专利名称：用于在单次分析中识别多种分析物并对其进行定量的方法
技术领域：
本发明一般涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统，并且尤其涉及用于在单次分析中分析多种分析物的基于亲和选择剂(affinity selector)的识别和定量系统以及方法。
背景技术：
在与约100，000种其它组分的混合物中测定单一分析物是艰巨的任务。60多年前，分析人员开始认识到抗体的结构选择性可用于基于抗原和半抗原的化学结构从生物提取物或血液中结合和纯化所述抗原和半抗原。该技术变得如此重要以至于Rosalyn Yalow因放射免疫测定(radio-1mmunological assay, RIA)而获得1960年的诺贝尔奖。连同酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA),这两种技术为世界提供了測量低至pg/mL水平的抗原的简单方法。RIA和ELISA 二者的基本组成是在测定的第一步中使用固定化抗体以实现从样品中选择抗原。自从出现这些方法以来，分析免疫学家已理解，在表面结合抗体引起了显着的动力学限制。例如，抗原必须依照分子大小而流动相当的距离以到达表面，从而提高了试管或微量滴定孔(miCTotiter well)中发生抗原结合所需的时间量。此外，測定中使用的所有抗体在测定孔表面或在颗粒上聚集在一起，而抗原则均匀地分散在整个溶液中。当在微量滴定孔中进行ELISA时，通常使用一天或更多天的孵育时间，以允许抗原有时间扩散到结合有抗体的孔壁上。在RIA情况下使扩散问题最小化的努力涉及使用大量的非常小的无机颗�？固骞潭ㄓ谄渖�。在过去的几年期间，已使用了许多类型的混合、流动、加热以及甚至超声处理操作以使上面提到的扩散问题最小化。尽管进行了这些努力，但扩散问题仍然存在。随着分析化学的发展，已认识到可获得涉及要同时测定多种分析物之样品的多种问题的更好更完整的答案。这导致了对“分析复用(analytical multiplexing) ”兴趣的增カロ，其中在单次分析期间对样品中的大量分析物进行分析。这通常通过免疫阵列而进行。对免疫阵列的兴趣源于微电子机械系统(micro-electro-mechanical-system,MEMS)的普及和成功。当已将几种类型的抗原阵列用于大规模复用(包括高通量和并行处理技术)吋，另ー些方法集中于较少数目样品的大規模复用，这是例如临床实验室中所需要的，其关心使每次测定的总分析时间和成本最小化。无论使用哪种方法，免疫阵列系统却仍然面临抗体固定化和动力学的挑战。还存在抗体在固定化(尤其是如果它们被错误地定位于表面)之后是否将仍将保留全部活性的问题。还必须考虑空间问题，尤其是抗体在表面的定位及其堆积密度的方面。最后，重现性也是ー个因素，尤其因为很难使来自在表面上沉积的皮升(picoliter)体积溶液的固定化抗体再生。蒸发以及很多其它现象也使滴定板水平的固定化所经历的重现性降低。尽管抗原在免疫阵列中必须扩散以到达表面的距离比在微量滴定孔中的要�。ρ侍馊匀皇敲庖哒罅械囊桓鲅现叵拗啤Ｕ庠诘涂乖ǘ认掠绕淙绱�。抗原从溶液中的所有点扩散至阵列组件之一需要大量的时间。因为抗原抗体复合物形成中的分子对接需要精确的空间定位，所以抗原通常在建立正确的捕获定位之前多次撞击表面。例如，如果抗原在128组件阵列上与表面碰撞之后没有被捕获,那么在第二次撞击表面之前有大量空间要行迸。如上所述，基于颗粒的測定始于RIA和Yalow方法，目前Yalow方法已发展成两类測定系统1)用于流式细胞术測定的颗粒方法(例如，Luminex系统)，其中检测单个颗粒的荧光；以及2)将抗原放置在磁性颗粒上的方法，免疫复合物在所述磁性颗粒上形成，然后将颗粒从溶液中取出并释放抗原用于进ー步测量(例如，Leigh Anderson的SISCAPA系统)。复用需要制备用于每种被測定抗原的不同组的免疫吸附珠。其意味着需要将20 50个不同组的抗体携带珠添加到样品溶液中，从而引起了在寻找合适抗体颗粒方面更大的抗原动力学限制。此外，溶液因具有如此大量的颗粒而变得拥挤，使得抗原必须在未携帯其抗体的颗粒周围扩散。用于处理这些限制的ー种推荐解决方案是将多个抗体固定在单个颗粒上。但是，该方案不完全解决扩散和化学计量控制的问题。而且，颗粒表面上抗体浓度的稀释意味着抗原可撞击颗粒表面而不接触其抗体。此外，总表面积以及因此所需颗粒的总数仍然保持很高。关于流式细胞术策略(例如Luminex系统)，在可通过流式细胞术分析免疫复合物之前，必须在颗粒表面上形成免疫复合物。而该系统与上面的非常类似，每个珠子携带靶向単一抗原的単一抗体。此外，在抗原捕获中还存在扩散问题。有趣的是，哺乳动物免疫系统的功能是处理数以千计的抗原，尽管它们不都是同时进行。随着在单个哺乳动物中产生对外来物质的免疫，产生了针对数以千计免疫原的抗体。这些抗体包含在血液中循环的免疫球蛋白中，在任何时候，随着抗原抗体复合物的形成，数百种抗原被隔离。基于分析哺乳动物免疫系统，由此可得出结论因为抗体形成免疫复合物，抗体已发展为在溶液中起作用。除了在溶液中起作用之外，它们还同时隔离多种抗原并且几乎没有固定化抗体測定系统中所见到的限制。哺乳动物免疫系统的上述观察结果极其重要，尤其是因为它们清楚地表明，溶液中形成免疫复合物是天然有效的，而在固定化表面上形成的复合物则不是。此外，清楚的是，可以在溶液(如血液)中同时形成几种免疫复合物，这是当进行分析复用过程时要实现的ー个必需因素。最后，通常影响免疫測定的大多数问题(例如，固定化期间的活性丧失、抗体的适当定位、扩散动力学和具有足够的表面积)在这些基于天然溶液的系统内并不普遍。尽管天然形成的免疫复合物有上述优点，但是这种免疫测定仍需要向样品添加抗体，这可产生问题。例如，向血浆样品添加大量抗体可引起蛋白质浓度升高至一定水平，使得分析物扩散受到阻碍。虽然这个问题在表面上看起来可能似乎有关系，但是进一步观察之后可推断出这个问题很可能并不合逻辑。更特别是血浆中存在血清白蛋白的平均浓度为约50至约100mg/mL,而存在的免疫球蛋白的量为约4mg/mL,并且任一特定抗体的量很可能在约I至约100 u g/mL的范围内。如果假定进行分析測量所需的抗体浓度为10 u g/mL,并且当100种抗体将加入到血浆样品中时，蛋白质浓度将总计升高约lmg/mL。类似地，如果血衆样品中蛋白质浓度为75mg/mL,那么蛋白质浓度将升高约1.3%。同样地,可推断出向血浆添加100种抗体以进行100倍的复用分析对蛋白质浓度、溶液黏度和最終分析物扩散几乎没有影响。而且，添加1000种抗体只使重量提高10mg/mL，或者使蛋白质浓度改变14%;这很可能不足以对分析造成影响。1960年以前,免疫测定通常祀向单个抗原并且通过称作“沉淀素反应(precipitinreaction) ”的方法在溶液中进行。形成免疫复合物之后，用于测定的多克隆抗体混合物或是形成沉淀，或是通过添加碳水化合物或こニ醇聚合物形成沉淀。抗原浓度通过光散射进行測定；但是该方法缺乏灵敏度和线性以及沉淀素測定一次只允许测定ー种抗原这一事实导致了该方法告终，并最终转变为更为灵敏的RIA和ELISA方法。尽管沉淀素反应方法失败了，仍然可以推理出如果选择性和检测灵敏度大大提高，则基于溶液的免疫复合物形成方法可用于免疫測定。尽管最初的沉淀素和RIA方法在进行抗原測量中取决于单ー选择方法(即ー种抗原)，但是现今可接受的是，単一抗体的选择性不足以将样品中的抗原与所有其它化学实体区分开。最近的免疫測定是以多维选择和/或鉴别为基础的，并且如果这些维度中的每ー个都是正交选择时尤其理想。
发明内容
本发明克服或改善了上面讨论的现有技术中缺点的至少ー个，或者通过提供用于分析抗原的新的多维分析策略和系统而提供有用的替换方案。
在其ー种形式中，提供了用于抗原分析的多维分析策略。根据本发明的这一方面，在第一维分析期间将样品溶液中的抗原用可溶性免疫复合物中的抗体隔离。在分析方法开始时向溶液添加抗体的具体目的是结合抗原以在多维方法的后续步骤中进行定性和定量分析。交叉反应抗原、非特异性结合物质和第二次与抗原结合的物质也可在第一维中吸附至免疫复合物，并且在之后维的分析中被清除。在第一维中形成的免疫复合物的独特性质进而在第二维分析中被利用，其使用分子大小分级系统(molecular sizing system)或革巴向隔离抗原之具体性质的吸附剂介质，基于流体力学体积将其与样品中的其它组分分离。基于这两种性质之一的分级对于表位互补位识别是正交的，并且第三維和第四维中的鉴别通过下述组合来实现分析物特异性化学修饰(例如，衍生化或蛋白质水解)和大小区分以及从表面(例如，在反相或离子交换介质上)吸附和差异洗脱，或者通过以大小排阻和疏水吸附(正如使用限进介质一祥)之组合。所选择的具体区分机制，以及其中它们联用的顺序取决于所靶向分析物的化学性质以及在前两维中使用的分级机制。第五维及更高维的分析发生在从质谱到荧光和电化学检测器的检测系统内。根据采用质谱检测系统的某些实施方案，可根据分析物在第五维中的质量、在第六维中碰撞诱导的分析物解离以及在第七维中所得碎片离子的质量分析来解析分析物。根据本发明的另一形式，提供了一种在样品溶液中同时分析多种分析物的多维方法。根据本发明的这个方面，所述方法包括向样品溶液添加亲和选择剂以形成亲和选择剂与分析物之间的免疫复合物；提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其它非分析物物质部分或全部分离；提供第二分离方式，以使所述样品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。根据本发明另ー些方面，提供了用于在样品溶液中同时分析多种分析物的多维方法。根据本发明的这个方面，所述方法包括向包含待測量分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对样品溶液中的ー种或更多种分析物具有亲和カ；允许在亲和选择剂与分析物之间形成免疫复合物；将所形成的免疫复合物与样品溶液中的非分析物物质中部分或全部分离；使所分离的免疫复合物解离；通过表面吸附过程捕获分析物而使解离的免疫复合物中的分析物与亲和选择剂彼此分离；将捕获的分析物转移至检测装置；以及用检测装置根据其质荷比来解析分析物。在本发明的某些方面中，通过以下将所形成的免疫复合物完全或部分分离根据流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，靶向亲和选择剂或分析物的独特结构特征以捕获分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交或者利用固定化亲和素来吸附和捕获生物素化的亲和选择剂。在本发明的另ー些方面中，通过以下将样品溶液中的分析物与亲和选择剂彼此分离根据流体力学体积分离分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面吸附和差异洗脱分析物，靶向亲和选择剂或分析物的独特结构特征靶以捕获分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择剂，从带电表面吸附和差异洗脱分析物，从固定化的金属亲和螯合剂吸附和差异洗脱分析物，或者从富含硼酸的表面吸附和差异洗脱分析物。根据本发明教导进行分析的分析物可包括但不限于以下至少ー种分析物片段、分析物衍生物和分析物同素异构物(isotopomer)。而且,本发明教导的亲和选择剂可包括但不限于以下至少ー种抗体、抗体片段、适配体(aptamer)、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。根据某些实施方案，所述细菌蛋白质可包括以下至少ー种G蛋白、A蛋白和由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质中，而所述寡核苷酸可包括RNA、DNA和PNA中的至少ー种。根据本发明的某些实施方案，用固定化抗体靶向亲和选择剂的独特结构特征使分析物与亲和选择剂彼此分离。根据这些具体实施方案，被祀向的独特结构特征可包括但不限于亲和选择剂特有的天然结构特征、已与亲和选择剂缀合的半抗原以及与亲和选择剂缀合的免疫原中的至少ー种。根据本发明的ー些方面，进行分析的分析物包括离子化的分析物，其可利用质谱分析来检测根据其质荷比所分离的分析物的母体离子。在本发明的某些方面中，通过使用检测装置对分析物进行解析，所述检测装置被配置成进行以下的整合步骤(a)使已根据其质荷比分离的分析物离子化；(b)利用气相破碎过程产生来自步骤(a)之母体离子的碎片离子；(c)根据其质荷比分离步骤(b)中产生的碎片离子；以及(d)记录当步骤(C)所产生的碎片离子与检测器表面碰撞时所产生的相对离子流。在用于解析分析物的检测装置方面，根据某些实施方案，通过以下技术中的ー种或更多种对分析物进行检测质谱、吸光度、荧光和电化学分析。根据本发明的另ー些实施方案，可使用同位素标记的内标物(isotopicallycoded internal standard)来实现分析物的相对或绝对定量。而且,连续添加、竞争性结合測定也可用于实现分析物的相对或绝对定量。在本发明的另ー些方面中，还可考虑利用抗体浓缩来从样品溶液中收集分析物的等量份。根据本发明的这些方面，将收集的等量份配置成与用于解析分析物之装置的最佳检测范围相适应。
根据本发明的另一形式，提供了利用多个正交分离维数来分析样品溶液中的多种分析物的方法。根据本发明的这个方面，所述方法包括向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的形成免疫复合物并且独立地隔离所述样品溶液中的ー种或更多种抗原和干扰物质；利用选择性吸附技术在第一或第二正交分离维数中除去所隔离的ー种或更多种抗体和干扰物质，而不论其顺序如何；提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所形成的免疫复合物与其它非分析物物质部分或全部分离；提供第二分离方式，以使所述样品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分离；以及根据其质荷比来解析所述分析物。根据本发明的另ー个方面，提供了ー种用于同时分析样品溶液中的多种分析物的方法，所述方法包括向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物；通过提供第一色谱柱来将所形成的复合物与所述样品溶液中的其它未复合物质分离；使所形成的复合物解离；通过第二色谱柱的表面吸附捕获所述分析物，以将所述分析物与所述亲和选择剂分离；将所捕获的分析物转移至与所述第二色谱柱相连的第三色谱柱；以及随着所述捕获的抗原或其片段从所述第三色谱柱洗脱，对所述捕获的抗原或其片段进行分析。根据本发明的某些方面，所述非复合物质包含这样的物质，其不包含被所添加亲和选择剂祀向的表位。在本发明的另ー些方面中，用于将样品溶液内形成的复合物与其它非复合物质分离的色谱柱选自以下至少ー种大小排阻色谱柱、填充有吸附剂的限进介质柱、被配置成靶向一般类别的所加入亲和选择剂的抗体柱、被配制成靶向所有的所加入的亲和选择剂的蛋白质A或G柱、具有与附着在一种或更多种所加入亲和选择剂上的寡核苷酸互补之固定DNA的DNA寡核苷酸柱、被配置成靶向附着在一种或更多种所加入亲和选择剂上的生物素的亲和素柱以及被配置成选择所加入亲和选择剂的天然或合成产生之特征的色谱柱。根据本发明的另ー些方面，通过表面吸附捕获分析物的用于将分析物与亲和选择剂分离的色谱柱选自以下至少ー种反相色谱柱、限进介质柱、免疫吸附、固定化的金属离子亲和色谱柱、离子交換柱和色谱保留装置。根据本发明的某些方面，亲和选择剂包括但不限于适配体、蛋白A、蛋白G、噬菌体展示蛋白、天然受体、凝集素、DNA、RNA、合成亲和试剂或表现出与分析物有亲和カ以在亲和捕获剂与分析物之间形成多种分子间复合物的ー些其它物质。附图简述參照本发明实施方案的以下描述以及附图，本发明的上述和其它优势以及获得它们的方式将变得显而易见，并且将更好地理解本发明本身，其中
图1为示出根据本发明教导基于亲和选择剂与分析物复合而形成复合物来同时分析多种分析物的多维方案；图2为根据本发明教导的限进介质(restricted access media, RAM)颗粒；图3为根据本发明教导的半渗透表面(semipermeable surface, SPS)支持物的图解；图4为根据本发明教导用于对通过亲和选择剂从复合物样品基质中捕获的蛋白质直接进行质谱(MS)分析的分析方案；
图5是根据本发明教导的限进柱的图解，柱内部为亲水凝胶并且外部涂有固定化膜蛋白酶；图6描述了根据本发明教导的胰蛋白酶-RAM柱中涂层的合成；图7是根据本发明教导用于对蛋白质进行质谱分析的分析方案，所述蛋白质通过亲和选择剂从复合物样品基质中捕获，并且随后在进ー步分析之前进行蛋白水解消化。图8是根据本发明教导的示例性阀门系统，其允许向截流模式分析中的固定化酶柱施加高压；图9是根据本发明教导用于对通过多克隆抗体亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；图10是根据本发明教导用于对通过生物素化亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；图11是根据本发明教导用于对通过DNA、RNA或PNA亲和选择剂捕获的半抗原和肽进行分析之方案的图解；图12是根据本发明教导基于分子尺寸用于对免疫复合物进行分级之方案的图解；以及图13是根据本发明教导的仪器平台的液相色谱组件，其能够进行基于亲和选择剂方法的高分辨率分析，用于同时分析多种分析物。发明详述以下描述的本发明实施方案并不g在穷举或将本发明限制在以下具体描述所公开的精确形式。相反，对实施方案进行选择和描述使得本领域其它技术人员可认识和理解本发明的原理和实践。如上面提到的，本发明一般涉及用于分析抗原的多维分析策略和系统。正如将在以下更具体解释的那样，本发明教导的ー个区别特征是这样的能力在第一维中与样品溶液中的分析物形成大量分子间复合物，之后在第二维中进行某ー类型分子间复合物的分离，这将产生级分用于在第三维中进行进ー步的分级或化学反应，之后在第三维中进行非常特异类型的分离或化学反应。在本发明教导的某些方面中，在第三维后可使用更高维的分析，并且尤其使得在多维分析方法结束时，将有这样的情况1)可将被检测的每种物质(分析物)単独地鉴定和定量，或者2)可一起测定密切相关家族的分析物。现在转到图1，示出了一种根据本发明的用于同时分析多种分析物的方案，该方案基于亲和选择剂(S。(例如，抗体、适配体、凝集素、蛋白G、蛋白A、噬菌体展示蛋白或结合蛋白质)与分析物(A)在第一维分析中复合，形成复合物(S* :A)。虽然根据本发明的某些方面，一般将特异性亲和选择剂用于每种分析物，但是在另ー些方面中，也可以有与多种分析物形成复合物的亲和选择剂，例如与许多糖蛋白偶联的祀向LewisX抗原的抗体。关于第一维(或“亲和选择维”)，该维中的方法基于亲和选择剂(S*)与分析物的复合作用。S*上的符号じ)指明亲和选择剂或复合物的独特结构特征，所述独特结构特征可在稍后较高维中用于对其进行选择。该第一维中的分析物分析始于溶液中单ー复合物的形成，如以下式I中所描述的那样
权利要求
1.一种用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法，所述方法包括 向包含待测定分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对于所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力； 允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物； 将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离； 使所分离的免疫复合物解离； 通过表面吸附过程捕获所述分析物而从所述解离的免疫复合物中将所述分析物与所述亲和选择剂彼此分离； 将所述捕获的分析物转移到检测装置中；以及 用所述检测装置根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述将所形成的免疫复合物部分或全部分离的步骤包括以下至少一种根据流体力学体积来分离所述分析物或所形成的免疫复合物，靶向所述亲和选择剂或所述分析物的独特结构特征以捕获所述分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交以及利用固定化亲和素来吸附和捕获生物素化的亲和选择剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中将所述分析物与所述亲和选择剂分离的步骤包括以下至少一种根据流体力学体积来分离所述分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面上吸附和差异洗脱所述分析物，靶向所述亲和选择剂或所述分析物的独特结构特征以捕获所述分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择剂，从带电表面上吸附和差异洗脱所述分析物，从固定化的金属亲和螯合剂上吸附和差异洗脱所述分析物，以及从富含硼酸的表面上吸附和差异洗脱所述分析物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括以下至少一种分析物片段、分析物衍生物和分析物同素异构物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和选择剂包括以下至少一种抗体、抗体片段、适配体、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细菌蛋白质包括以下至少一种G蛋白、A蛋白和由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其中将所述分析物与所述亲和选择剂分离的步骤包括用固定化抗体靶向所述亲和选择剂的独特结构特征，所述独特结构特征包括所述亲和选择剂特有的天然结构特征、已与所述亲和选择剂缀合的半抗原以及与所述亲和选择剂缀合的免疫原中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物包括离子化的分析物。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括利用质谱分析来检测根据其质荷比分离的所述分析物的母离子。
11.根据权利要求1所述的方法，其中解析所述分析物的步骤包括通过实施以下的整合步骤使用所述检测装置来解析所述分析物 (a)使已根据其质荷比分离的所述分析物离子化； (b)利用气相破碎过程来产生来自步骤(a)之母离子的碎片离子；(C)根据其质荷比分离步骤(b)所产生的碎片离子；以及 (d)记录当步骤(c)所产生的碎片离子与检测器表面碰撞时所产生的相对离子流。
12.根据权利要求1所述的方法，其中解析所述分析物的步骤包括使用所述检测装置通过质谱、吸光度、荧光和电化学分析中的至少一种来解析所述分析物。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括利用同位素标记的内标物来实现所述分析物的相对或绝对定量。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括利用连续添加、竞争性结合分析来实现所述分析物的相对或绝对定量。
15.根据权利要求1所述的方法，还包括利用抗体浓缩来从所述样品溶液中收集分析物的等量份，所收集的等量份与用来解析所述分析物之装置的最佳检测范围相适应。
16.一种利用多个正交分离维数来分析样品溶液中的多种分析物的方法，所述方法包括 向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物并且独立地隔离所述样品溶液中的一种或更多种抗原和干扰物质； 利用选择性吸附技术在第一或第二正交分离维数中除去所隔离的一种或更多种抗体和干扰物质，而不论其顺序如何； 提供第一分离方式，以使所述样品溶液中的所形成免疫复合物与其它非分析物物质部分或全部分离； 提供第二分离方式，以使所述样品溶液中的所述分析物彼此部分或全部分离；以及 根据其质荷比来解析所述分析物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中提供第一分离方式的步骤包括以下至少一种根据流体力学体积分离所述分析物或所形成的免疫复合物，靶向所述亲和选择剂或所述分析物的独特结构特征以捕获所述分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，以及利用固定化亲和素来吸附和捕获生物素化的亲和选择剂。
18.根据权利要求16所述的方法，其中提供第二分离方式的步骤包括以下至少一种根据流体力学体积分离所述分析物或所形成的免疫复合物，从疏水表面上吸附或差异洗脱所述分析物，靶向所述亲和选择剂或所述分析物的独特结构特征以捕获所述分析物或所形成的免疫复合物的抗体，进行寡核苷酸杂交，利用固定化亲和素捕获生物素化的亲和选择齐U，从带电表面上吸附或差异洗脱所述分析物，从固定化金属亲和螯合剂上吸附或差异洗脱所述分析物，以及从富含硼酸的表面上吸附或差异洗脱所述分析物。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述分析物包括以下至少一种分析物片段、分析物衍生物和分析物同素异构物。
20.根据权利要求16所述的方法，其中所述亲和选择剂包括以下至少一种抗体、抗体片段、适配体、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细菌蛋白质包括以下至少一种G蛋白、A蛋白和由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一种。
23.根据权利要求16所述的方法，其中提供第二分离方式的步骤包括用固定化抗体革巴向所述亲和选择剂的独特结构特征，所述独特结构特征包括所述亲和选择剂特有的天然结构特征、已与所述亲和选择剂缀合的半抗原以及与所述亲和选择剂缀合的免疫原中的至少一种。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述分析物包括离子化的分析物。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括利用质谱分析来检测根据其质荷比所分离的分析物的母离子。
26.根据权利要求16所述的方法，其中根据其质荷比来解析所述分析物的步骤包括通过以下的整合步骤使用检测装置来解析所述分析物 (a)使已根据其质荷比分离的所述分析物离子化； (b)利用气相破碎过程来产生来自步骤(a)之母离子的碎片离子； (C)根据其质荷比分离步骤(b)所产生的碎片离子；以及 (d)记录当步骤(c)所产生的碎片离子与检测器表面碰撞时所产生的相对离子流。
27.根据权利要求16所述的方法，其中解析所述分析物的步骤包括使用利用质谱、吸光度、荧光和电化学分析中的至少一种的检测装置来解析所述分析物。
28.根据权利要求16所述的方法，还包括利用同位素标记的内标物来实现所述分析物的相对或绝对定量。
29.根据权利要求16所述的方法，还包括利用连续添加、竞争性结合分析来实现所述分析物的相对或绝对定量。
30.根据权利要求16所述的方法，还包括利用抗体浓缩来从样品溶液中收集分析物的等量份，所收集的等量份与用来解析所述分析物之装置的最佳检测范围相适应。
31.一种用于同时分析样品溶液中的分析物的方法，所述方法包括 向所述样品溶液中添加亲和选择剂以形成所述亲和选择剂与所述分析物的免疫复合物； 通过提供第一色谱柱来将所形成的复合物与所述样品溶液中的其它未复合物质分离； 使所形成的复合物解离； 通过第二色谱柱的表面吸附捕获所述分析物，以将所述分析物与所述亲和选择剂分离； 将所捕获的分析物转移至与所述第二色谱柱相连的第三色谱柱；以及随着所述捕获的抗原或其片段从所述第三色谱柱洗脱，对所述捕获的抗原或其片段进行分析。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述亲和选择剂包括以下至少一种抗体、抗体片段、适配体、凝集素、噬菌体展示蛋白受体、细菌蛋白质和寡核苷酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细菌蛋白质包括以下至少一种G蛋白、A蛋白和由生物体产生的用于靶向来自另一生物体之蛋白质的蛋白质。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述寡核苷酸包括RNA、DNA和PNA中的至少一种。
35.根据权利要求31所述的方法，其中所述未复合物质包括这样的物质，其不包含被所添加亲和选择剂靶向的表位。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述第一色谱柱选自以下色谱柱中的至少一种大小排阻色谱柱、填充有吸附剂的限进介质柱、被配置成靶向一般类别的所加入亲和选择剂的抗体柱、被配制成靶向所有的所加入的亲和选择剂的蛋白质A或G柱、具有与附着在一种或更多种所加入亲和选择剂上的寡核苷酸互补之固定DNA的DNA寡核苷酸柱、被配置成靶向附着在一种或更多种所加入亲和选择剂上的生物素的亲和素柱以及被配置成选择所加入亲和选择剂的天然或合成产生之特征的色谱柱。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二色谱柱选自以下至少一种反相色谱柱、限进介质柱、免疫吸附、固定化的金属离子亲和色谱柱、离子交换柱和色谱保留装置。
38.根据权利要求31所述的方法，还包括利用同位素标记的内标物来实现所述分析物的相对或绝对定量。
39.根据权利要求31所述的方法，还包括利用连续添加、竞争性结合分析来实现所述分析物的相对或绝对定量。
40.根据权利要求31所述的方法，还包括利用抗体浓缩来从样品溶液中收集分析物的等量份，所收集的等量份与用来解析所述分析物之装置的最佳检测范围相适应。
全文摘要
一种用于同时分析样品溶液中的多种分析物的多维方法，其包括向包含待测定分析物的样品溶液中添加亲和选择剂，所述亲和选择剂对于所述样品溶液中的所述分析物中的一种或更多种具有亲和力；允许所述亲和选择剂与所述分析物形成免疫复合物；将所形成的免疫复合物与所述样品溶液中的非分析物物质部分或全部分离；解离所分离的免疫复合物；通过表面吸附过程捕获所述分析物而从所述解离的免疫复合物中将所述分析物与所述亲和选择剂彼此分离；将所述捕获的分析物转移到检测装置中；以及用所述检测装置根据所述分析物的质荷比来解析所述分析物。
文档编号G01N30/72GK103038631SQ201080065320
公开日2013年4月10日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者弗雷德·E·雷尼尔, 尼古拉斯·B·赫罗尔德, 凯文·W·迈尔 申请人:珀菲尼迪生物科学股份有限公司
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