形成的信号的装置；以及d)将信号转化为电子数据的计算机。在优选的实施方式中，设备还包括:-用于存储不同测量的数据的存储系统；-重复照射、检测和存储的步骤的控制器；-流式芯片传感器的数据分析，以确定液体在流式芯片装置中的位置；-用于处理数据以对扩增之前存在于溶液中的多核苷酸分子的量进行检测和/或定量的程序。
在另一实施方式中，计算机程序还识别形成信号的微阵列的位置。在设备中，优选捕捉分子是单链的捕捉分子，其在微阵列位置上与不溶固体支持物共价结合，其中捕捉分子包括有10 600个碱基的捕捉部，该捕捉部能够与扩增子特异
彡口口 优选设备具有选自比色法、荧光、时间分辨荧光、光热干涉对比、瑞利散射、拉曼散射、表面等离子共振、质量变化、石英晶体微天平、悬臂梁、微分脉冲伏安法、基于非线性发生频率光谱的化学绘图、光学变化、电阻率、电容、各向异性、折射率和/或纳米颗粒计数等方法的检测器。在具体的实施方式中，荧光扫描器使用激光束，包括共聚焦扫描法，还优选针孔。在具体的实施方式中，设备还包括:存储系统，用于对在热循环的指定时点在支持物的至少5个不同位置进行的不同测量的数据进行存储；控制器，其在至少一个热循环中对微阵列的各个位置重复检测和存储步骤至少一次；和/或计算机程序，用于对在至少一个热循环中得到的数据进行处理，从而对在扩增之前存在于样品中的核苷酸分子的量进行检测和/或定量。在特定的实施方式中，设备还包括:激光源；用于由该激光源产生的激光束的聚集装置；光电倍增器和针孔。在另一个实施方式中，设备还包括用于将在一个位置形成的信号转化成与特定目标物的存在相关的数据。在具体的实施 方式中，设备是用于基因、DNA和多核苷酸序列的扩增和检测的多功能设备，其进行PCR扩增、多核苷酸检测、实时PCR、对实时PCR的定量、微阵列检测和/或定量以及SNP检测。图9的流程图描述通过可编程计算机控制实时PCR设备的实施方式。检测器可以是灵敏的CCD相机，以在微阵列被激光照射时拍摄图片。参考实施例7和图10。在步骤1，提示用户填写所需的参数，例如:-CCD相机的曝光时间；-光源的激光功率；-变性温度；-退火/杂交温度；-延伸温度；-泵速；-在液相或气相中检测(或图像获取);-扩增循环的持续时间和由传感器计数的扩增循环确定；-检测器获取微阵列图像的时刻。对于不同参数的解释CCD相机的“曝光时间”对应于拍摄检测室中微阵列的图片的时间。在实施例7中使用5秒的曝光时间。“激光功率”是指用于照射检测室中的微阵列的光源的功率。在实施例7中，使用2W的高强度激光。以下述方式设定PCR扩增的三个温度。
1.变性温度在仪器中，将第一加热块(上和下)的温度设定为与PCR的变性步骤对应的固定值。结果，盒体的变性温度区被加热至“变性温度”。变性温度在85和100°C之间，优选为95°C 99 0C。在实施例7中，将95 °C用作变性温度。2.退火/杂交温度在仪器中，将第二加热块(上和下)的温度设定为与PCR的退火/杂交步骤对应的固定值。结果，盒体的退火/杂交温度区被加热至“退火/杂交温度”。退火/杂交温度在37 0C和70 0C之间，优选为50 0C 65 °C。在实施例7中，将58 °C用作退火/杂交温度。3.延伸温度在仪器中， 将第三加热块(上和下)的温度设定为与PCR的延伸步骤对应的固定值。结果，盒体的延伸温度区被加热至“延伸温度”。延伸温度在60°C和80°C之间，优选为68V 75°C。在实施例7中，将72°C用作延伸温度。各个加热块通过放置在铝元件内部的热电偶进行热调节。外部PID调节电子装置(OMRON)以一定间隔向加热电阻输送功率，以保持所需的温度。将空气脉冲散热器连接至各个加热铝块，以使它们在需要的时候在合理的时间内将温度降低。任选地，将额外的温度区并入到装置中，其在指定温度加热，以调节3个其他区域的其中之一的尺寸。“泵速”是限定盒体中流速的主要参数之一。在实施例7中，泵速设定至13rpm。通道截面、其在盒体的(温度被控制的)不同温度区域内的长度以及检测室的容积(V2)使得可以计算装置容积(V1+V2)。泵速限定流速以及各个扩增步骤(变性、退火/杂交和延伸)的持续时间。例如，在图4中提供的整合流式芯片装置，具有信用卡的尺寸(80mmX50mmX2mm),包括在4个不同温度区域(区域1:20cm长的通道；区域2:40cm长的通道；区域3:15cm长以及区域4:20cm长)内部的流动通道(通道截面:500 μ mX 500 μ m)以及在区域2中的连通检测室。对于13rpm的泵速，经四个温度区域的完整循环的持续时间需要约90秒。优选使用指定的工作参数通过系统的标准化或校准来预先确定一个循环的持续时间。取决于引入到盒体中的溶液体积(V3)相对于装置总容积(V1+V2)，在盒体中将有两个相(气/液)或仅有一个相(液)。“气相的存在”意味着引入到流式芯片装置中的溶液体积(V3)小于装置的总容量体积(V1+V2)。在液相或气相下进行检测。在装置中存在气相，使得可以通过实验确定“扩增循环的数目”(包括变性、退火/杂交和延伸)。对循环计数是，例如通过热电偶探头而进行的，其检测流动通道的特定位置处的气相到液相的流通。通过知晓泵速和溶液到达探针所控制的通道截面的时间，可以在液相或气相下进行微阵列的图像获取。作为使用探针进行循环计数的一种选择，也可以根据流式芯片装置的特征，例如流动通道截面、其在盒体(温度被控制)的不同温度区域内部的长度以及泵速来计算“循环的持续时间”。通过CCD相机检测微阵列的“微阵列检测时刻”定义用户想要获取阵列图像的时间。其为每个循环(一次或多次)或者在传感器计数的预设循环数或在对应于循环持续时间的预设间隔。在实施例7中，在检测室处于气相时在由传感器确定的第2、5、10、12、14、16、18、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40 循环中进行图
像获取。参数定义在扩增过程中将被检测器获取的图像的数量。在步骤2中，系统初始化:检查仪器的基本参数:加热块的温度、照射源的激光功率、CXD相机的温度、传感器和泵速。在步骤3，仪器中的第一加热块被加热至预设的变性温度。在流式芯片装置中，变性的温度区域被加热至变性温度。退火/杂交和延伸温度同此情况。在步骤4中，液体流经流式芯片装置的变性区域，并发生变性。任选地，将泵速降低，以使第一扩增循环的变性时间最大化。在步骤5a，液体流经退火/杂交区域。发生引物的退火，以及目标扩增子在微阵列上的杂交。在步骤5b，任选地根据程序，通过检测器在指定扩增循环获取微阵列的图像，集中获取到的图像，用于对存在于支持物上的各个目标物的信号和背景值进行定量和提�。⒔忻髦堑难肥莘治�。在步骤6，液体流·经延伸区域以进行延伸步骤。在步骤7，发生扩增循环的确定。扩增循环是通过传感器(例如，探针热电偶)的循环计数来进行实验确定。记录传感器数据，并进行数据分析以用于确定循环数。或者，根据包括检测室的流式装置容积和泵速，从理论上确定扩增循环的持续时间。循环持续时间是溶液经流动通道和检测室完成循环的时间。在计算的另一模式中，扩增循环时间为已知，且为系统参数的一部分。如果没有达到要完成的图像获取数量，程序循环到步骤4。如果已达到要完成的图像获取数量，发生步骤8:通过总体审视结果和数据分析来完成数据分析，包括结果的报告。数据分析包括处理阵列表面图像，以用于确定样点位置以及确定与对于指定目标物的点相关的值。定量还优选包括对Ct值的多种校正和确定，以及对存在于起始溶液中的目标物的定量。已知阵列分析的不同方法，以及处理实时PCR中的数据以对目标物进行定量的途径(参见de Longueville et al2002Biochem.Pharmacol., 64, 137-149;Meneses-Lorente et al2003Chem.Res.Toxicol., 16, 1070-1077;Hamelset al2001Biotechniques, 31, 1364-1372;W002/097135and US2004/0161767introducedherein as references)。本发明还通过以下非限制性的实施例进行进一步说明。实施例实施例1:在流式芯片装置的微阵列上检测的实时单重PCR通过组合一次性塑料盒体、柔性管(参考:C_flex06422_2; Cole-Palmer, Vernonhills, IL, USA)、栗管(参考:049ef0a-051, Watson-Marlow, Stockholm, Sweden)和检测室产生闭合的通道环路，从而制备第一流式芯片装置。
一次性塑料盒体由2个Topas塑料件制成，该两个塑料件被模制并焊接为产生截面为Imm2的通道。有3种不同的一次性塑料盒体(长、中、小)，分别具有3种不同长度的通道:30cm (长)、20cm (中)和IOcm (小)。一次性塑料盒体具有能连接到柔性管的内口和外□。检测室为椭圆形，7mm ( ) X 20mm (长)Χ100μπι (高)。检测室在上侧被1.5mm厚的黑色塑料封装物，在底侧被3.5_厚的光学块封闭。检测室设计成容纳约10 μ L的溶液。光学块在光学级别的Zeonex。表面非常光滑和平坦，防止抓痕和灰尘。通过等离子体处理来激活光学块，以在表面上生成环氧基(P2i，Abingdon, UK)。使用250 μ m直径的针(pin)通过自制机械装置将捕捉核苷酸序列印在光学块表面。点的直径为400μπι，分配的体积为约0.3nL。在室温干燥光学块，并将其激光焊接到检测室，并储存在20°C待用。与光学块的观察侧相对的侧部涂覆有黑色涂料。如下制备流式芯片装置。其包括4个区域:区域A由附接到I个中型塑料盒体的内口上的15cm柔性管制得。区域B由IOcm柔 性管制得，其一端固定在区域A塑料盒体的外口上，另一端固定在检测室的内口上。检测室的外口固定有5cm的柔性管，之后为I个长型塑料盒体，之后是5cm的柔性管。区域C由22cm柔性管制得。区域D 由泵管(#049.EF0A.051, Watson-Marlow, Stockholm, Sweden)制得，其与区域C的柔性管的末端以及区域A的柔性管的开端连接，形成闭合环。流式芯片装置可以在区域D和A的连接点处开口，以将溶液引入流式装置中。液体进入流式芯片装置后，其关闭，且泵管被引到螺动泵(#Seriel00, Watson-Marlow, Stockholm，Sweden)，从而液体可以在闭合环路的流式芯片装置中流动。包括流动通道和检测室的流式芯片装置的总体积容量为2mL。将流式芯片装置放置在流式仪器内部。仪器由独立地在不同温度(99°C、58°C和72°C)加热的3个铝区段制得。将流式芯片装置的区域A放置在于99°C加热的铝区段中，区域B在58°C的区段中，区域C在72°C的区段中。通过使用招表面与流式芯片装置底面之间散热化合物(Dow Corning340, Dow CorningGMBH, Wiesbaden, Germany)层来使流式芯片装置与铝块之间热接触。将检测室准确地放置在激光上方以及相机的前方，从而使用禁止角拍摄检测室中的微阵列的照片。在3个加热区段的顶部，放置3个铝盖以保持流式芯片装置周边的热。设在检测室的光学块上的微阵列为9X 19个400 μ m的点，并包括Cy5标记的检测对照5’端氨基-多核苷酸的点:检测对照:(SEQ ID N0.1)5’ NH2-TACCTACTACGCTACACGAACCTACAAGACAAGATAAAG ACAGACTCATG-3’ Cy5。标记的捕捉探针以500nM的浓度点样。微阵列还包括对不同序列特异的未标记捕捉分子，这些捕捉分子的其中一种对目标物GUT特异，包括捕捉部和间隔部(下划线的):GUT 捕捉探针:(SEQ ID N0.2)5’ NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTC CAAATTAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAA-3'未标记的捕捉探针以12 μ M的浓度点样。在点样后，将塑料光学块放置在有湿度的20°C烘箱中30分钟，之后在湿度下于600C中30分钟。之后塑料光学块在SSC2X pH7+BSAl%+SDS0.1%中清洗I X 5min,之后在H2O中2Xlmin，最后在沸水中lX3min。在清洗步骤之后，塑料光学块在室温下干燥，并焊接到检测室的底部，以制备包含微阵列的封闭检测室。制备PCR混合物，从而使用在5’端Oyster标记的引物对特异性地扩增目标物GUT。制备500 μ L 的 PCR 混合物，包含 IX 的 PCR 缓冲液(Taps50mM，Tris_HC195mM，MgCl22mM)、BSA0.05%、一对引物(5，0yster-GGGACCCTCGCCCAGAAAC-3’ (SEQ ID N0.3)和5，-CCACCTGCTGACCCCGTC-3’ (SEQ ID N0.4))各为 I μ M，Supersalt Taq 聚合酶 1U/50 μ L、200 μ M 的 dATP、200 μ M 的 dCTP、200 μ M 的 dGTP、100 μ M 的 dTTP 和 300 μ M 的 dUTP 以及 100拷贝的⑶T目标DNA。I X的PCR缓冲液还包括如W02009/086608中提供的谷氨酸盐和右旋糖苷。在进入流式仪器内的流式芯片装置之前，将400 μ L的该PCR混合物于99°C孵育5分钟，之后进行以下程序:在99°C下的变性步骤，在58°C下的退火步骤和在72°C下的延伸步骤，共40个I分20秒的循环。在循环0、10、15、20、25、30、35和40，以禁止角经光学块的侧面拍摄5秒的图片，以
在检测室内没有液体时检测检测室中的微阵列。使用Maxim DL 软件(Diffraction Limited, Ottawa, Canada)对这些原始图片做出分析，并进行对于三个点的原始信号强度的定量:1个GUT捕捉探针点、该点的局部背景和I个检测对照的点。原始信号强度相对于`循环数进行绘图，结果显示在图1中。作为对照，在Mastercycler 仪器(Eppendorf, Hamburg, Germany )中以以下程序在PCR管中对100 μ L的该PCR混合物进行操作:95°C 5分钟，接着为40个循环(95°C 30秒钟的变性步骤、58°C 90秒钟的退火步骤和72°C 30秒的延伸步骤)，接着72°C 10分钟，之后降低至4°C的温度。在40个PCR循环之后，将I μ L在管中进行的PCR溶液和I μ L在流式芯片装置中取得的 PCR 溶液载入 Bioanalyser DNA2000 凝胶盒(Agilent, Santa Clara Ca, USA)。测量与GUT扩增子对应的条带的强度并转化成扩增子浓度。数据示出对于流式芯片装置的值为34nM，对于PCR管的值为32nM，表明PCR收率相当。实施例2:在流式芯片装置的微阵列上检测到的实时多重PCR如实施例1所述制备流式芯片装置。 在实施例1的缓冲液中制备500 μ L的PCR混合物，使用16对50ηΜ/75ηΜ(对于标记的引物)的引物(引物混合物3.4)(包含对于扩增金黄色葡萄球菌(S.aureus)的引物对，5’0yster-TCAGTCTTACCTGCTCGATTC-3’ (SEQ ID N0.5)和 5’-TGCACGTCTAATACCACTCT-3’(SEQ ID N0.6))、Supersalt Taq 聚合酶 1U/50 μ L、200 μ M 的 dNTP 混合物(dATP、dCTP、dGTP)、100 μ M的dTTP和300 μ M的dUTP以及I百万拷贝数的基因组金黄色葡萄球菌的目标DNA的混合物。在进入位于流式仪器内部的流式芯片装置之前，将400 μ L的PCR混合物于99°C孵育5分钟，之后进行以下程序:在99°C下的变性步骤，在58°C下的退火步骤和在72°C下的延伸步骤，共48个I分10秒的循环。流式装置具有2mL的总容积，并包括在退火区段中的检测室。该检测室容纳捕捉探针的微阵列(如实施例1)，其中有对于目标物金黄色葡萄球菌的扩增子是特异性的捕捉探针，包括捕捉部和间隔部(下划线的)。金黄色葡萄球菌捕捉探针(SEQ ID N0.7):5,NH2~TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACT CCAAATTATGTTAAGTTATGTGGTGGAATATTCGTTGCCATACCTA CCGC-3，在循环0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45 和 48，以禁止角拍摄检
测室的5秒图片，且检测室内没有液体。使用Maxim DL软件对这些原始图片做出分析，并将金黄色葡萄球菌捕捉探针的I个点的原始信号强度减去该点的原始局部背景的定量结果相对于循环数进行绘图。结果提供在图2中。作为对照，在Mastercycler 仪器(Eppendorf, Hamburg, Germany)中以以下程序在PCR管中对100 μ L的PCR混合物进行操作:95°C 5分钟，接着为48个循环(95°C 30秒钟的变性步骤、58°C 90秒钟的退火步骤和72°C 30秒的延伸步骤)，之后72°C 10分钟，之后降低至4 °C的温度。在48个PCR循环之后，将I μ L在管中进行的PCR溶液和I μ L在流式芯片装置中取得的PCR溶液载入Bioanalyser DNA2000凝胶盒。测量与金黄色葡萄球菌扩增子对应的条带的强度并转化成扩增子浓度UM)。数据示出流式芯片装置的值为ΙΟηΜ，对于管中进行的值为41nM。 实施例3:流式芯片装置的微阵列上的实时PCR信号的信号进展和处理如实施例1进行检定，不同之处在于使用不同的P35扩增引物对来进行单重PCR:-5’Cy5-CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG-3’(SEQ ID N0.8)和-5’-TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT-3’ (SEQ ID N0.9)。检测室容纳捕捉探针的微阵列(如实施例1)，其中有捕捉探针对于目标物P35扩增子为特异性的，包括捕捉部和间隔部(下划线):P35 捕捉探针(SEQ ID N0.10):5’ NH2-ATAAAAAAGTGGGTCTTAGAAATAAATTTCGAAGTGCAAT AATTATTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACT CCAAATTAGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATAT-3>对I百万拷贝的P35目标0嫩进行？0 ，并在循环0、3、6、9、12、18、21、24、27、30、33、36、39和40在禁止角内检测杂交到微阵列上特异捕捉分子的PCR产物，且检测室中没有荧光液体存在。示出在不同PCR循环中得到的结合目标物P35的信号的曲线图在图3a中示出。曲线图示出在点(n° 2)的原始值和标准差以及对于其局部背景的原始值和标准差。图3b示出，在各个循环中的不同图像通过循环3图像的扣减和1500补偿值的添加而校正(使用Maxim DL5软件的“pixel math”功能)之后的信号值和相同点的局部背景值以及样点值和局部背景的标准差。扣减是逐个像素进行的。实施例4:整合流式芯片装置的设计流式芯片装置是图4所示的一次性塑料盒体。其具有信用卡的尺寸(80mmX 50mmX 2mm)并包括在4个不同温度区域(区域1:20cm长的通道；区域2:40cm长的通道；区域3:15cm长以及区域4:20cm长)内部的流动通道(通道截面:500 μ mX 500 μ m)以及与区域2中的连通检测室。在将区域I中的通道的泵口和区域4中通道的泵口经柔性泵管(#049.EF0A.051, Watson-Marlow, Stockholm, Sweden)连接到作为流式仪器一部分的外泵之后，液体在闭合环路中移动。检测室具有六边形，为IOmm (宽)X20mm (长)XlOOym(高)。检测室在上侧通过1.5mm厚的黑色塑料封装件并在底侧通过3.5mm厚的光学块被闭合。检测室设计成容纳约15 μ L的溶液。光学块为光学级别的Zeonex。表面优选为光滑和平坦，避免抓痕和灰尘。通过区域I或4的泵口之一将溶液引入流式装置中。液体进行流式芯片装置后，其闭合并且泵管被引到螺动泵(#Seriel00, Watson-Marlow, Stockholm, Sweden)中，从而液体可以在闭环的流式芯片装置中流动。包括流动通道和检测室的流式芯片装置的总体积容量为约240 μ L。流式芯片装置设计成安装在实施例5描述并在图5和图6中图示的流式PCR仪器的内部。实施例5:整合流式PCR仪器的设计如实施例4中所描述并在图5和图6中示出，仪器(F-RAP仪器)允许用于扩增的热循环和流式芯片装置中的液体流。其由位于盒体上下的4个加热块构成，从而在仪器中存在总共8个物理分隔的加热元件。盒体的4个温度区域中的每一个都夹在一对加热铝块之间，在其表面上具有热垫(thermal pad)元件，以改善招块与塑料盒体之间的传导性。热源是布置在铝块内部的加热电阻并与电压源连接。为防止过度的热梯度，各个加热元件经塑料结构和薄空气层而相互隔开。将铝块有意制作成稍小于聚甲醛(POM)袋，将铝块放置在袋中以降低加热块与它们周围夹持器之间的传导性。通过放置在铝元件 内部的热电偶来对各个加热块进行热调节。外部PID调节电子装置(0MR0N)以一定的间隔向加热电阻输送功率，以保持所需的温度。空气脉冲散热器与各个加热铝块连接，以当需要的时候在合理的时间内使它们降温。用轻微的压力来挤压加热元件之间的盒体并提供良好的热接触。仪器包含光学检测系统，其包括高强度激光源(nLight Pearl 2W)加透镜、发射过滤器和灵敏的CXD相机(Kodak KAF6303)，以在激光照射时拍摄微阵列的照片。在盒体夹持器的下侧做出一个开孔，从而激光光源达到微阵列，从下方进行照射。另一个开孔与照射轴成76°，从而使得来自微阵列的发射光在所谓的禁止角之内被CCD相机检测到。为了使塑料盒体中的液体移动，将一小段管与盒体连接并伸出加热系统外。该管安置在控制为I 500rpm (Faulhaber电子伺服DC电机)的小螺动泵(Marlow)中。将热电偶探头(传感器)与管的外侧面连接，以检测流体经过。液体携带比气相更高的热能，因此当在探头的水平通过时在温度分布中显示出尖峰。记录温度变化，并计算液体在检测室中的时点。传感器还允许对循环数进行计数。实施例6:在整合流式芯片装置中扩增子随着循环在捕捉探针上的积聚在该实施例中，流式芯片装置是图4和实施例4中提供的一次性塑料盒体。其具有信用卡的尺寸(80mmX 50mmX 2mm)并包括在4个不同温度区域内部的流动通道(通道截面:500ymX500ym)o流式芯片装置设计成安装在图5和图6以及实施例5中所示的F-RAP仪器中。仪器(F-RAP)允许用于扩增的热循环和流式装置中的液体流。对于该实验，光学块用不同的捕捉探针点样:这些捕捉探针中的三个是:-检测对照:(SEQID N0.1):5’ NH2-TACCTACTACGCTACACGAACCTACAAGACAAGATAAAGAC AGACTCATG-3’ Cy5。该标记的捕捉探针以500nM的浓度进行点样。-GUT 捕捉探针:(SEQ ID N0.11):5，NH2-ATTCTTATATCTTTACCTTTTCATCTTAACTACTCTACCTCTCAT TTATTGTGCGCCCCAGCCCTCACGGCATGATG-3’-鲍曼不动杆菌捕捉探针:(SEQID N0.12):5’ NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTCCAAATT ATTAATTAACGGTGCTGCTGGTATTGCTGTAGGTATGGC-3，⑶T和鲍曼不动杆菌捕捉探针以12μΜ的浓度点样并包括间隔部(下划线)。制备杂交混合物，包括Hybridization Mastermix2.0(Eppendorf, Hamburg, Germany)、20nM 的由 Oyster 标记的 GUT 检测探针(5，Oyster-CATCATGCCGTGAGGGCTGGGGCGCACAGTCAAATTA-3’，(SEQ ID N0.13))、InM 的纯化的鲍曼不动杆菌扩增子(由引物:5 ’ 0ys ter-GCATTCACAACTTCTGTCATG-3 ’ (SEQ ID N0.14 )和引物:5’-TACCGAAGTCCGTATGACTAAG-3’ (SEQ ID N0.15)生成)。将 50 μ L 的杂交混合物引入到流式盒体中，之后通过将2个泵口与泵管连接来封闭盒体，并引入到F-RAP仪器中。4个下加热块(盒体的温度区域1、2、3和4)分别设定在95°C、58°C、58°C和72°C，上加热块(盒体的温度区域1、2、3和4)分别设定在95°C、58°C、58°C和72°C。将热电偶探头固定在泵管上(在温度区域设定在72°C之后)，并记录液体的流动来对杂交的循环数进行计数。泵速被调整至 13rpm (v200)。当检测室处于气相时，在循环0、1、2、3、4、5、6、10和15拍摄5秒的图片。使用Maxim DL 软件(Diffraction Limited, Ottawa, Canada)对这些原始图片做出分析，并将GUT捕捉探针的点的原始信号强度减去该点的原始局部背景以及鲍曼不动杆菌捕捉探针的点的原始信号强度减去该点的原始局部背景信号的量化结果，相对于循环数进行绘图。结果提供在图8中。实施例7:在整合流式芯片装置的微阵列上检测的实时多重PCR在该实施例中，流式芯片装置是图4和实施例4中提供的一次性塑料盒体。其具有信用卡的尺寸(80mmX 50mmX 2mm)并包括在4个不同温度区域内部的流动通道(通道截面:500ymX500ym)o流式芯片装置设计成安装在图5和图6以及实施例5中所示的F-RAP仪器中。仪器(F-RAP)允许用于扩增的热循环和流式装置中的液体流。流式装置具有约240 μ L的总容积并包含退火区段中的检测室。该检测室容纳捕捉探针的微阵列(例如在实施例1中)，其中有捕捉探针对目标物流感嗜血杆菌扩增子特异，包括捕捉部和间隔部(下划线):
-流感嗜血杆菌捕捉探针:(SEQID N0.16):5’ NH2-TTATTCACAACATTTCGATTTTTGCAACTACTTCAGTTCACTC CAAATTACTCAATGAGAAATATTGCTGATGGGTTTTGGATATCCTG AAGA-3’制备100 μ L 的 PCR 混合物，包含 IX 的 PCR 缓冲液(Taps50mM、Tris_HCL95mM、MgCl22mM),吐温-200.1%，50nM/75nM (对于标记的引物)的29个引物对的混合物(引物混合物4.0 )(包括用于扩增流感嗜血杆菌的引物对(5 ’ Oyster-CGTGGCATTGCGAATTTCT-3 ’(SEQ ID N0.17)和 5，-TACGGCGTTAAACGTCCTAAAG-3’ (SEQ IDN0.18))、Supersalt Taq 聚合酶 1U/50 μ L、200 μ M 的 dNTP 混合物(对于 dATP、dCTP、dGTP)、100 μ M 的 dTTP 和 300 μ M的dUTP以及5 X IO5拷贝数的基因组流感嗜血杆菌目标DNA。I X的PCR缓冲液还包括如W02009/086608中描述的谷氨酸盐和右旋糖苷。在引入流式盒体中之前，将100 μ L的PCR混合物在99°C孵育5分钟，之后通过将2个泵口与泵管连接来封闭盒体，并引入到F-RAP仪器中。4个下加热块(盒体的温度区域
1、2、3和4 )分别设定在95 °C、58 °C、58 °C和72 °C，上加热块(盒体的温度区域1、2、3和4 )分别设定在95°C、58°C、58°C和72°C。将热电偶探头固定在泵管上(在温度区域设定在72°C之后)，记录液体的流动来对扩增的循环数进行计数。泵速调整到13rpm (v200)。当检测室 处于气相时，在循环2、5、10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40拍摄5秒钟的图片。当溶液在热电偶探头水平时，通过确定温度分布中的尖峰数来获得循环数。使用Maxim DL 软件(Diffraction Limited, Ottawa, Canada)对这些原始图片做出分析，并对I个点的流感嗜血杆菌捕捉探针的原始信号强度减去该点的原始局部背景信号进行量化。结果提供在图1Oa中。在循环26检测流感止血杆菌扩增子。通过热电偶探头计数的循环数提供在图1Ob中。实施例8:使用不同体积的PCR溶液在整合流式芯片装置的微阵列上检测的实时多重PCR如实施例7所述进行实验，5 X IO5拷贝数的基因组流感嗜血杆菌作为目标DNA。在填充有不同体积(50 μ L、150 μ L或200 μ L)的PCR溶液的三个流式芯片装置中进行PCR。在引入到流式盒体中之前，将PCR混合物于99°C孵育5分钟，之后通过将2个泵口与泵管连接来封闭盒体，并引入到F-RAP仪器中。4个下加热块(盒体的温度区域1、2、3和4)分别设定在95°C、58°C、58°C和72°C，上加热块(盒体的温度区域1、2、3和4)分别设定在95°C、58°C、58°C和72°C。将热电偶探头固定在泵管上(在温度区域设定在72°C之后)，记录液体的流动来对扩增的循环数进行计数。泵速调整至13rpm (v200)。对于具有50μ L 溶液的装置，在循环 1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和 40，当检测室处于气相时，拍摄5秒的图片。对于具有150μ L 溶液的装置，在循环 1、2、3、4、5、7、10、12、14、16、18、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和 40，当检测室处于气相时，拍
摄5秒的图片。对于具有200 μ L 溶液的装置，在循环 3、4、5、6、7、10、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 和 40，当检测室处于液相时，拍摄5秒的图片。对于50 μ L和150 μ L的体积,通过在溶液处于热电偶探头水平时确定温度分布中的尖峰数来获得循环数。尖峰是由传感器位置前方的溶液流通给出的，且一个尖峰对应于一个扩增循环。对于200 μ L的体积，根据系统的参数(流动通道截面、在盒体的不同温度区域内部的长度、检测室容积和溶液的流速)将循环持续时间计算为100秒。使用Maxim DL 软件(Diffraction Limited, Ottawa, Canada)对这些原始图片做出分析，并对I个点的流感嗜血杆菌捕捉探针的原始信号强度减去该点的原始局部背景信号进行量化。结果提供在图 11中。PCR溶液的体积对检测循环有很大的影响。出人意料地，PCR溶液体积越大，越早地检测到扩增子。200 μ L的最大体积给出最低的检测循环(循环21)，之后是150 μ L的体积(循环22)和50 μ L (循环34)。
权利要求
1.一种对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的方法，包括以下步骤: a)提供流式芯片装置，包括: -流动通道，其截面在0.01 IOmm2之间且容积为VI，其中所述流动通道被配置成使得引入所述流动通道中的溶液经由所述流动通道而循环； -检测室，其与所述流动通道流体连通，所述检测室具有光学透明的固体支持物以及包括多于4种固定在所述透明固体支持物的表面的局部区域中的捕捉分子的微阵列，其中所述检测室的高度低于Imm且容积为V2，且其中V2/V1比率在0.001与0.5之间； -至少2个、优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于所述流动通道的不同位置，其中一个温度区包括所述检测室并且具有使所述目标多核苷酸分子杂交到所述捕捉分子的温度； b)将体积为V3且含有目标多核苷酸分子的溶液引入到所述流动通道和用于多核苷酸分子扩增的试剂中，其中V3/ (V1+V2)比率高于0.02且低于I ; c)将所述溶液进行至少5个扩增循环，以获得标记的目标多核苷酸分子，其中通过使所述溶液经所述流动通道和相同的检测室在不同温度区之间循环，从而得到一个扩增循环，其中一个扩增循环进行少于3分钟； d)通过检测从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出且在通过光束使荧光染料激发之后测量到的荧光，从而在至少3个、优选为至少5个不同的扩增循环中从杂交的目标多核苷酸分子测量不同扩增时点的荧光信号； e)分析从所述局部区域得到的信号值，以对存在于所述样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增循环进行少于2分钟，优选少于I分钟。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测室具有选自椭圆形、卵形、长斜方形、六边形、八 边形、菱形的形状。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中体积V1+V2+V3包括气相和液相两种相。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V2/V1比率在0.01和0.1之间。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中V3/(V1+V2)比率高于0.5，优选高于0.75，甚至高于0.9，并且低于I。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于测量荧光信号的不同扩增时点与扩增循环对应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中通过流式芯片传感器的数据分析来确定扩增循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其中从所述流式芯片装置特征的V1+V2以及流速来计算扩增循环。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过包括变性、退火和延伸步骤的PCR来获得扩增。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标记的目标多核苷酸分子通过引入荧光染料标记的扩增前体而被荧光标记。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出的荧光进行检测是以观测角通过承载有固定的捕捉分子的光学透明固体支持物来进行检定的，其中所述观测角在禁止角内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕捉分子具有长至少6.Snm且优选为至少20个核苷酸并优选为多于40个核苷酸长度的序列的间隔物。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微阵列包括荧光标记的捕捉分子，与循环I相比，其在扩增的循环35中保持多于50%的荧光、优选多于80%的荧光、甚至更好为多于90%的突光。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在气相中对来自所述杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号进行测量。
16.根据权利要求1 14中任一项所述的方法,其中在含有所述标记的目标多核苷酸分子的扩增溶液的存在下，对来自所述杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号进行测量。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述检测室的检测部中的液体的高度优选在10和250 iim之间，优选在50和150 之间。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过对所述流动通道中液相位置的时间控制，来获知所述流动通道和/或所述检测室中扩增溶液的位置。
19.根据权利要求18所述的方法，其中根据在所述流动通道的至少一个位置得到的信号测量、根据气/液相变来得知液相位置，其中所述测量由温度变化、荧光信号变化、电信号、发光或光吸收变化获得。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用累加的点值随扩增循环进行制图，以对存在于所述样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过比较为达到固定值(CT)所必需的扩增循环数和参考多核苷酸分子的CT所必需的扩增循环数来对存在于所述样品中的目标多核苷酸分子进行定量。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对微阵列图像进行信号值分析，所述微阵列图像具有通过在扩增之前或在前十次扩增循环的一次中摄取的图像的像素值而校正的像素值的微阵列图像进行信号值分析。
23.一种用于检定微流体装置内的相变用于跟踪实时PCR循环的方法，包括以下步骤: a)提供流式芯片装置，包括: -流动通道，其截面在0.01 IOmm2之间且容积为VI，其中所述流动通道被配置成使得引入所述流动通道中的溶液经所述流动通道而循环； -检测室，其与所述流动通道流体连通，所述检测室具有光学透明的固体支持物并且包括至少一种固定在所述透明固体支持物的表面的局部区域中的捕捉分子，其中所述检测室的高度低于Imm且容积为V2 ； -至少2个、优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于所述流动通道的不同位置，其中一个温度区包括所述检测室并且具有使所述目标多核苷酸分子杂交到所述捕捉分子的温度； b)流式芯片传感器，用于检测液体/空气和/或空气/液体的相变； c)将体积为V3且含有目标多核苷酸分子的溶液引入到所述流动通道和用于多核苷酸分子扩增的试剂中，其中V3/ (V1+V2)比率高于0.02且低于I ; d)将所述溶液进行至少5个扩增循环，以获得标记的目标多核苷酸分子，其中通过使所述溶液经所述流动通道和相同的检测室在不同温度区之间循环，从而得到一个扩增循环，其中一个扩增循环进行少于3分钟； e)通过流式芯片传感器的数据分析，来确定所述扩增循环； f)通过检测从具有杂交的目标多核苷酸的表面的局部区域发出且在通过光束使荧光染料激发之后测量到的荧光，从而在至少3个、优选为至少5个不同的扩增循环中从杂交的目标多核苷酸分子测量不同扩增循环中的荧光信号； g)分析随着扩增循环从所述局部区域得到的信号值，以对存在于所述样品中的目标多核苷酸分子进行检测和/或定量。
24.一种用于对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的流式芯片装置，包括: -流动通道，布置在基部内，所述流动通道的截面在0.01 IOmm2之间且容积为VI，其中所述流动通道被配置成使得引入所述流动通道中的溶液经由所述流动通道而循环； -检测室，与所述流动通道连接，所述检测室具有固定在其一个表面上的微阵列，所述微阵列包括多于4种固定在所述表面的局部区域中的捕捉分子，其中所述检测室的高度低于1_且容积为V2，且其中V2/V1比率在0.001与0.5之间； -至少2个、优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于所述流动通道的不同位置，其中一个温度区包括所述检测室且具有允许所述目标多核苷酸分子杂交到所述捕捉分子的温度； -入口，与所述流动通道流体连通，溶液经所述入口引入到所述流动通道中； 其中所述捕捉分子固定在光学透明固体支持物的表面(SI)上，其中所述固体支持物的折射率高于1.3且厚度为至少0.5mm，优选为至少3mm，其中所述固体支持物具有相对于支持物的固定有所述捕捉分子的表面倾斜的两个面(S2和S3)，一个面(S2)是光学透明的并用于聚集从捕捉分子的局部区域发出的光，其与固体支持物表面相比倾斜90 60°的角度，另一个相对的面(S3)为黑色或涂覆有黑色或涂覆有具有与发射光波长对应的吸收的颜色。
25.根据权利要求24所述的流式芯片，其中所述基部包括不透明聚合物。
26.一种用于对存在于样品中的目标多核苷酸分子进行实时扩增和检测的设备，包括: a)流式芯片装置，包括: -流动通道，其截面在0.01 IOmm2之间且容积为VI，其中所述流动通道被配置成使得引入所述流动通道中的溶液经由所述流动通道而循环； -检测室，与所述流动通道连接，所述检测室具有固定在其一个表面上的微阵列，所述微阵列包括多于4种的固定在所述表面的局部区域中的捕捉分子，其中所述检测室的高度低于1_且容积为V2，且其中V2/V1比率在0.001与0.5之间； -至少2个、优选3个温度被调控的不同温度区，各个温度区位于所述流动通道的不同位置，其中一个温度区包括所述检测室且具有允许所述目标多核苷酸分子杂交到所述捕捉分子的温度；b)用于所述流式芯片装置的夹持器； C)加热系统，在至少两个不同温度区的前面； d)温度控制器，布置为调节所述至少两个不同温度区内的温度； e)任选的流式芯片传感器； f)照射灯源； g)操作地布置成经所述流动通道输送流体的系统； h)检测器，用于测量来自杂交的目标多核苷酸分子的荧光信号，其中局部区域的发射表面在约0.1mm2和约75mm2之间,其中对于从具有杂交的目标多核苷酸分子的表面的局部区域发出的荧光的检测，以禁止角之内的观测角通过承载有固定的捕捉分子的光学透明固体支持物进行检定； 其中不同的部件被整合到同一个设备中，其中所述流式芯片装置相对于所述检测器的位置是固定的。
27.根据权利要求26所述的设备，其中所述捕捉分子固定在折射率高于1.30且厚度为至少0.5_、优选至少3_的光学透明固体支持物的表面上，其中所述固体支持物具有相对于所述支持物的固定有捕捉分子的面(SI)倾斜的两个面(S2和S3)，一个面(S2)为光学透明的并用于聚集以禁止角(9 obin)从捕捉分子的局部区域发出的光，并相对于固体支持物表面倾斜90 60°的角度，另一个相对的面(S3)为黑色或涂覆有黑色或涂覆有具有与发射光波长对应的吸收的颜色，其中所述装置位于所述设备之上，从而使以禁止角(9 obin)发出的光经过倾斜面S2而达到所述检测器。
28.根据权利要求26 27中任一项所述的设备，其中所述流式芯片传感器是热检测器、荧光检测器或光吸收 检测器。
29.根据权利要求26 28中任一项所述的设备，还包括: -用于存储不同测量的数据的存储系统； -重复照射、检测和存储步骤的控制器； -所述流式芯片传感器的数据分析，以确定液体在所述流式芯片装置中的位置； -用于处理数据从而对在扩增之前存在于所述溶液中的多核苷酸分子的量进行检测和/或定量的程序。
全文摘要
本发明的方法涉及一种通过生物样品在循环的流式芯片溶液中流经扩增所需的不同温度进行扩增以及在特异捕捉分子的微阵列上对其进行实时检测，从而在可能的其他化合物中对存在于生物样品中的至少一种多核苷酸目标化合物进行识别和/或定量的方法。
文档编号G01N21/64GK103249488SQ201180049372
公开日2013年8月14日 申请日期2011年10月6日 优先权日2010年10月12日
发明者I.亚历山大, S.德罗科, J.勒马克勒, W.普鲁斯特 申请人:艾本德股份公司
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