专利名称：一种灵芝水提物的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种药品或保健品质量分析方法，具体涉及一种灵芝水提物的质量控制方法。
背景技术：
灵芝为多孔菌科真菌赤芝fefloofe/ma lucidum (Leyss. ex Fr. ) Karst.或紫芝Ganoderma sinense Zhao, Xu et Zhang 或松杉灵芝 fefloofe/ma tsugae Murr.的干燥子实体，具有补气安神、止咳平喘等功效。灵芝提取工艺主要有水提与醇提，而多数采用水提工艺，即米用多孔菌科真菌赤芝(fefloofe/ma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst.)、紫芝{Ganoderma sinnese Zhao, Xu et Zhang)及松杉灵芝(fefloofe/ma tsugae Murr·)的干 燥子实体经水提取、浓缩、干燥后制得。故本发明采用灵芝水提物命名。研究表明，灵芝中主要含有多糖、三萜、核苷、生物碱、黄酮、氨基酸及微量元素等多种化学成分。目前，对灵芝药理活性研究主要集中在灵芝多糖和灵芝三萜类成分，因此，灵芝多糖和三萜类成分作为灵芝的最主要功效成分，很有必要对其含量进行测定。本发明在一系列实验过程中对保健食品原料灵芝水提物标志性成分的测定方法进行了研究。灵芝多糖是灵芝中的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等多种药理活性。目前，某些企业为了达到干燥甚至虚报灵芝多糖含量的目的，常在灵芝水提物中加入糊精、淀粉等各种辅料。若按2010年版中国药典的方法测定，将造成灵芝多糖测定结果偏高。本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用铜试剂沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。灵芝三萜类化合物是灵芝的另一主要药效成分，由于具有抗癌，抗炎，抗氧化等药理活性而备受关注。本发明人在采用高效液相色谱法对灵芝水提物三萜类成分进行研究中发现，灵芝水提物中含有含量相对较高的灵芝酸A、B、C2。对比目前常用的比色法测定总三萜含量的方法，特异性强，可达到鉴别和质量控制的目的。
发明内容
为了有针对性地控制产品质量，本发明采用粗多糖含量和灵芝酸八3、(2含量之和作为灵芝水提物的质量控制指标，提供了一种灵芝水提物的质量控制方法。本发明采取的技术方案如下
以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作为灵芝水提物的质量控制指标。所述灵芝酸A、B含量的检测方法如下
(I)对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品，加入甲醇制成每Iml含164 μ g灵芝酸A和含52 μ g灵芝酸B的混标溶液。
( 2 )供试品溶液的制备
取灵芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。(3)高效液相色谱检测 以辛烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，O. I %醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm;柱温为22 °C ;流速为I. O ml/min ;理论板数按灵芝酸A计算，应不低于5000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。所述灵芝酸C2含量的检测方法如下
(I)对照品溶液的制备
取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品，加甲醇制成每I ml含33 μ g灵芝酸C2的对照品溶液。(2)供试品溶液的制备
取灵芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇适量超声处理10 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过。(3)高效液相色谱检测
以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，O. I %醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm ;柱温为20°C ;流速为I. O ml/min ;理论板数按灵芝酸C2计算，应不低于5000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。所述粗多糖含量的检测方法如下
(I)标准曲线绘制
取干燥至恒重的葡聚糖对照品适量，精密称量，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液。分别精密吸取上述标准溶液O. 1,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8、I. O ml至10. O ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. O ml，混匀，精密加入浓硫酸10. O ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。(2)供试品溶液的制备
取灵芝水提物O. 4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25. O ml，超声10 min，滤过；吸取滤液
5.0ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 °C放置12 h，取出，3000 r/min离心8 min,弃去上清液,沉淀加水溶解并转移至10. O ml容量瓶中，加水定容，摇匀；吸取上述定容后的溶液2. O ml,置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0ml、铜试剂2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷却至室温，3000 r/min离心8 min,弃去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2. O ml溶解并转移至10. O ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得。(3)样品测定
吸取供试品溶液2. O ml，照标准曲线绘制项下，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml”起，依法测定吸光度，利用标准曲线计算得到葡聚糖的含量。
标志性成分指标为测定的粗多糖含量> 30. 7mg/g,以葡聚糖计；灵芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品计，赤芝、松杉灵芝水提物彡13. 3mg/g，紫芝水提物彡I. 8mg/g。本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用铜试剂沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。赤芝、紫芝及松杉灵芝均含有相对含量较高的特征成分灵芝酸A、B、C2。对比目前常用的比色法测定总三萜含量的方法，特异性强，可达到鉴别和质量控制的目的。
图I为灵芝酸A、B混标溶液色谱图，峰I :灵芝酸B,峰2 :灵芝酸A。
图2为供试品溶液色谱图，峰I :灵芝酸B，峰2 :灵芝酸A。图3为灵芝酸C2对照品溶液色谱图，峰3 :灵芝酸C2。图4为供试品溶液色谱图，峰3 :灵芝酸C2。
具体实施例方式以下实施例中的本品指的是灵芝水提物的供试样品。实施例I粗多糖含量的测定 Al. I原理
试样中相对分子质量大于I X IO4的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应生成橙红色化合物，通过比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算本产品中粗多糖的含量。Al. 2 试剂
Al. 2. I试剂与材料 Al. 2. I. I乙醇分析纯。Al. 2. I. 2浓硫酸分析纯。Al. 2. I. 3氢氧化钠溶液(100 g/L):称取25 g氢氧化钠，加水溶解并稀释至250ml ο加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。Al. 2. I. 4铜试剂储备液称取O. 75 g CuSO4 ·5Η20，7. 5g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至250 ml,混勻备用。Al. 2. I. 5铜试剂溶液取铜试剂储备液50 ml，加水50 ml，混匀后加入固体无水硫酸钠12. 5 g并使其溶解。临时配用。Al. 2. 1.6苯酚(50 g/L):称取苯酚5. O g，加水稀释至100 ml，混匀，其溶液置于
冰箱中可保存一个月。Al. 2. I. 7葡聚糖标准储备液取分子量500000、干燥至恒重的葡聚糖对照品适量，精密称量，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液。Al. 3 仪器
Al. 3. I紫外分光光度计。Al. 3. 2超声波清洗器。
Al. 3· 3 离心机(3000 r/min)。Al. 4分析步骤
Al. 4. I标准曲线的制备
分别精密吸取葡聚糖标准储备液O. 1、0. 2、0.4、0. 6、0.8、1.0 ml至10. O ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. Oml，混匀，精密加入浓硫酸10. O ml，混匀，置水浴中煮沸2 min,混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。Al. 4. 2样品溶液的制备
精密称取本品O. 4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25. O ml，超声10 min，滤过。吸取滤液
5.0ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 °C放置12 h，取出，以3000 r/min离心8 min，弃去上清液，沉淀加水溶解并转移至10. O ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。吸取上述溶液2.0 ml，置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液
2.0ml、铜试剂2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷却至室温，以3000 r/min离心8 min,弃去上清液。沉淀用10 %硫酸溶液2.0 ml溶解并转移至10. O ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。同时按上述步骤做样品空白。Al. 4. 3样品测定
吸取样品溶液2.0 ml置25 ml比色管中，照标准曲线制备项下，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml ”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出葡聚糖的重量，计算，即得。Al. 4. 4结果计算
r (Wa-ITO)X Vix Vsx Vs ~TOxV2xV4x￥e~
X—样品中粗多糖的含量(以葡聚糖计)，mg/g
In1一样品测定液中葡聚糖的质量，mg
m2—样品空白液中葡聚糖质量，mg
m3—样品质量，g
V1 一样品提取液总体积，ml
V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积，ml
V3—粗多糖溶液体积，ml
V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积，ml
V5—样品测定液总体积，ml
V6—测定用样品溶液体积，ml
Al. 4. 5允许差
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。实施例2灵芝酸A、B、C2鉴别及总量的测定 A2. I原理
试样以甲醇作为溶剂，超声提�。橹ニ酇、灵芝酸B经高效液相色谱柱(C8)分离；灵芝酸C2经高效液相色谱柱(C18)分离，分别用紫外检测器(UV)检测，根据色谱峰的保留时间定性，峰面积外标法定量，分别测定试样中灵芝酸A、B和灵芝酸C2的含量，并计算其总量。A2. 2 试剂
A2. 2. I 水纯化水。A2.2.2 乙腈色谱纯。A2.2.3冰乙酸分析纯。A2.2.4甲醇分析纯。A2. 2. 5灵芝酸A、B、C2对照品纯度彡98 %，由中国医学科学院药物研究所提供。A2. 3 仪器
A2. 3. I高效液相色谱仪(紫外检测器)。A2. 3. 2超声波清洗器。A2. 4分析步骤
A2. 4. I灵芝酸A、B测定 A2. 4. I. I色谱条件
以辛烷基键合硅胶为键合相(色谱柱Agilent Zorbax-SB C8 150 mm X 4.6 mm,3.5 μ m或同类规格色谱柱)，乙腈为流动相A，O. I %醋酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm ;柱温为22 V ;流速为I. O ml/min。表I流动相梯度洗脱方式
权利要求
1.一种灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于以灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C2含量之和以及粗多糖含量作为灵芝水提物的质量控制指标。
2.根据权利要求I所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于 所述灵芝酸A、B含量的检测方法如下 (1)对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的灵芝酸A、B对照品，加入甲醇制成每I ml含164 Ug灵芝酸A和含52 μ g灵芝酸B的混标溶液； (2)供试品溶液的制备 取灵芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过； (3)高效液相色谱检测 以辛烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，O. I %醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm;柱温为22 °C ;流速为I. O ml/min ;理论板数按灵芝酸A计算，应不低于5000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得; 所述灵芝酸C2含量的检测方法如下 (1)对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的灵芝酸C2对照品，加甲醇制成每I ml含33 yg灵芝酸C2的对照品溶液； (2)供试品溶液的制备 取灵芝水提物O. 5 g，置25 ml容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，冷却，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过； (3)高效液相色谱检测 以十八烷基键合硅胶为填充剂，乙腈为流动相A，O. I %醋酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；检测波长为257 nm ;柱温为20°C ;流速为I. O ml/min ;理论板数按灵芝酸C2计算，应不低于5000 ;分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求I所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于所述粗多糖含量的检测方法如下 (1)标准曲线绘制取干燥至恒重的葡聚糖对照品，加水制成每I ml含葡聚糖I mg的溶液，分别精密吸取上述标准溶液O. 1、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0 ml至10. O ml量瓶中，加水稀释至刻度，分别吸取上述溶液2. O ml至25 ml比色管中，加入50 g/L苯酚溶液I. O ml，混匀，精密加入浓硫酸10. O ml，混匀，置水浴中煮沸2 min，混匀，冷却至室温后用分光光度计在485 nm波长处测定吸光度，以相应的试剂为空白，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线； (2)供试品溶液的制备 取灵芝水提物O. 4 g，置50 ml锥形瓶中，加水25. O ml，超声10 min，滤过；吸取滤液.5.0ml至50 ml离心管中，缓慢加入无水乙醇20 ml，边加边摇匀，4 °C放置12 h，取出，.3000 r/min离心8 min,弃去上清液,沉淀加水溶解并转移至10. 0 ml容量瓶中，加水定容，摇匀；吸取上述定容后的溶液2. O ml,置于15 ml离心管中，加入100 g/L氢氧化钠溶液.2.0ml、铜试剂2. O ml,置于沸水浴中煮沸3 min,冷却至室温，3000 r/min离心8 min,弃去上清液；沉淀用10 %硫酸溶液2. O ml溶解并转移至10. O ml容量瓶中，加水定容，摇匀，即得； (3)样品测定 吸取供试品溶液2. O 1111，根据步骤(1)，自“加入50 g/L苯酚溶液I. O ml”起，依法测定吸光度，利用标准曲线计算得到葡聚糖的含量。
4.根据权利要求I所述的灵芝水提物的质量控制方法，其特征在于测定的粗多糖含量≥30. 7mg/g,以葡聚糖计；灵芝酸A、B、C2含量之和，以干燥品计，赤芝、松杉灵芝水提物≥13. 3mg/g,紫芝水提物≥I. 8mg/g。
全文摘要
本发明涉及一种药品或保健品质量分析方法，具体涉及一种灵芝水提物的质量控制方法。为了有针对性地控制产品质量，本发明采用粗多糖含量和灵芝酸A、B、C2含量之和作为灵芝水提物的质量控制指标本研究通过水提醇沉法提取灵芝粗多糖，用铜试剂沉淀其中具有葡聚糖结构的多糖，采用紫外分光光度法测定其含量，排除了辅料对测定的影响，为灵芝水提物质量控制提供依据。赤芝、紫芝及松杉灵芝均含有相对含量较高的特征成分灵芝酸A、B、C2。对比目前常用的比色法测定总三萜含量的方法，特异性强，可达到鉴别和质量控制的目的。
文档编号G01N21/31GK102735772SQ20121022276
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者卢端萍, 吴长辉, 李晔, 王勇, 范明, 蒋婷婷, 陈硕 申请人:福建仙芝楼生物科技有限公司, 福建省药品检验所
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