专利名称：一种正品大黄种子的检测方法
技术领域：
本发明涉及正品大黄种子的检测方法，属于中药领域。
背景技术：
大黄为寥科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim, ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根莖。具有湾热通肠，凉血解毒，逐瘀通经的功效。用于实热便秘，积滞腹痛，泻痢不爽，湿热黄疸，血热吐衄，目赤，咽肿，肠痈腹痛，痈肿疔疮，瘀血经闭，跌打损伤，上消化道出血；外治水火烫伤。掌叶大 黄分布于甘肃东南部、青海、四川西部、云南西北部及西藏东部；唐古特大黄分布于甘肃、青海、四川及西藏东北部；药用大黄分布于陕西南部、河南西部、湖北西部、四川、云南等地。华北大黄、河套大黄是常见的伪品大黄，易与唐古特大黄等正品大黄混淆。
近年来，由于对野生大黄资源的无计划采挖，导致野生大黄资源逐年減少，全国野生大黄资源已濒临枯竭。为满足市场对优质大黄日益增长的需求量，大黄人工种植规模不断扩大，而品质纯正的种子是药材栽培的前提，是提高药材产量和质量的根本保障。目前，我国大黄种子没有检验标准和质量标准，主要是通过形状、大小、顔色、表皮、饰纹等性状进行鉴别，具有一定的局限性。申请号201110337787. 7，发明名称ー种鉴定真伪大黄种子的方法的专利申请公开了ー种鉴别真伪大黄种子的方法，它包括如下步骤(I)取待检种子，提取待检种子中的大黄酚和大黄素；(2)測定大黄种子中大黄酚和大黄素的含量；(3)计算大黄酚含量/大黄素含量的比值；(4)根据步骤(3)计算的比值判断若比值大于1，判断该种子为正品大黄种子，若比值小于或者等于1，判断该种子为伪品大黄种子。该方法通过种子中大黄酚和大黄素含量的比值来确定大黄种子是否为正品，因精确测定某成分含量较难，误差较大，导致该方法使用不方便，准确度不够高。尤其针对在正品大黄种子中掺杂部分伪品的情况，容易得出错误的结论，难以替代传统检测方法。需寻找ー种更为简便、准确、可靠的方法鉴定正品、伪品，以及正伪混合的大黄种子的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种正品大黄种子的检测方法。本发明正品大黄种子的检测方法，，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤( I)取待检种子，粉碎，用甲醇提�。耍寐艘海ゼ状迹崴猓糜谢芗凛腿。糜谢芗敛悖厥杖芗林粮桑偃芙猓瞥晒┦云啡芤海�(2)取芦荟大黄素对照品，溶解，制备对照品溶液；(3)用高效液相色谱法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，鉴定待检种子中含有正品大黄种子，色谱条件如下固定相十八烷基硅烷键合硅胶；流动相甲醇-0. 1%磷酸溶液，二者的体积比为(8(T90)(10 20);检测波长254nm。其中，步骤(I)所述待检种子为掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheumtanguticum，Maxim, ex Balf、华北大黄 Rheum franzenbachiiMunt.或者河套大黄 Rhumhotaoense C. Y. Cheng et C. T. Kao 的种子。其中，步骤(I)所述酸水解时，溶液中氢离子的浓度为2 3mol/L ;所述有机溶剂为三氯甲烷。优选地，所述步骤(I)中，将待检种子粉碎，过四号筛，得粉末，加甲醇，粉末与甲醇的质量体积比为I :15(Tl85，加热回流3(T90min，冷却，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，得续滤液，挥去溶剂，加浓度为6 10%的盐酸，超声处理f3min，加等体积的三氯甲烷，加热回流6(T80min，再用三氯甲烷萃取3次，毎次所用三氯甲烷体积同盐酸体积，得 三氯甲烷层，回收溶剂至干，加甲醇制成供试品溶液。其中，所述步骤(3)中，甲醇与0. 1%磷酸溶液的体积比为85 :15。它还包括定性检测方法，步骤如下I)取待检种子，粉碎，用甲醇提取，过滤，得滤液，挥去溶剤，酸溶液水解，用有机溶剂萃�。盟悖�2)取步骤I)所得水层，加广3倍体积的浓氨水，震�。藓熳厣磷睾稚踝闯恋恚�3)鉴定待检种子为正品大黄种子。其中，步骤I)所述酸水解，溶液中氢离子的浓度为0. 52^2mol/L ;有机溶剂为こ醚。优选地，所述步骤I)中，将待检种子粉碎成细粉，加甲醇，细粉与甲醇的质量体积比为1:15^25,浸泡30mirT90min，过滤，得滤液，蒸干，加水，再加浓盐酸，盐酸体积为水体积的l/2(Tl/5，加热回流2(T40min，冷却，用こ醚萃�。腿�2次，毎次所用こ醚体积为水体积的:T5倍，得水层。本发明正品大黄种子的检测方法可以准确检测待检种子中是否含有正品大黄种子，用本发明优选的检测方法，可以进ー步确定待检种子是否还混有伪品种子，将正伪种子混合品从正品中排除，准确度高，且检测方法简单、快速，可以替代传统检测方法，具有良好的应用前景。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图I高效液相色谱法游离蒽醌对照品图谱，其中，I为芦荟大黄素、2为大黄酸、3为大黄素、4为大黄酚、5为大黄素甲醚；图2高效液相色谱法DHlO图谱,其中，3为大黄素,4为大黄酚、5为大黄素甲醚；图3高效液相色谱法DHl3图谱，其中，I为芦荟大黄素、3为大黄素、4为大黄酚、5为大黄素甲醚。图4高效液相色谱法DHl5图谱，其中，I为芦荟大黄素、3为大黄素、4为大黄酚、5为大黄素甲醚。图5高效液相色谱法DH26图谱,其中，3为大黄素、4为大黄酚、5为大黄素甲醚。图6沉淀检测结果，其中，左边为DH10、DH26，右边为DHl3、DHl5。
具体实施方式
实施例I本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)取待检种子粉末(过四号筛)0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇22. 5ml，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加6%盐酸溶液5ml，超声处理I分钟，再加三氯甲烷5ml，加热回流30min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次5ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取芦荟大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。高效液相色谱法的检测以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(80 10)为流动相；检测波长为254nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定即可。(3)若步骤(2)中，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，说明待检种子中含有正品大黄种子。实施例2本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)取待检种子粉末(过四号筛)0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流I小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液IOml (8%盐酸溶液中氢离子的浓度为2. 5mol/L)，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10ml，加热回流I小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取芦荟大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作为对照品溶液。高效液相色谱法的检测以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(85 15)为流动相；检测波长为254nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定即可。(3)若步骤(2)中，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，说明待检种子中含有正品大黄种子。
实施例3本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)取待检种子粉末(过四号筛)0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇
27.75ml，称定重量，加热回流90min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加10%盐酸溶液15ml，超声处理3分钟，再加三氯甲烷15ml，加热回流90min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，毎次15ml，合并三氯甲烷液，减压 回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至IOml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取芦荟大黄素对照品，加甲醇制成每Iml含16y g的溶液，作为对照品溶液。高效液相色谱法的检测以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相；以甲醇-0. I %磷酸溶液(90 20)为流动相；检测波长为254nm。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 yl，注入液相色谱仪，測定即可。(3)若步骤(2)中，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，说明待检种子中含有正品大黄种子。实施例4本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)按照实施例I的检测方法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间是否一致；(3)取待检种子细粉I. Og,加甲醇15ml,浸泡30min,滤过,取滤液5ml,蒸干,残洛加水IOml使溶解，再加浓盐酸0. 5ml (所得稀盐酸溶液中氢离子的浓度为0. 52mol/L),加热回流20分钟，立即冷却，用こ醚分2次提�。瑲按�15ml，得水层；取水层，加I倍体积的浓氨水，震�。鄄煊形藓熳厣磷睾稚踝闯恋恚�(4)若步骤(2)中，供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，并且。步骤(3)中，水层无红棕色至棕褐色絮状沉淀，将待检种子鉴定为正品大黄种子。实施例5本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)按照实施例2的检测方法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间是否一致；(3)取待检种子细粉I. 0g，加甲醇20ml，浸泡I小时，滤过，取滤液5ml，蒸干，残渣加水IOml使溶解，再加浓盐酸Iml (所得稀盐酸溶液中氢离子的浓度为I. 09mol/L)，加热回流30分钟，立即冷却，用こ醚分2次提�。瑲按�20ml，得水层；取水层，加2倍体积的浓氨水，震�。鄄煊形藓熳厣磷睾稚踝闯恋恚�(4)若步骤(2)中，供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，并且。步骤(3)中，水层无红棕色至棕褐色絮状沉淀，将待检种子鉴定为正品大黄种子。实施例6本发明检测方法I、检测方法(I)取待检种子；(2)按照实施例3的检测方法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间是否一致 ；(3)取待检种子细粉I. Og,加甲醇25ml,浸泡90min,滤过,取滤液5ml,蒸干,残洛加水IOml使溶解，再加浓盐酸I. 5ml (所得稀盐酸溶液中氢离子的浓度为I. 09mol/L)，カロ热回流40分钟，立即冷却，用こ醚分2次提取，毎次25ml，得水层；取水层，加3倍体积的浓氨水，震�。鄄煊形藓熳厣磷睾稚踝闯恋恚�(4)若步骤(2)中，供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，并且。步骤(3)中，水层无红棕色至棕褐色絮状沉淀，将待检种子鉴定为正品大黄种子。实验例I用本发明检测方法检测待检种子I、实验材料
权利要求
1.一种正品大黄种子的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤 (1)取待检种子，粉碎，用甲醇提�。耍寐艘海ゼ状迹崴猓糜谢芗凛腿。糜谢芗敛悖厥杖芗林粮桑偃芙猓瞥晒┦云啡芤海� (2)取芦荟大黄素对照品，溶解，制备对照品溶液； (3 )用高效液相色谱法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，鉴定待检种子中含有正品大黄种子，色谱条件如下固定相十八烷基硅烷键合硅胶；流动相甲醇-O. 1%磷酸溶液，二者的体积比为(8(Γ90) :(1(Γ20);检测波长254nm。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述酸水解，溶液中氢离子的浓度为2 3mol/L ;所述有机溶剂为三氯甲烷。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中，将待检种子粉碎，过四号筛，得粉末，加甲醇，粉末与甲醇的质量体积比为I :15(Tl85，加热回流3(T90min，冷却，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，得续滤液，挥去溶剂，加浓度为6 10%的盐酸，超声处理f 3min，加等体积的三氯甲烷，加热回流6(T80min，再用三氯甲烷萃取3次，每次所用三氯甲烷体积同盐酸体积，得三氯甲烷层，回收溶剂至干，加甲醇制成供试品溶液。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，甲醇与O.1%磷酸溶液的体积比为85 :15。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于它还包括定性检测方法，步骤如下 1)取待检种子，粉碎，用甲醇提取，过滤，得滤液，挥去溶剂，酸溶液水解，用有机溶剂萃�。盟悖� 2)取步骤I)所得水层，加f3倍体积的浓氨水，震�。藓熳厣磷睾稚踝闯恋恚� 3)鉴定待检种子为正品大黄种子。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于步骤I)所述酸水解，溶液中氢离子的浓度为O. 52^2mol/L ;有机溶剂为乙醚。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤I)中，将待检种子粉碎成细粉，加甲醇，细粉与甲醇的质量体积比为1:15^25,浸泡30mirT90min，过滤，得滤液，蒸干，加水，再加浓盐酸，盐酸体积为水体积的l/2(Tl/5，加热回流2(T40min，冷却，用乙醚萃�。腿�2次，每次所用乙醚体积为水体积的3飞倍，得水层。
全文摘要
本发明公开了一种正品大黄种子的检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，包括如下步骤(1)取待检种子，粉碎，用甲醇提�。耍寐艘海ゼ状迹崴猓糜谢芗凛腿。糜谢芗敛悖厥杖芗林粮桑偃芙猓瞥晒┦云啡芤海�(2)取芦荟大黄素对照品，溶解，制备对照品溶液；(3)用高效液相色谱法检测，在供试品溶液的色谱图中，有色谱峰与芦荟大黄素对照品色谱峰保留时间一致，鉴定待检种子中含有正品大黄种子，色谱条件如下固定相十八烷基硅烷键合硅胶；流动相甲醇-0.1％磷酸溶液，二者的体积比为(80~90)(10~20)；检测波长254nm。本发明正品大黄种子的检测方法准确度高，操作方便，成本低廉，市场应用前景良好。
文档编号G01N30/02GK102854268SQ20121037634
公开日2013年1月2日 申请日期2012年10月8日 优先权日2012年10月8日
发明者李敏, 敬勇, 林秋霞 申请人:成都中医药大学
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