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专利名称：一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及动物源性食品中药物残留的检测方法及试剂盒，具体是一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫快速检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
卩比喹酮(praziquantel),化学名称为(apyrazinoisoquinoline derivative: (2- (cyclohexyl-carbonyl)-I, 2, 3, 6, 7, Ilbhexahydro-4H-pyrazino [2, l_a]
isoquinoline-4-one),是人工合成的杂环类驱虫药剂,可治疗血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫及绦虫等感染，吡喹酮在国内使用普遍，2002. 12. 24实施的农业部公告第235号附件“动物性食品中兽药最高残留限量”规定吡喹酮可用于马、山羊和非泌乳绵羊，我国至今尚未制定残留限量标准。而2006年已开始实施的“日本肯定列表”规定了 65种动物源性食品中吡喹酮的最低限量暂定标准，其中只有9种为0. 3 mg/Kg，其他均在0. 02-0. 05mg/Kg之间，欧盟规定牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉和其他动物可食用组织中的最高残留限量彡0. 02mg/Kg。吡喹酮的检测国外已经高效液相色谱方法等仪器方法进行检测，最低检测限达到IOppb,但是这些方法需要仪昂贵，检测时间长，耗材价格高，操作者技术要求高，有的方法废弃物处理困难，不太适合基层对大量样品的快速检验免疫学快速检测(ELISA)法检测吡喹酮目前国内外未见报道。

发明内容
本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，该检测试剂盒及检测方法不需要复杂昂贵的仪器设备，操作简便，动物源性食品前处理简单，检测快速，检测容量大，成本低廉等特点，适合大批量动物源性食品筛选的定性、定量检测的优点，并具有潜在的广泛的应用价值。本发明的技术原理
本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品中吡喹酮含量进行检测的原理是抗原抗体结合反应。即将吡喹酮标准品、待测动物源性食品的提取液及特异性抗血清进行抗原抗体结合反应后，加入到用包被抗原包被的酶标条中反特异性抗血清进行竞争性的结合，在吡喹酮优先的原则下，吡喹酮含量与特异性抗血清结合的份额就多，剩余的特异性抗血清与包被抗原结合的份额就少，呈梯度变化，吡喹酮与特异性抗血清的结合物在反应孔中呈游离状态，而包被抗原与酶标记特异性抗体结合物则附着在反应孔的壁上，前者随洗涤步骤而洗去，后者被底物显色，呈蓝色。包被抗原与特异性抗体结合的多少与半抗原的含量呈反比，半抗原含量越多，吸光度值(OD)越低，根据OD值的变化则可以在标准曲线上查找到相应的位置，从而计算出动物源性食品中吡喹酮准确的含量。本发明的技术方案一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，含有以下组分
(I)、吡喹酮标准溶液:250,125,31.3,20,7. 8,Ong/ml
由标准吡喹酮按不同比例定容于O. 01M/L磷酸盐-吐温20缓冲液溶液中即得到浓度分别为250、125、31. 3、20、7. 8、Ong/ml的吡喹酮标准溶液；
(2 )、辣根过物氧化酶标记羊抗兔抗体溶液(HRP-IgG)
市售，浓度1:100 ;使用前用稀释成1:5000 ；
(3)、吡喹酮抗血清1:100储存液备用，使用前用稀释成1:1500 ；
所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步骤
①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl (盐酸)中，油浴升温至120°C回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO3调节pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取该水相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物；
②、将4-氨基环己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O. 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，过无水NaSO4柱脱水，50°C真空浓缩至干得白色粉末；
③、取步骤①所得的产物O.5mg与步骤②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入0.76mg环已基碳二亚胺(DCC)，0.39mg4- (N，N-二甲基氨基)卩比啶(DMAP)，常温反应过夜，反应结束后生成白色固体，抽滤，所得的滤液用IOmllN HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用甲醇二氯甲烷为I :10的展开剂进行薄层板分离纯化；
④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物O.5mg，钯碳O. 2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气；加入15ml甲醇，常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以甲醇二氯甲烷为I : 10的展开剂进行薄层板分离纯化得到吡喹酮氨，最后经核磁氢谱鉴定后分装，低温保存备用；
⑤、免疫原和包被抗原的制备
称取O. Olmg牛血清蛋白(BSA)和O. Olmg卵清蛋白(OVA)分别溶于1ml，浓度为IOOmM,pH 7. O的磷酸盐缓冲溶液中，再分别加入O. Olmg 丁二酸酐，常温反应3h ；
上述常温反应3h后的产物分别用500ml*3，浓度为100mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，每4h更换缓冲液；
在上述透析后的产物中分别加入O. 004mg碳二亚胺盐酸盐(EDC)和O. 004mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再分别加入步骤④所得的吡喹酮胺O. 008mg, 4V反应3h ；
上述4°C反应3h后的产物分别用含8mg氯化钠的1000ml*3，浓度为10mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，再分别将透析好的产物分装，冷冻保存，所得的吡喹酮胺-BSA即免疫原和吡喹酮胺-OVA即包被抗原；
⑥、吡喹酮抗血清制备
选用临床健康，体重I. 5一2Kg的新西兰雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐剂加Iml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用Iml弗氏不完全佐剂加ImL步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，从第2次免疫后，每次免疫10天后耳缘静脉采血作即吡喹酮抗血清效价测定，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离出血清即得吡喹酮抗血清，加等量甘油冷冻于_20°C保存；
(4)、浓缩洗涤液0.2M/L磷酸盐-吐温20缓冲液，使用前用蒸馏水稀释20倍；
(5)、显色液市售TMB，即3，3，5，5四甲基联苯胺一H2O2溶液；
(6)、终止液2moI/LH2SO4 溶液；
(7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量48或96孔反应板，即包 被酶标条
将包被抗原即吡喹酮胺-OVA用O. 01mol/L pH为9. I的碳酸盐缓冲液稀释成工作浓度1:400,包被聚苯乙烯微量48或96孔反应板,置4°C过夜,清洗后甩干拍净置4°C备用；
(8)、空白聚苯乙烯微量48或96孔反应板,即酶标条。利用上述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物食品中吡喹酮的含量进行检测，还需要配备以下仪器与设备
(1)酶标检测仪
(2),10-20ul、100-200ul、IOOOul微量移液器
(3)、振荡器
(4)、离心机
(5)、分析天平
(6)、组织捣碎机。利用上述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物食品中吡喹酮的含量进行检测的方法，具体包括如下步骤
(I )、待测动物源性食品前处理
取50mg待测动物源性食品用组织捣碎机捣碎成肉泥，准确称取动物源性食品的肉泥2mg于IOmL离心管中，加入4ml乙醇搅拌，10000r/min离心，取上清液，再用4ml乙醇提取沉淀物，合并两次提取液吹干乙醇后，用标准溶液定容至2ml,沸水水浴lmin, 10000r/min离心，0. 45 μ m膜过滤后得待测动物源性食品提取液；
所述的标准溶液为试剂盒中的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后的所得的稀释液；本发明的实施例中仅以牛肉、猪肉、鸡肉和鱼肉中的吡喹酮的含量测定进行举例，但本发明的利用上述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物食品中吡喹酮的含量进行检测的方法的适用范围并不限于此，还可适用于其他类似的动物源性食品;
(2)、用试剂盒检测吡喹酮残留
①、准备
分析前将试剂盒中的所有试剂平衡至室温，分别按要求将所有试剂稀释至使用浓度，分析后立即将所有试剂放回4一8°C冰箱；
②、板外抑制
取一块空白聚苯乙烯微量48或96孔反应板，即酶标条将步骤(I)所得的待测食品提取液及试剂盒中浓度分别为250、125、31· 3,15. 6,7. 8,Ong/ml的吡喹酮标准溶液各60 μ I依次加入到聚苯乙烯微量反应板的反应孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振荡器振荡30s后置湿盒，即潮湿的盒子中37°C反应30min后得反应液；
③、竞争抑制在已包被的酶标条即已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反应板中每孔加入上述O. Img步骤②所得的反应液，37°C湿盒内反应I. 5h后，每孔再加O. 2mg步骤(I)所述的标准溶液清洗3次，每次间隔3min ；
④、二抗反应
步骤③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG O. lmg，置37°C反应Ih后拍干洗
净；
⑤、显色
步骤④拍干洗净后再于每孔中加入显色液O. lmg，于37°C反应IOmin ； ⑥、终止
步骤⑤反应结束后再于每孔中加入O. 05mg终止液，振荡30s后静置2min在450nm处，使用酶标测定仪，以空气为空白调零，测定吸光度，即吸收值；
⑦、检测结果分析计算
a、限量法
若试样孔，即加入待测动物源性食品提取液酶标孔的吸光度值小于20ng/ml的吡喹酮标准溶液的吸收值，超过限量值为阳性；
若试样孔的吸光度值大于20ng/ml的吡喹酮标准溶液的吸收值，小于限量值为阴性；
b、定量法
吡喹酮浓度标准曲线的绘制
以不同浓度的吡喹酮标准品的吸收值为纵坐标，以浓度(ng/ml)的对数值为横坐标，用半对数纸绘制标准曲线，根据待测动物源性食品提取液的吸收值，通过标准曲线查得对应的吡喹酮浓度，然后通过如下公式计算出待测动物源性食品中吡喹酮的含量；
待测动物源性食品中吡喹酮的含量即X (mg/Kg)，计算公式如下
V
.X:-
P M
c一根据吸收值从吡喹酮标准曲线上查找得到的待测动物源性食品提取液中吡喹酮浓度(ng/ml)；
V—待测动物源性食品提取液体积(ml)；
N—待测动物源性食品浓缩的倍数；
M—待测动物源性食品质量(g)。上述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒的使用注意事项
测定后零标准孔的吸收值最高，当其吸收值低于O. 6时，试剂盒失效；
在重复条件下，获得的两次独立测试结果相对差值不大于15% ；
不同批号的试剂盒不能混用；
保质期3个月(4-8°C);
回收率:80-120% ；
线性范围7. 8-250ng/ml。本发明的有益效果
本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，通过改进国外相关技术，在吡喹酮分子结构中成功引入氨基合成了吡喹酮胺，再以丁二酸酐作桥用碳二亚胺盐酸盐法与BSA或OVA偶联成免疫原或包被抗原，以此免疫原免疫实验兔获得了高效价特异性抗体，并通过筛选出猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉中吡喹酮的简便样品前处理方法，基本消除待测基质的影响，有利于基层单位的使用。进一步的，本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒的检测线性范围为250ng — 7.8ng/g(ml)，检测底线为7. 8ng/ml，线性相关系数大于O. 99与结构类似化合物喹稀酮、吡蚜酮无交叉反应，与液相色谱-质谱测定方法(SN/T1979-2007)进行比较，其检测方法可靠。进一步的，本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒操作简便，且一次测定周期仅为4h，且又由于使用了 48或96孔聚苯乙烯微量反应板，因此2-3h即可完成20-30份样品的测定，大大提高检测效率。另外，本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒由于在30°C稳定放置7天，4°C放置3个月后，仍良好，因此有利于试剂盒的运输、携带和、贮存。


图1，实施例2中不同浓度的吡喹酮标准品的吸收值及对应浓度的半对数标准曲线，曲线中吡喹酮标准品的吸收值为纵坐标，浓度(ng/ml)的对数值为横坐标。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。本发明的实施例中利用一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品中吡喹酮含量进行检测，配备的仪器与设备的型号及生产厂家等信息如下，请给出
(1)酶标检测仪，DG3022国营华东电子管厂；
(2)、10—20111、100-200111、1000111微量移液器 FINNPIPEFFE 芬兰；
(3)、振荡器，MH-5海门其林贝尔仪器制造有限公司；
(4)、离心机，H-2050K长沙湘仪离心机仪器制造有限公司；
(5)、分析天平，AL204梅特勒、BL-2200H日本岛津；
(6)薄层板分离纯化所用的设备，复华紫外分析器。实施例I
一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，含有以下组分
(I)、吡喹酮标准溶液:250,125,31.3,15. 6,7. 8,Ong/ml
由标准吡喹酮按不同比例定容于O. 01M/L磷酸盐-吐温20缓冲液溶液中即得到浓度分别为250、125、31. 3、15. 6、7. 8、Ong/ml的吡喹酮标准溶液；
(2 )、辣根过物氧化酶标记羊抗兔抗体溶液(HRP-IgG)
市售，浓度1:100 ；
(3)、吡喹酮抗血清
所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步骤
①、IOmg吡喹酮加入O. 15ml IN HCl (盐酸)中，油浴升温至120°C回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO3调节pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取该水相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物；
②、将4-氨基环己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O. 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 501111、501111、501111洗3次，过无水似304柱脱水，501真空浓缩至干得白色粉末；
③、取步骤①所得的产物O.5mg与步骤②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入0.7611^环已基碳二亚胺(00)，0.3911^4- (N，N-二甲基氨基)卩比啶(DMAP)，常温反应过夜,反应结束后生成白色固体,抽滤；
所得的滤液用IOmllN HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用以薄层板分离纯化(展开剂甲醇二氯甲烷为I : 10)，产率60%;
④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物O.5mg，钯碳O. 2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气；加入15ml甲醇，常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以薄层板分离纯化得到吡喹酮氨(展开剂为甲醇二氯甲烷为I :10)，产率65%，最后经核磁氢谱鉴定后分装，低温保存备用；
⑤、免疫原和包被抗原的制备
称取O. Olmg牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)分别溶于1ml，浓度为IOOmM,pH 7. O的磷酸盐缓冲溶液中，再分别加入O. Olmg 丁二酸酐，常温反应3h ；
上述常温反应3h后的产物分别用500ml*3，浓度为100mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透
析；
在上述透析后的产物中分别加入O. 004mg碳二亚胺盐酸盐(DCE)和O. 004mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，再分别加入步骤④所得的吡喹酮胺O. 008mg，4°C反应3h ；
上述4°C反应3h后的产物分别用含8mg氯化钠的1000ml*3，浓度为10mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，将透析好的产物分别分装，冷冻保存，所得的吡喹酮胺-BSA即免疫原，所得的吡喹酮胺-OVA即包被抗原；
⑥、吡喹酮抗血清制备
选用临床健康，体重I. 5一2Kg的新西兰雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐剂加Iml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用Iml弗氏不完全佐剂加ImL步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，从第2次免疫后，每次免疫10天后耳缘静脉采血作即吡喹酮抗血清效价测定，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离即得吡喹酮抗血清，加甘油冷冻于-20°C保存；
(4)、浓缩洗涤液0.2M/L磷酸盐-吐温20缓冲液，使用前用蒸馏水稀释20倍；
(5)、显色液市售3，3，5，5四甲基联苯胺一H2O2(TMB)溶液；
(6)、终止液2mol/LH2SO4 溶液；
(7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量48或96孔反应板，即已包被的酶标条
将吡喹酮包被抗原(吡喹酮胺-0VA)用稀释后的浓缩洗涤液稀释成工作浓度I :400，包被聚苯乙烯微量48或96孔反应板，置4°C过夜，清洗后甩干拍净置4°C备用；(8)、空白聚苯乙烯微量48或96孔反应板,即酶标条。 实施例2
利用实施例I所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品牛肉、猪肉、鸡肉及鱼肉中吡喹酮的含量进行检测的方法，具体包括如下步骤
(1)、待测动物源性食品牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉前处理
分别取50mg牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品用组织捣碎机捣碎成肉泥，分别准确称取肉泥2mg于IOmL离心管中，分别加入4ml乙醇搅拌，10000r/min离心，取上清液，再分别用4ml乙醇提取沉淀物，分别合并两次提取液吹干乙醇后，分别用稀释后的浓缩洗涤液定容至2ml，沸水水浴Imin分钟，10000r/min离心，O. 45 μ m膜过滤后分别得牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品提取液；
标准溶液为PBST空白稀释液；
(2)、检测吡喹酮含量
①、准备
分析前将动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒中的平衡至室温，分别按要求将所有试剂稀释至使用浓度，分析后立即将所有试剂放回4 8°C冰箱；
②、板外抑制
取一块空白48或96孔聚苯乙烯微量反应板将步骤(I)所得的牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉食品提取液及试剂盒中浓度分别为 250ng/ml、125ng/ml、31. 3ng/ml、15. 6ng/ml、7. 8ng/ml、Ong/ml的卩比喹酮标准溶液各60 μ I依次加入到聚苯乙烯微量48或96反应板的反应孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振荡器振荡30s后置湿盒中37°C反应30min后得反应液；
③、竞争抑制
在已包被的酶标条，即在已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反应板中每孔加入0. Img步骤②所得的反应液,37°C湿盒内反应I. 5h后，每孔再加0. 2mg标准溶液即PBST空白稀释液清洗3次，每次间隔3min ；
④、二抗反应
步骤③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG 0. lmg，置37°C反应Ih后拍干洗
净；
⑤、显色
步骤④拍干洗净后再于每孔中加入显色液0. Img,于37°C湿盒反应IOmin ；
⑥、终止
步骤⑤湿盒反应结束后再于每孔中加入0. 05mg终止液，振汤30s后静直2min在450nm处，使用酶标测定仪，以空气为空白调零，测定吸光度，即吸收值；
以浓度分别为 250ng/ml、125ng/ml、31. 3ng/ml、15. 6ng/ml、7. 8ng/ml>Ong/ml 的卩比喹酮标准品的吸收值为纵坐标，浓度(ng/ml)的对数值为横坐标，用半对数值绘制标准曲线，所得的曲线如图I所示，从图I中可以得出，曲线在7. 8— 250 μ g/L范围内成线性；
根据测得的牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品提取液吸光度，通过图I所得的标准曲线查得对应的牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品提取液中吡喹酮浓度，然后通过如下公式计算出牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品中吡喹酮的含量；牛肉、猪肉、鸡肉、鱼肉待测食品提取液样品中吡喹酮的含量即X (mg/Kg)，计算公式如
下
权利要求
1.一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下组分 (1)、吡喹酮标准溶液 (2)、辣根过物氧化酶标记羊抗兔抗体溶液； (3)、吡喹酮抗血清； (4)、浓缩洗涤液； (5)、显色液； (6)、终止液； (7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反应板； (8)、空白聚苯乙烯微量反应板。
2.如权利要求I所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步骤 ①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl中，油浴升温至120°C回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO3调节pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取该水相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物； ②、将4-氨基环己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O. 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，过无水NaSO4柱脱水，50°C真空浓缩至干得白色粉末； ③、取步骤①所得的产物O.5mg与步骤②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入O. 76mg环已基碳二亚胺,0. 39mg4- (N, N-二甲基氨基)卩比唳，常温反应过夜,反应结束后生成白色固体，抽滤，所得的滤液用IOmllN HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用甲醇二氯甲烷为I :10的展开剂进行薄层板分离纯化； ④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物O.5mg，钯碳O. 2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气；加入15ml甲醇，常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以甲醇二氯甲烷为I : 10的展开剂进行薄层板分离纯化得到吡喹酮氨； ⑤、免疫原的制备 称取O. Olmg BSA溶于1ml，浓度为100mM，pH 7. O的磷酸盐缓冲溶液中，再加入O. Olmg丁二酸酐，常温反应3h; 上述常温反应3h后的产物分别用500ml*3，浓度为100mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，每4h更换缓冲液； 在上述透析后的产物中加入O. 004mg碳二亚胺盐酸盐和O. 004mgN-羟基琥珀酰亚胺，再加入步骤④所得的吡喹酮胺O. 008mg，4°C反应3h ； 上述4°C反应3h后的产物用含8mg氯化钠的1000ml*3，浓度为10mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，透析好的产物即为免疫原即吡喹酮胺-BSA ； ⑥、吡喹酮抗血清制备 选用临床健康，体重I. 5一2Kg的新西兰雄性兔4只,第一次免疫用ImL弗氏完全佐剂加Iml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用Iml弗氏不完全佐剂加ImL步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离出血清即得吡喹酮抗血清。
3.如权利要求2所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的吡喹酮标准溶液的浓度分别为250，125，31. 3,20,7. 8，0ng/ml。
4.如权利要求3所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒， 其特征在于所述的浓缩洗涤液为O. 2M/L磷酸盐-吐温20缓冲液。
5.如权利要求4所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的显色液为3，3，5，5四甲基联苯胺一H2O2溶液。
6.如权利要求5所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的终止液为2mol/LH2S04溶液。
7.如权利要求6所述的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒， 其特征在于所述的已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反应板的 制备方法如下 将包被抗原即吡喹酮胺-OVA用O. 01mol/L pH为9. I的碳酸盐缓冲液稀释成工作浓度1:400，包被聚苯乙烯微量48或96孔反应板，置4°C过夜，清洗后甩干拍净即得已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反应板； 其中所述的包被抗原即吡喹酮胺-OVA的制备方法包括如下步骤 ①、IOmg吡喹酮加入O.15ml IN HCl中，油浴升温至120°C回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO3调节pH至9. O，二氯甲烷40ml*3萃取该水相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物； ②、将4-氨基环己烷羧酸10mg，和NaC0312mg，溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100 mil N HCl中，先以O. 15ml乙醚提取I次，再用100ml、IOOml乙醚提取2次，合并提取物以INHCl 50ml、50ml、50ml洗3次，过无水NaSO4柱脱水，50°C真空浓缩至干得白色粉末； ③、取步骤①所得的产物O.5mg与步骤②所得的白色粉末O. 72mg用30ml 二氯甲烷溶解，再加入O. 76mg环已基碳二亚胺,0. 39mg4- (N, N-二甲基氨基)卩比唳，常温反应过夜,反应结束后生成白色固体，抽滤，所得的滤液用IOmllN HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用甲醇二氯甲烷为I :10的展开剂进行薄层板分离纯化； ④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物O.5mg，钯碳O. 2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气；加入15ml甲醇，常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以甲醇二氯甲烷为I : 10的展开剂进行薄层板分离纯化得到吡喹酮氨； ⑤、包被抗原的制备 称取O. OlmgOVA溶于1ml，浓度为lOOmM，pH 7. O的磷酸盐缓冲溶液中，再加入0. Olmg丁二酸酐，常温反应3h; 上述常温反应3h后的产物用500ml*3，浓度为lOOmM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，每4h更换缓冲液； 在上述透析后的产物中加入0. 004mg碳二亚胺盐酸盐和0. 004mgN-羟基琥珀酰亚胺，再加入步骤④所得的吡喹酮胺0. 008mg，4°C反应3h ；上述4°C反应3h后的产物用含8mg氯化钠的1000ml*3，浓度为10mM，pH7. O的磷酸盐缓冲溶液透析3天，透析好的产物即为包被抗原即吡喹酮胺-OVA。
8.利用一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品中吡喹酮的含量进行检测的方法，其特征在于具体包括如下步骤 (I )、待测动物源性食品前处理 取50mg待测动物源性食品用组织捣碎机捣碎成肉泥，准确称取动物源性食品的肉泥2mg于IOmL离心管中，加入4ml乙醇搅拌，10000r/min离心，取上清液，再用4ml乙醇提取沉淀物，合并两次提取液吹干乙醇后，用标准溶液定容至2ml,沸水水浴lmin, 10000r/min离心，O. 45 μ m膜过滤后得待测动物源性食品提取液； 所述的标准溶液为试剂盒中的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后的所得的稀释液； (2)、用试剂盒检测吡喹酮残留①、准备 分析前将试剂盒中的所有试剂平衡至室温，分别按要求将所有试剂稀释至使用浓度，分析后立即将所有试剂放回4一8°C冰箱； ②、板外抑制 取一块空白聚苯乙烯微量48或96孔反应板，即酶标条将步骤(I)所得的待测动物源性食品提取液及试剂盒中浓度分别为250、125、31. 3、15. 6,7. 8、0ng/ml的吡喹酮标准溶液各60μ I依次加入到聚苯乙烯微量反应板的反应孔中，再于各孔中加入等量的吡喹酮抗血清，用振汤器振汤30s后直37 C湿盒中反应30min后得反应液； ③、竞争抑制 在已包被的酶标条即已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的48或96孔聚苯乙烯微量反应板中每孔加入上述O. Img步骤②所得的反应液，37°C湿盒内反应I. 5h后，每孔再加O.2mg步骤(I)所述的标准溶液清洗3次，每次间隔3min ； ④、二抗反应 步骤③清洗完后再于每孔中加入I :5000的HRP-IgG 0. lmg，置37°C反应Ih后拍干洗净； ⑤、显色 步骤④拍干洗净后再于每孔中加入显色液0. lmg，于37°C反应IOmin ； ⑥、终止 步骤⑤反应结束后再于每孔中加入0. 05mg终止液，振荡30s后静置2min在450nm处，使用酶标测定仪，以空气为空白调零，测定吸光度，即吸收值； ⑦、检测结果分析计算，最终得到动物源性食品中吡喹酮的含量。
9.如权利要求8所述的利用一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒对动物源性食品中吡喹酮的含量进行检测的方法，其特征在于所述的动物源性食品为牛肉、猪肉、鸡肉或鱼肉。
全文摘要
本发明公开一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂及其检测方法。即将已知系列浓度吡喹酮标准品和吡喹酮抗血清进行抗原抗体反应，得出吸光度值，制作成标准曲线，同时将待测动物源性食品的提取液及吡喹酮抗血清进行抗原抗体结合反应后，根据吸光度值在吡喹酮标准曲线上查找到相应的位置，从而计算出动物源性食品中吡喹酮准确的含量。本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒检测线性范围为250ng-7.8ng/g(ml),与结构类似化合物喹稀酮、吡蚜酮无交叉反应，检测方法可靠、操作简便、检测效率高，稳定性能好，有利于基层单位的使用。
文档编号G01N33/545GK102854309SQ20121030459
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月24日 优先权日2012年8月24日
发明者李平, 肖震, 周成林, 周洪斌, 吴小华 申请人:镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心