亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：用手性柱分离鉴定及制备葫芦素混合物中单体物质的hplc方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种葫芦素混合物的分离、制备及鉴定，更具体的是涉及采用手性柱进行葫芦素混合物的分离、鉴定和制备。
背景技术：
葫芦素(Cucurbitacins)是一类高度氧化三萜类成分，在植物中的分布很广，有二百余种之多。药理实验表明，葫芦素具有抗肿瘤、抗化学致癌、保肝、提高免疫力等多种生物活性，我国从甜瓜蒂中提取的葫芦素制剂已经用于临床，其片剂收载于卫生部药品标准 《中药成方制剂》第十九册。临床试验证明其对原发性肝癌和肝炎的治疗有显著疗效。葫芦素片用于治疗慢性肝炎(药学通报1986，21 (6) :357葫芦素片)，经上海、北京、重庆等地十三家医院临床使用，其有效率为75. 2%，显效率为44. 6%。临床上观察到葫芦素片能较全面地改善慢性肝炎常见症状和主要体征，并有明显的降酶、降浊和降胆红质作用，停药后不引起S-GPT反跳，对蛋白倒置和高球蛋白血症也有明显的纠正作用，还能提高慢性肝炎患者的非特异性细胞免疫能力，无明显毒副作用。此外，葫芦素片还能用于治疗原发性肝癌，经上海、北京、广西等地六家医院临床观察，统计169例，有效率69%，显效率39%。临床观察表明，该药与5-氟脲嘧啶比较，其改善症状、消除肝痛、缩小瘤体、延长生存期、恢复体力等，均优于对照组，且无一般化疗药物的毒副作用(中草药1987，18 (10) :21治疗肝炎、 肝癌新药葫芦素片；新药与临床1984,3 ) 21葫芦素治疗原发性肝癌50例临床观察；中草药1992,23(11) :605葫芦素的药理与临床应用)。还有作者将葫芦素片与化疗药联合， 治疗中晚期肝癌，中位生存期由单一化疗药的6. 1 士7. 12月，提高到12. 5士7. M月(癌症 1989,8(6) :434葫芦素片加化疗药治疗中晚期原发性肝癌的临床疗效观察)。葫芦素类物质多为水中难溶性化合物，其制剂的体外溶出与体内吸收均存在较大问题，从而影响药物疗效的发挥。解决难溶性药物水溶性的一个重要方法是采用纳米技术，我们在完成国家973 课题(国家重点基础研究发展计划2009CB9033(^)时发现，纳米化过程中，药物的表面积大大增加，光解、水解等稳定性问题更易产生，建立合理的分析方法极为重要。目前用于临床的葫芦素提取物以葫芦素B为主要成分，其中还包含葫芦素E等多种成分，而其法定质量标准中仅对葫芦素B进行了测定，规定葫芦素原料中含葫芦素B不低于60%，对于其他成分未进行控制，这对于药品的安全性、有效性和质量可控性都是极为不利的。在欧美国家上市销售的药品中，包括原料药和制剂均应有它的杂质列表，对生产制造和精制工艺中产生的，含量超过0. 的杂质均需要进行结构确证，并进行相关的毒理学研究，目前国内对药品中杂质控制的要求已经达到甚至超过了国际标准，因此分离葫芦素原料中的杂质并对其进行结构确证是非常有必要的。文献报道葫芦素类化合物的分离多采用硅胶柱色谱法，但由于各种葫芦素的结构极为相似，此法分离效果较差，存在操作繁琐、重复性不好、并且使用到氯仿、苯等有毒试剂的缺点，导致各种葫芦素单体的制备较为困难。葫芦素含量测定的方法大多采用反相高效液相色谱法，部颁标准《中药成方制剂》第十九册中，对葫芦素原料及片剂中的葫芦素B进行了测定，亦有文献报道用高效液相色谱法测定葫芦素片的含量及均勻度(药物分析杂质1991，11 (4) 245高效液相色谱法用于葫芦素片的含量及片剂均勻度测定)，还有人研究了用HPLC法测定滴丸剂中葫芦素B的含量(中草药2003,34( :421RP-HPLC法测定葫芦素滴丸中葫芦素B的含量)。最近，李晓峰等采用HPLC同时测定葫芦素原料中葫芦素B和葫芦素E的含量(李晓峰刘克非邓意辉HPLC法同时测定葫芦素原料中葫芦素B和葫芦素E的含量沈阳药科大学学报2010 27(02) :123-125) 0我们在实验中发现，葫芦素(包括瓜蒂素)中除了葫芦素B、E外，尚有几种其他成分，而同时测定葫芦素原料药与制剂中葫芦素B及其共存物质含量的方法尚未见报道。在本发明的相关实验中，曾使用C18柱、C8柱、氨基柱、纯硅胶柱等常用色谱柱，均不能有效的分离以上化合物。

发明内容
为解决现有技术存在的上述问题，发明人旨在提供一种分离效果好、操作简单、准确度高和专属性强的高效液相色谱法(HPLC方法)，用于分离鉴定葫芦素混合物，测定出葫芦素混合物中各种葫芦素单体的含量，并可制备出各种葫芦素单体。为实现本发明的目的，发明人提供如下技术方案—种用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其色谱工艺条件为色谱柱采用以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱.流动相来自异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物。检测波长220nm 270nm
流速1. 0 4. OmL/min进样量0.OOlmL 至 1. OmL柱温10 40°C用于制备葫芦素化合物中各单体的条件为色谱柱以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱。流动相异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物。检测波长220nm 270nm流速1.O 30. OmL/min进样量0.ImL 至 10. OmL柱温10 40°C作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法， 其中，所述的直链淀粉类衍生物是直链淀粉2-三(3，5-2 二甲苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(S-a-苯乙基氨基甲酸酯)。作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法， 其中，所述的流动相混合物中正己烷、异己烷、正戊烷的体积比例为20% 90%，异丙醇、 乙醇、甲醇、乙腈的体积比例为 50%，三氟乙酸、冰醋酸的体积比例为0% 2%。作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，其中，所述的葫芦素混合物配制为0. 01 lOmg/mL浓度的样品用于分离鉴定。作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法， 其中，所述的葫芦素混合物分离为葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、3-表-异葫芦素B 和葫芦素E五种单体。可以理解的是，根据高效液相色谱法的原理，就可以得到各种葫芦素单体在葫芦素混合物中的含量。本发明还提供由上述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法制备的各种葫芦素单体。根据各种葫芦素单体的出峰时间分别收集分离出的液体产物，得到含五种葫芦素的溶液，再经减压蒸发除去溶剂，即可得到葫芦素B及四种杂质的纯品。作为优选方案，根据本发明所述的用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法制备的各种葫芦素单体，其中，所述的葫芦素单体包括葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、 3-表-异葫芦素B和葫芦素E五种单体。发明人在实验中发现，以葫芦素原料中富集的杂质混合物(其中含葫芦素B约 15% )为对象进行分离研究，使用直链淀粉类衍生物的手性色谱柱对葫芦素混合物具有很好的分离效果，得到了葫芦素B等五种葫芦素单体，所得四个杂质单体经紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振谱CH NMR^CWRJH-1H cosy、HSQC和HMBC)表征，分别确定其结构为葫芦素E、异葫芦素B、3-表-异葫芦素B和二氢葫芦素B。本发明采用以直链淀粉类衍生物为固定相的手性柱，如分析型的CHIRALPAK AD-H手性柱，即可建立一种可以同时测定葫芦素B及其相关的四种杂质的分析方法，能更好的控制葫芦素原料及其制剂的质量。所述的CHIRALPAK AD-H手性柱是将直链淀粉 2-三(3，5-2 二甲苯基氨基甲酸酯)键合在硅胶载体上制成的，样品分子与固定相之间的相互作用主要是氢键、η-η相互作用和空间位置作用。为更好说明本发明的优点，发明人对色谱柱的选择、流动相的选择及检测波长等方面--做下述详述。对照实验例1不同色谱柱对葫芦素混合物分离效果的比较样品精密称取葫芦素混合物约10mg，置IOmL量瓶中，加适量乙醇超声使溶解，并定容至刻度，摇勻，过滤，取续滤液，得供试品溶液，即用无水乙醇配制lmg/mL的葫芦素混合物溶液。本实验考察了 C18柱、C8柱、氨基柱、纯硅胶柱对葫芦素混合物的分离效果，并与 CHIRALPAK AD-H手性柱进行比较。液相色谱条件柱温室温，检测波长220nm，流速=LOmL · mirT1，进样量:20μ L。结果如下的表1 表1不同色谱柱对葫芦素混合物分离效果的结果
权利要求
1.一种用手性柱分离鉴定及制备葫芦素混合物制剂中单体物质的HPLC方法，其特征在于，所述方法的工艺条件为色谱柱以表面涂布有直链淀粉类衍生物的硅胶作为固定相的手性柱流动相异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物检测波长220nm 270nm流速1. 0 30. OmL/min进样量0. OOlmL 至 10. OmL柱温10 40°C。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当流速为1.O 4. OmL/min,进样量为 0. OOlmL至0. ImL时用于分离鉴定葫芦素混合物中单体物质。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当流速为1.O 30. OmL/min,进样量为 0. ImL至10. OmL时用于制备葫芦素混合物中单体物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的直链淀粉类衍生物是直链淀粉 2-三(3，5-2 二甲苯基氨基甲酸酯)或直链淀粉-三(S-a-苯乙基氨基甲酸酯)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相混合物中正己烷、异己烷、 正戊烷的体积比例为20% 90%，异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈的体积比例为1 % 50%，三氟乙酸、冰醋酸的体积比例为0% 2%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葫芦素混合物配制为0.01 lOmg/mL浓度的样品用于分离鉴定。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葫芦素混合物中单体物质为葫芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、3-表-异葫芦素B和葫芦素E五种单体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的制剂包括固体制剂、半固体制剂、液体制剂、气雾剂、粉雾剂。
全文摘要
本发明公开了一种用手性柱分离鉴定葫芦素混合物的HPLC方法，所述的HPLC方法的工艺条件为色谱柱采用以直链淀粉类衍生物为固定相的手性柱，流动相为异丙醇、乙醇、甲醇、乙腈、正己烷、异己烷、正戊烷、三氟乙酸、冰醋酸中的两种以上的混合物，检测波长为220nm～270nm。本发明的方法具有操作简单、准确度高，专属性强的特点，可以很好地分离葫芦素混合物中胡芦素B、异葫芦素B、二氢葫芦素B、葫芦素E等物质，并可用于从胡芦素混合物中制备各种葫芦素单体，亦可用于准确测定葫芦素原料及其制剂中各种葫芦素的含量。
文档编号G01N30/08GK102297905SQ201010209418
公开日2011年12月28日 申请日期2010年6月25日 优先权日2010年6月25日
发明者季秀峰, 李晓峰, 邓意辉 申请人:沈阳药科大学