专利名称：用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种适用于针对残留杀螟硫磷进行分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，该试剂盒主要适用于快速测定批量的水样、土壤等环境样品和中毒样品及蔬菜等食品样品中的杀螟硫磷残留，属于残留农药检测领域。
背景技术：
由于农药使用技术的不断发展和使用规模的不断扩大，农药残留造成的环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们的关注和担忧，在生活消费和对外贸易中对农药残留的限制也越来越严格，对分析检测对象、种类、数量、范围、指标等诸多方面提出了新的要求和更高的标准。在农药及其代谢物的残留分析检测方面，传统的分析检测方法主要依靠气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但这些分析方法通常都需要繁琐复杂的前处理工作，因此检测工作中工作量大、仪器昂贵、并需要有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及廉价的检测技术能在田间、市场或实验室内进行大批量的检测应用。免疫分析法真正具备了这些优点，所以尽管将免疫分析用于农药残留分析的时间很短，仍然很快用于环境样品和食品样品中农药残留的分析。
杀螟硫磷[fenitrothion，O，O-二甲基-O-(3-甲基-4-硝基苯基)硫代磷酸酯]，商品名为杀螟松等，是一种广谱有机磷杀虫剂，广泛应用于稻谷、大麦、玉米及经济类作物的害虫防治，也可防治棉花、蔬菜、茶叶、果树上的多种害虫，对稻螟有特效，也可专用于原粮及种子粮的储粮害虫。杀螟硫磷对高等动物低毒，常温下对日光稳定，遇碱易分解失效，在水果、蔬菜上的安全间隔期为10～15天。随着杀螟硫磷等农药使用量的增加，尤其是在作物和蔬菜上的大量使用，对人体健康造成许多的�：Γ庖丫鹑嗣堑钠毡楣刈�。因此开发一种简单快速、适用于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的应用价值。
在农药残留分析中，杀螟硫磷的常规检测方法是气相色谱法，但该方法需要对样品进行繁琐的提取、净化、浓缩等前处理步骤，且该方法需要昂贵的色谱仪器，操作过程复杂且耗时较长，不适合于大批量样品的检测与分析。免疫分析为杀螟硫磷的残留检测提供了一个新的分析检测途径。
发明内容要解决的问题本发明的目的是提供一种检测杀螟硫磷残留的酶联免疫吸附测定试剂盒；本发明的另一目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度、操作方法简单快速、并能用于大量样品快速检测残留杀螟硫磷的试剂盒。
技术方案本发明是一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它基于免疫反应和酶促反应，能够检测水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中杀螟硫磷的残留。本发明为适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板/试管和设在盒体内的试剂，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗杀螟硫磷抗体特异性结合的包被抗原，并用2％～5％明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗杀螟硫磷抗体(适用于间接ELISA)、杀螟硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(适用于间接竞争ELISA)或辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体(适用于直接竞争ELISA)、底物、显色物质和反应终止液，其中包被抗原(FEN-OVA)用pH9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L，即包被缓冲液)稀释成0.5～4.0μg/mL，并已点加到96孔/40孔酶标板上，100μL/孔，并已封闭；其中包被抗原为半抗原(I)O-甲基-O-(3-甲基4-硝基苯基-N-(2-羧乙基)硫代磷酰胺或者半抗原(II)O，O-二甲基-O-(3-甲基-4-(6-羧己基酰氨基)苯基)硫代磷酸酯与卵清蛋白的复合物；洗涤液(反应稀释液)一瓶，40～80mL/瓶，组成比例为磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾0.1～0.3g、吐温-20 0.5～3mL、双蒸水500～1000mL，为正常使用的15～30倍浓缩液；底物稀释液一瓶，30～50mL/瓶，配制如下柠檬酸3～6g、磷酸氢二钠1～3g、双蒸水1000mL，为正常使用的5～10倍浓缩液；酶底物为30％过氧化氢，10～15mL/瓶，显色剂为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，10～15mL/瓶或者邻苯二胺(OPD)固体粉末4～6支，10～20mg/支；抗杀螟硫磷抗体(IgG)4瓶，100mL/瓶，工作浓度为1∶500～1000(间接ELISA法)；所述的抗杀螟硫磷抗体(IgG)为通过半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫原注射家兔后产生的能与杀螟硫磷分子、杀螟硫磷包被原进行特异性结合的免疫球蛋白(IgG)；辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体(直接ELISA法)或者辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(间接ELISA法)一瓶，200～400μL/瓶，为正常使用时800～1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标记的杀螟硫磷抗体为抗杀螟硫磷抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；反应终止液一瓶，30～50mL/瓶，为2mol/L硫酸；杀螟硫磷不同浓度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)标准溶液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。
试剂盒测定原理首先将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制备得到的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测农药和抗杀螟硫磷抗体(间接ELISA法)或酶标抗杀螟硫磷抗体(直接ELISA法)，固相包被原、待测农药与抗杀螟硫磷抗体(或酶标抗杀螟硫磷抗体)进行竞争性结合反应，待测农药含量多，则被结合在固相抗原上的抗体少，反之结合在固相抗原的抗体(或酶标抗体)多，反应后再加入底物溶液出现显色反应加以测定(间接ELISA法，加底物溶液前还需再加入酶标二抗)。当抗体或酶标抗体的量一定时，样品中的待测农药量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知量农药的标准曲线和待测样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。
有益效果本发明的优点是能用于水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中杀螟硫磷残留的检测，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测批量的样品，样品检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒采用强特异性、高效价抗体，提高检测的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过12个月。本发明简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法，具有重要的实际应用价值。
图1是直接竞争ELISA法杀螟硫磷的标准曲线；图2是间接竞争ELISA法杀螟硫磷的标准曲线。
具体实施方式
在下面实施例中更详细地描述本发明，并非对本发明的限制，其中比例和百分比在没有特殊说明的情况下均为重量/重量比。
实施例1本发明产品包括盒体、盒体内的96孔/40孔酶标板和检测试剂，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗杀螟硫磷抗体特异性结合的包被抗原，并用2％～5％的明胶进行封闭。
盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、抗杀螟硫磷抗体(适用于间接ELISA)、杀螟硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(适用于间接竞争ELISA)或辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体(适用于直接竞争ELISA)、底物、显色物质和反应终止液，配制方法如下洗涤液(反应稀释液)40mL，组成比例为磷酸二氢钾0.1g、磷酸氢二钠4g、氯化钾0.1g、吐温-20 3mL、双蒸水1000mL，为正常使用的15～30倍浓缩液；底物稀释液50mL，配制如下柠檬酸3g、磷酸氢二钠1g、双蒸水1000mL，为正常使用的5～10倍浓缩液；酶底物为30％过氧化氢15mL，显色剂为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶液15mL或者邻苯二胺(OPD)固体粉末20mg；抗杀螟硫磷抗体(IgG)400mL，工作浓度为1∶1000(间接ELISA法)；所述的抗杀螟硫磷抗体(IgG)为通过半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫原注射家兔后产生的能与杀螟硫磷分子、杀螟硫磷包被原进行特异性结合的免疫球蛋白(IgG)；辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体(直接ELISA法)或者辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(间接ELISA法)200μL，为正常使用时800～1500倍浓缩液；上述辣根过氧化物酶标记的杀螟硫磷抗体为抗杀螟硫磷抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物；反应终止液30mL，为2mol/L硫酸；杀螟硫磷不同浓度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)标准溶液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释10倍。
实施例2酶标抗体的制备(改良过碘酸钠法)，具体操作如下称取5～10mg辣根过氧化物酶HRp溶解于1L蒸馏水中，加入0.2～04mL新配的0.1mol/L NalO4溶液，室温下避光搅拌15～30min。将上述溶液装入透析袋中，用1mmol/L pH4.4的醋酸盐缓冲溶液透析，4℃过夜。用pH9.5的碳酸盐缓冲溶液使上述醛化的HRP溶液的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入1～2mL含有10～20mg纯化抗体的0.01mol/L碳酸盐缓冲溶液，室温避光搅拌2～3小时。加0.1～0.2mL新配的4mg/mL NaBH4溶液，混匀，再置4℃2～3小时。将反应液装入透析袋中，用0.15mol/L pH7.4的PBS透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃1～2小时。3000rpm离心半小时，弃上清液。沉淀物用半饱和硫酸铵溶液洗而二次，最后沉淀物溶解于少量0.15mol/L pH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/L pH7.4的PBS缓冲液透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，离心，上清液即为酶结合物，用等量甘油分装后，分别于-4℃、-20℃保存。
实施例3包被酶标板的制备包被抗原(FEN-OVA)用pH9.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5～4μg/mL，在酶标板的每孔加100μL，4℃下包被过夜或37℃包被2小时，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入150μL 2％～5％的明胶，放入37℃恒温箱中封闭0.4～1小时后，用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。
实施例4检测样品的前处理水样过滤后即可取样进行ELISA分析。
土样取10g土壤样本用20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。
蔬菜样品取蔬菜样品用粉碎机粉碎后称取10g，用20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。
血液取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。
洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)取10mL洗胃液，用稀HCl调节pH值到中性后即可用ELISA法进行分析。
呕吐物取样品研碎，离心取上清液用ELISA法进行分析。
实施例5试剂盒操作过程如下1)直接竞争ELISA法取出一块包被有杀螟硫磷包被抗原的酶标板，恢复到室温后备用；加入50μL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做2～4个重复；加入50μL稀释的酶标抗体，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗涤2～6次，拍干；然后每孔加入100μL底物液与显色物质的混合液，轻微振匀，并在37℃暗处孵育15～25分钟进行显色反应；加入50μL反应终止液，混合好后，测定0D450nm或者OD490nm值。
2)间接竞争ELISA法取出一块包被有杀螟硫磷包被抗原的酶标板，恢复到室温后备用；加入50μL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做2～4个重复；加入50μL稀释好的抗体，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗涤2～6次，拍干；加入100μL稀释好的酶标二抗，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗涤2～6次，拍干；然后每孔加入100μL底物液与显色物质的混合液，轻微振匀，并在37℃暗处孵育15～25分钟进行显色反应；加入50μL反应终止液，混合好后，测定OD450nm或者OD490nm值。
3)以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值和抑制率
ODmax为不加药时的吸光值，ODx为农药X时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。计算的标样值绘成一个对应杀螟硫磷浓度(mg/L)的半对数坐标系统曲线图，直接竞争ELISA法的校正曲线在0.01～10mg/L范围内为线性；间接竞争ELISA法的校正曲线在0.005～10mg/L范围内为线性，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与抑制率求出线性方程，然后求出对应样品的浓度。
实施例6保存期试验将试剂盒放置于4℃和-20℃保存，分别取0，20，40，60，120，180，240，300和360d的试剂盒，以最佳抗体抗原工作浓度为测定浓度，进行标准样品检测，以测定其检测效果。保存期测定结果如下表表1.直接竞争ELISA法试剂盒保存期试验结果
表2.间接竞争ELISA法试剂盒保存期试验结果
以上结果可以看出，试剂盒在4℃下至少可保存12个月以上。
实施例7试剂盒灵敏度测定将杀螟硫磷标准溶液稀释成系列浓度，用直接ELISA法分析，得到以下曲线(图1)，由图可得，直接ELISA法回归方程为y＝44.92+16.44x，杀螟硫磷在0.01～10mg/L范围内，log(B/BO)与杀螟硫磷浓度的对数值呈线性关系，相关系数为r2＝0.9431，检出限为0.01mg/L。用间接ELISA法分析得到以下曲线(图2)，由图可得，间接ELISA法的回归方程为y＝63.34+9.82x，杀螟硫磷在0.005～10mg/L范围内，log(B/BO)与杀螟硫磷浓度的对数值呈线性关系，相关系数为r2＝0.9845，检出限为0.005mg/L。
实施例8准确度试验和精密度试验取三个不同浓度的杀螟硫磷标样，添加到空白样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。试剂盒回收率的结果如下，水为96.8％～106.7％，蔬菜为110.8％～117.5％。水样测定的变异系数均低于5.5％，蔬菜的变异系数均低于11.5％。
实施例9试剂盒特异性试验选择杀螟硫磷类似物如甲基对硫磷、对硫磷、倍硫磷、3-甲基-4-硝基苯酚等，反应步骤同试剂盒操作过程，得到各种农药的抑制中浓度，再用下式计算农药对杀螟硫磷的交叉反应性。交叉反应率越�。从�
的特异性越强。交叉反应率可按下式计算本试验测定结果见表3。从表3可知，间接ELISA法抑制率达50％时，杀螟硫磷所需浓度为13μg/L，其他几种农药所需浓度均大于800μg/L。说明试剂盒的特异性好，可保证对样品中杀螟硫磷残留测定结果的可靠性。
表3 试剂盒特异性试验
权利要求
1.一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和/或试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗杀螟硫磷抗体发生特异性结合反应的包被抗原，并用2％～5％明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、抗杀螟硫磷抗体、杀螟硫磷标准溶液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体或者辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体、底物和反应终止液。
2.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的包被抗原为半抗原(I)O-甲基-O-(3-甲基4-硝基苯基-N-(2-羧乙基)硫代磷酰胺或者半抗原(II)O，O-二甲基-O-(3-甲基-4-(6-羧己基酰氨基)苯基)硫代磷酸酯与卵清蛋白的复合物。
3.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于抗杀螟硫磷抗体为通过杀螟硫磷半抗原和牛血清白蛋白合成的偶联物作为免疫原注射家兔后产生的能与杀螟硫磷分子、杀螟硫磷包被原特异性结合的免疫球蛋白(IgG)。
4.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于酶标抗杀螟硫磷抗体为杀螟硫磷抗体(IgG)与辣根过氧化物酶(HRP)结合形成的复合物。
5.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的洗涤液组成比例为磷酸二氢钾0.1～0.3克、磷酸氢二钠2～4克、氯化钾0.1～0.3克、吐温20 0.5～3mL、双蒸水500～1000mL。
6.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的底物稀释液组成比例为柠檬酸3～6克、磷酸氢二钠1～3克、双蒸水500～1000mL。
7.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的底物为30％过氧化氢10～15mL和邻苯二胺(OPD)固体粉末40～120mg。
8.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的反应终止液为2mol/L硫酸。
9.根据权利要求1所述的一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的作为包被液的碳酸盐缓冲溶液，配制方法为1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L，pH＝9.6。
全文摘要
本发明公开了一种适用于杀螟硫磷残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板/试管及设在盒体内的试剂。在酶标板的每个孔内，由包被液包被能与抗杀螟硫磷抗体特异性结合的包被抗原，并用2％～5％明胶进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、杀螟硫磷标准溶液、抗杀螟硫磷抗体(间接ELISA)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(间接ELISA)或者辣根过氧化物酶标记的抗杀螟硫磷兔抗体(直接ELISA)、底物、显色物质和反应终止液。本发明能用于水、土壤、蔬菜、水果等食品中及中毒样品中杀螟硫磷残留的快速检测，样品的前处理过程简单，能同时检测批量的样品，样品检测成本低于传统的检测方法。
文档编号G01N33/547GK1677108SQ200410030740
公开日2005年10月5日 申请日期2004年4月2日 优先权日2004年4月2日
发明者韩丽君, 钱传范 申请人:韩丽君, 钱传范
专业数控铣床产品供应商
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