专利名称：一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测方法，特别涉及一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用。
背景技术：
近年来，随着沿海经济的高速增长和对外贸易的加强，港口的建设和远洋运输能力不断增强，沿海水域富营养化急剧增加。有毒、有害赤潮呈不断上升的趋势，造成沿海水产养殖的重大经济损失。有毒、有害赤潮的研究亦成为国际赤潮与海洋环境研究领域重要的议题和内容。现场观察发现，1997年10月间发生在广东饶平柘林湾的球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)赤潮使该湾养殖的鱼类全部死亡,损失达六千万人民币；2005年 5月间发生在湛江港养殖区的同种赤潮，仅引起少数鱼类死亡，在渤海湾发生的同种赤潮对鱼类也没有毒性。上述现象均说明环境因子可能影响着藻类毒素的生成。鱼毒性赤潮藻溶血毒素毒性很强，传统的检测方法很难快速检测该藻是否具鱼毒性，且测定结果在时间上明显滞后。当毒性实验完成时，赤潮灾害或许已经发生，虽然在某种程度上这些方法可以避免人类中毒，在保障海产品食用安全方面发挥一定作用，但不能化解和减少因赤潮毒素对养殖业带来的巨大经济损失。只有从毒素源头上入手，及时、准确的预报产毒生物的消长情况，才有可能从根本上克服赤潮毒素对人类的威胁、减少因之带来的经济损失。赤潮毒素主要来源于赤潮藻，因此迫切需要建立快速、准确的产毒藻株鉴别技术，以实现赤潮的应急监测。三维荧光光谱法是近二十年发展起来并趋于成熟的荧光分析技术。该方法具有检测速度快、简单易携、高灵敏度的特点。目前被广泛应用于油种鉴别、水体检测以及中药鉴别等分析领域。目前国内外尚未有人利用三维荧光分析技术来检测鱼毒性赤潮藻溶血毒素活性的大小。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测藻类溶血毒素活性的方法。本发明的另一目的在于提供所述检测藻类溶血毒素活性的方法的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种检测藻类溶血毒素活性的方法，包含以下步骤(I)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，激发波长为400 600nm， 发射波长为650 750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；(3)在波长 λ Em = 650 700nm，波长 λ Em = 725 750nm，波长 λ Ex = 400 425nm出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在波长λ Em = 650 700nm，波长λ Em = 725 750nm，波长λ Ex = 400 425nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；(4)将步骤(2)得到的荧光特征谱进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4· 311χ4+16. 307χ5_9· 476χ6_0· 173χ7+3 .866χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；γ2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8· 457χ6+4. 273χ7+ 8. 653χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X为自变量值，即步骤(2)测得的特征荧光谱的荧光强度；y为测得的溶血活性数值；当检测样品时，分别计算I1和y2值，取大者为其y，根据以下标准判定藻细胞样品毒性的大小y = 10 20HU为中毒性；y < IOHU为弱毒性；y > 20HU为强毒性。步骤⑴中所述的发射波长优选为650 680nm或725 750nm ；步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6. 5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析，再利用SPSS13. O进行Fisher判别，最后通过0rigin8. O制图，得到荧光特征谱。步骤(4)所述的Fisher判别优选通过SPSS 13. O进行；所述检测藻类溶血毒素活性的方法在海洋赤潮水体毒性检测中应用；所述的藻类优选为鱼毒性赤潮藻，更优选为海洋卡盾藻、卵圆卡盾藻或米氏凯伦藻中的至少一种。本发明的原理藻类溶血毒素主要成分为糖脂类和多不饱和脂肪酸类，而这些物质的合成直接与光合作用有关，叶绿素荧光可以全面反映光合作用全过程，本发明以光合作用为中心点，把糖脂类的合成与藻类的叶绿素荧光变化联系起来。通过藻类活体荧光特征的识别，可以判定糖脂类物质的变化，从而确定该藻类细胞的溶血活性大小。本发明首先通过传统的洋地黄皂甙溶血活性测定方法分别测定不同溶血性的鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的溶血毒素，再将之与鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的三维荧光进行分析，最终确定三维荧光数据的处理过程，从而与传统的洋地黄皂甙溶血活性测定方法得到的数据对应。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明成功解决了传统检测方法时间滞后的难题，在我国实属首创。本发明改变传统检测方法时间滞后、被动的窘境，现场的操作性强，化解和减少因赤潮毒素对养殖业带来的巨大的经济损失，促进海产品安全体系的建立。
图I是鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻的Fisher判别图。图2是鱼毒性赤潮藻溶血活性高低的Fisher判别图。图3是卵圆卡盾藻小波分解后的荧光特征谱图；其中，a表不培养液中铁浓度为IX 10_5mol/L ;b表不培养液中铁浓度为 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X 10^mol/L ;d表示培养液中铁浓度为2 X105mol/L。图4是海洋卡盾藻(香港株)小波分解后的荧光特征谱图；其中，a表示培养液中铁浓度为I X l(T5mol/L ;b表示培养液中铁浓度为 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X 10^mol/L ;d表示培养液中铁浓度为 2 X105mol/L。图5是海洋卡盾藻(日本株)小波分解后的荧光特征谱图； 其中，a表不培养液中铁浓度为IX 10_5mol/L ;b表不培养液中铁浓度为 O. 5 X 10_8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X 10^mol/L ;d表示培养液中铁浓度为 2 X105mol/L。图6是米氏凯伦藻小波分解后的荧光特征谱图；其中，a表示培养液中铁浓度为IX l(T5mol/L O. 5 X l(T8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。图7是东海原甲藻小波分解后的荧光特征谱图；其中，a表示培养液中铁浓度为IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。图8是锥状斯氏藻小波分解后的荧光特征谱图；其中，a表示培养液中铁浓度为IX l(T5mol/L
O.5 X l(T8mol/L ;c表示培养液中铁浓度为I X l(T7mol/L 2 X105mol/L。
;b表不培养液中铁浓度为 ;(1表示培养液中铁浓度为
;b表不培养液中铁浓度为 ;(1表示培养液中铁浓度为
;b表不培养液中铁浓度为 ;(1表示培养液中铁浓度为
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(I)分别培养海洋卡盾藻香港株(已在“海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离”公开)、海洋卡盾藻日本株(已在“海洋卡盾藻日本株过氧化氢产生的影响因素”公开)、卵圆卡盾藻(已在“五种赤潮藻单克隆抗体的制备”公开)、米氏凯伦藻(已在“米氏凯伦藻溶血毒素的溶血反应特征”公开)、东海原甲藻(已在“混合培养条件下几种赤潮藻对无机氮源的竞争生长研究”公开)和锥状斯氏藻(已在“多氯联苯对2种微藻的急性毒性研究”公开)。以上藻类均来自暨南大学赤潮与水环境研究中心。①培养基的制备先将自然海水用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，收集I. 2L滤液于2L锥形瓶中，121 °C、15psi下灭菌25min，冷却到室温，然后加入f/2培养液改良配方(如表I所示)，根据下表得到的培养基铁离子浓度为lX10_5mOl/L。由于铁离子的浓度影响藻的溶血活性，因此，再分别制备得到铁离子浓度为O. 5X 10_8mol/L、l X 10_7mol/L和2X 10_5mol/L 的培养基。使用不同铁离子浓度的培养基分别培养藻类。表I f/2培养基
权利要求
1.一种检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于包含以下步骤(1)通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，激发波长为400 600nm，发射波长为650 750nm，得到藻细胞样品的三维荧光数据；(2)将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；(3)在波长λ Em = 650 700nm，波长 λ Em = 725 750nm，波长 λ Ex = 400 425nm 出现与藻类的溶血活性强弱一致的荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻；若在波长λ Em = 650 700nm，波长λ Em = 725 750nm，波长λ Ex = 400 425nm没有出现荧光光谱强度变化，初步判断所检测的藻细胞样品为非鱼毒性赤潮藻；(4)将步骤(2)得到的荧光特征谱进行Fisher判别，Fisher判别函数方程为Y1 = -I. 706-105. δΟδχ^θ. 273χ2+93. 118χ3_4. 311χ4+16. 307χ5_9. 476χ6_0. 173χ7+3. 866 χ8+10. 436χ9_6. 751χ10-6. 511χη+94. 690χ12_104. 538χ13 ；Y2 = O. 963-112. 478χ1-51. 634χ2+62. 196χ3+76. 226χ4+15. 826χ5_8. 457χ6+4. 273χ7+8. 65 3χ8+5. 382χ9+0. 038χ10+45. 365χη_4. 937χ12_33. 386χ13 ；其中X为自变量值，即步骤(2)测得的特征荧光谱的荧光强度；y为测得的溶血活性数值；当检测样品时，分别计算Y1和y2值，取大者为其y，根据以下标准判定藻细胞样品毒性的大小y = 10 20HU为中毒性；y < IOHU为弱毒性；y > 20HU为强毒性。
2.根据权利要求I所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于步骤(I)中所述的发射波长为650 680nm或725 750nm。
3.根据权利要求I所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于步骤(2)所述的三维荧光数据首先通过Matlab6. 5软件消除瑞利散射、最大归一化以及Coif2小波分析， 再通过SPSS13. O进行Fisher判别，最后通过0rigin8. O制图，得到荧光特征谱。
4.根据权利要求I所述的检测藻类溶血毒素活性的方法，其特征在于步骤(4)所述的Fisher判别通过SPSS 13. O进行。
5.权利要求I 4任一项所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用。
6.根据权利要求5所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用，其特征在于所述的藻类为鱼毒性赤潮藻。
7.根据权利要求6所述的检测藻类溶血毒素活性的方法在赤潮水体鱼毒性的检测中应用，其特征在于所述的鱼毒性赤潮藻为海洋卡盾藻、卵圆卡盾藻或米氏凯伦藻中的至少一种。
全文摘要
本发明公开一种检测藻类溶血毒素活性的方法与应用。该方法通过荧光分光光度计测定藻细胞样品的三维荧光，得到藻细胞样品的三维荧光数据；再将藻细胞样品的三维荧光数据转换成TXT文件格式，根据Delaunay三角形方法，消除藻类三维荧光光谱的瑞利散射；再将三维荧光光谱最大归一化，然后对其三维荧光光谱进行Coif2小波分析，选取荧光特征谱；根据荧光特征谱初步判断所检测的藻细胞样品为鱼毒性赤潮藻与非鱼毒性赤潮藻；再将荧光特征谱进行Fisher判别，从而判定藻细胞样品毒性的大小。本发明成功解决了传统检测方法时间滞后的难题，在我国实属首创。本发明改变传统检测方法时间滞后、被动的窘境，有利于现场检测赤潮藻的鱼毒性。
文档编号G01N21/64GK102608085SQ201210005410
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月9日 优先权日2012年1月9日
发明者吴霓, 李支薇, 杜克梅, 桓清柳, 江天久 申请人:暨南大学
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