专利名称：火锅底料中多种合成色素的同时测定方法
技术领域：
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及火锅底料中多种合成色素的同时测定方法。
背景技术：
火锅底料是由牛油、辣椒、花椒、葱、姜、蒜和香辛料等几十种材料混合熬制而成的一种固体复合调味料。色泽鲜红是火锅的一大特点，其主要成色物质来自辣椒中的辣椒红色素等天然色素，但也有不法商家为了降低成本、改善卖相，在制作过程中加入各种人工合成色素。人工合成色素通常以苯及其同系物为原料，经过磺化、硝化、卤化和偶氮化等一系列有机反应制得。毒理学研究发现，有些合成色素有慢性毒性或致癌性，各国都严格控制其使用范围和使用量。鉴于合成色素对人体的�：π裕澜绺鞴院铣墒秤蒙氐氖褂弥掷�、使用量和允许使用的食品均有明确规定。日本允许使用的合成色素有苋菜红、藻红、诱惑红、胭脂红、焰红、孟加拉红、桔红、柠檬黄、日落黄、不退绿FCF或它的银红、亮蓝，共11种；美国允许使用的有阿洛拉红、亮蓝、赤藓红、橘红2号、坚固绿、靛蓝、立索玉红、日落黄、柠檬黄和橙色B等；欧盟允许使用的有酸性黄、柠檬黄、喹啉黄、日落黄FCF、胭脂红、偶氮玉红、苋菜红、丽春红4R、赤藓红、红色2G、诱惑红AC、专利蓝V、靛蓝、亮蓝FCF、亮黑BN、棕色FK、棕色HT、立索尔宝红BK等。截止1998年底，我国批准允许使用的合成色素有觅菜红、觅菜红铝色淀、月因脂红、胭脂红铝色淀、赤药红；赤露红铝色淀、新红，新红铝色淀；柠檬黄、柠檬黄铝色淀、日落黄、日落黄铝色淀、亮兰；亮兰铝色淀、靛兰、靛兰铝色淀，叶绿素铜钠盐、B-胡萝B卜素、二氧化钛、诱惑红；酸性红等，共21种。由于火锅底料组成复杂、基体干扰严重，检测色素时按常规方法提取难度大，抽提不完全，影响测定的准确性，因此有必要建立火锅底料中合成色素的高效和准确测定方法。为保护人体健康建立简便、可靠、快速和灵敏的分析方法，对于监控火锅底料的产品质量，确保食品安全，促进我国火锅行业的健康和稳定发展，促进国际贸易，都具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种火锅底料中多种合成色素的同时测定方法。为实现上述目的本发明采用的技术方案是
火锅底料中多种合成色素的同时测定方法，步骤如下
I)提取样本
称取5. OOg待测试样于50mL离心管中，加入20mL甲醇-丙酮溶液，60°C水浴lOmin，油脂融化后旋涡混匀，5000rpm离心5min，将上清液转移至150mL旋蒸瓶中；加入20mL甲醇-丙酮溶液，重复上述操作I次；加15mL 2mol/L尿素甲醇溶液，重复上述操作2次；合并每次上清液于旋蒸瓶中，40°C下旋蒸浓缩至近干。
2)分离净化样本
分别用5mL乙酸乙酯-环己烷溶液、5mL水洗涤步骤I)中旋蒸瓶各2次，并将洗涤液转移至50mL离心试管中，旋润混勻lmin, 5000rpm离心5 min ;将离心试管中乙酸乙酯-环己烷层转移至IOmL比色管中，40°C下氮气浓缩至近干，用乙酸乙酯-环己烷溶液溶解比色管中残渣并定容至5mL，得待GPC净化的脂溶性样本；向离心试管水相中加入ImL磷酸溶液，混匀，得待SPE净化的水溶性样本。A、SPE 净化
将水溶性样本全部转移至聚酰胺树脂层析柱中，以2 3mL/min流经层析柱，同时用5mL O. 1%磷酸溶液洗涤离心试管并转移至层析柱中，待试液刚刚到达层析柱顶端时，再向层析柱中加入5mL 80%甲醇溶液淋洗并抽空，最后用IOmL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，弃去前3mL洗脱液，收集后7mL洗脱液于IOmL比色管中，并用甲醇定容至刻度，得SPE净化样本。B、GPC 净化
将脂溶性样本按如下程序进行GPC净化，得到GPC净化样本；
凝胶渗透色谱仪净化柱400 mmX 25 mm,内装Bio-Beads, S-X3, 38 Mm 75 Mm填料； 流动相环己烷-乙酸乙酯；
流速4. 7 mL/min ；
进样量4. 5 mL ；
开始收集时间13 min ；
结束收集时间20 min。3 )浓缩SPE净化样本和GPC净化样本
将32.9mL GPC净化样本和9. OmL SPE净化样本转移至同一旋蒸瓶中，40°C下旋蒸浓缩至近干，用5mL甲醇-丙酮溶液洗涤旋蒸瓶并转移至刻度试管中，在40°C下氮气浓缩近干，加入0.9mL甲醇-丙酮溶液溶解刻度试管中残渣，过滤膜过滤后，供HPLC测定；过滤膜为
O.45 mm亲水性聚醚砜膜。4) HPLC 条件
色谱柱C18,250 mmX4. 6 mm (内径)，5 μ m ；
流动相甲醇-O.Olmol/L磷酸盐缓冲液，梯度洗脱；
检测波长程序可变波长，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ；
柱温30°C ;
流速1. OmL/min ；
进样量10yL ;
后运行时间5. Omin。获得液相色谱图。5)结果计算
用色谱数据处理机或按公式(I)计算试样中合成色素的含量，计算结果须扣除空白
值 CiXfrXl OOO
Xi = ---(I)
WXl 000
式中
Xi——待测试样中待测物质的含量，单位为毫克每千克；
Ci——从液相色谱图上得到的待测物质的溶液浓度，单位为微克每毫升；
V——样液最终定容体积，单位为毫升； m——最终样液所代表的待测试样质量，单位为克。步骤4)中所述梯度洗脱的洗脱程序如下
时间/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸盐缓冲液/%
O1090
14100O
30100O。与现有检测方法相比本发明可同时检测多种火锅底料中水溶性和脂溶性的合成色素，检测步骤简便、准确度和精密度高。
图I为十六种合成色素标准溶液的液相色谱图(O. 05 mg/L)；
图中横坐标表示各色素保留时间，纵坐标表示各色素的响应强度(峰高);第5和第6个峰分别是9. 742和9. 923。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式
做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本实施例采用的是重庆小天鹅集团生产的麻辣火锅底料，规格为300g/袋。甲醇、乙酸乙酯和环己烷选用色谱纯级的。具体测定过程如下
I)提取
准确称取5. 00 g试样(精确至O. 01 g)于50 mL离心管中，分别加入20 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，置于60 °C水浴10 min,让油脂融化后,旋涡混匀2 min, 5000 rpm离心5 min，将上清液转移至150 mL旋蒸瓶中；再用20 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)重复上述操作I次；加15 mL 2 mol/L尿素甲醇溶液(含5%氨水溶液)重复上述操作2次；合并每次上清液于40 °C下旋蒸浓缩近干。2)净化
分别用5 mL乙酸乙酯-环己烷溶液(1+1，V/V)、5 mL水洗涤步骤I)中旋蒸瓶各两次，并将洗漆液转移至50 mL离心试管中，旋润混勻I min,5000 rpm离心5 min。将乙酸乙酯-环己烷层转移至10 mL比色管中，40°C下氮气浓缩近干，用乙酸乙酯-环己烷溶液(1+1，K/K)溶解残渣并定容至5 mL，待GPC净化；向水相中加入I mL磷酸溶液(1+1，K/K)，混匀，待SPE净化。A、SPE 净化将经过酸化的水相全部转移至聚酰胺树脂层析柱中，以2 3 mL/min流经层析柱，同时用5 mL O. 1%磷酸溶液洗涤离心试管并转移至层析柱中，待试液刚刚到达层析柱顶端时，再向层析柱中加入5 mL 80%甲醇(含0.1% H3PO4)溶液淋洗并抽空，最后用10 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，弃去前3 mL洗脱液，收集后7 mL洗脱液于10 mL比色管中，并用甲醇定容至刻度(IOmL)。
B、GPC 净化
凝胶渗透色谱仪净化柱400 mmX 25 mm (i. d.),内装Bio-Beads, S_X3, 38 Mm 75Mm填料。流动相环己烷-乙酸乙酯(1+1，V/V)；
流速4. 7 mL/min ；
进样量4. 5 mL ；
开始收集时间13 min ；
结束收集时间20 min。3)浓缩
将32.9mL GPC洗脱液和9. O mL SPE洗脱液转移至旋蒸瓶中，40°C下旋蒸浓缩至近干，用5 mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)少量多次洗涤旋蒸瓶并转移至刻度试管中，在40°C下氮气浓缩至近干，加入O. 9mL甲醇-丙酮溶液(1+1，V/V)溶解残渣，过滤膜(O. 45 mm亲水性聚醚砜膜)后，供HPLC测定。4)液相色谱(HPLC)条件
色谱柱C18,250 mmX4. 6 mm (内径)，5 μ m,或相当者；
流动相甲醇-O.Olmol/L磷酸盐缓冲液(4. 17)，梯度洗脱程序如下
时间/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸盐缓冲液/%
O1090
14100O
30100O ；
检测波长程序可变波长，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ；
柱温30 °C ；
流速1. 0 mL/min ；
进样量10 UL ；
后运行时间5. O min。5)液相色谱测定
根据样品中被测物的含量，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中各种合成色素的响应值均应在仪器的线性范围内。标准工作溶液和样液等体积穿插进样测定，在上述色谱条件下，各目标化合物的参考保留时间见中表I。标准溶液的液相色谱图参见图I。表I十六种合成色素的参考保留时间
权利要求
1.火锅底料中多种合成色素的同时测定方法，步骤如下 1)提取样本 称取5. OOg待测试样于50mL离心管中，加入20mL甲醇-丙酮溶液，60°C水浴lOmin，油脂融化后旋涡混匀，5000rpm离心5min，将上清液转移至150mL旋蒸瓶中；加入20mL甲醇-丙酮溶液，重复上述操 作I次；加15mL 2mol/L尿素甲醇溶液，重复上述操作2次；合并每次上清液于旋蒸瓶中，40°C下旋蒸浓缩至近干； 2)分离净化样本 分别用5mL乙酸乙酯-环己烷溶液、5mL水洗涤步骤I)中旋蒸瓶各2次，并将洗涤液转移至50mL离心试管中，旋润混勻lmin, 5000rpm离心5 min ;将离心试管中乙酸乙酯-环己烷层转移至IOmL比色管中，40°C下氮气浓缩至近干，用乙酸乙酯-环己烷溶液溶解比色管中残渣并定容至5mL，得待GPC净化的脂溶性样本；向离心试管水相中加入ImL磷酸溶液，混匀，得待SPE净化的水溶性样本； A、SPE净化 将水溶性样本全部转移至聚酰胺树脂层析柱中，以2 3mL/min流经层析柱，同时用5mL O. 1%磷酸溶液洗涤离心试管并转移至层析柱中，待试液刚刚到达层析柱顶端时，再向层析柱中加入5mL 80%甲醇溶液淋洗并抽空，最后用IOmL 5%氨水-甲醇溶液洗脱，弃去前3mL洗脱液，收集后7mL洗脱液于IOmL比色管中，并用甲醇定容至刻度，得SPE净化样本； B、GPC净化 将脂溶性样本按如下程序进行GPC净化，得到GPC净化样本； 凝胶渗透色谱仪净化柱400 mmX 25 mm,内装Bio-Beads, S-X3, 38 Mm 75 Mm填料； 流动相环己烷-乙酸乙酯；流速4. 7 mL/min ； 进样量4. 5 mL ； 开始收集时间13 min ； 结束收集时间20 min ； 3)浓缩SPE净化样本和GPC净化样本 将32.9mL GPC净化样本和9. OmL SPE净化样本转移至同一旋蒸瓶中，40°C下旋蒸浓缩至近干，用5mL甲醇-丙酮溶液洗涤旋蒸瓶并转移至刻度试管中，在40°C下氮气浓缩近干，加入0.9mL甲醇-丙酮溶液溶解刻度试管中残渣，过滤膜过滤后，供HPLC测定； 4)HPLC测定条件 色谱柱C18 ； 流动相甲醇-O.Olmol/L磷酸盐缓冲液，梯度洗脱； 检测波长程序可变波长，O 13. 7min 520nm ；13. 71 15min 420nm ；15. 01 30min520nm ； 柱温30°C ;流速1. OmL/min ； 进样量10yL ; 后运行时间5. Omin ； 获得液相色谱图；5)结果计算 用色谱数据处理机或按公式(I)计算试样中合成色素的含量，计算结果须扣除空白值
2.根据权利要求I所述火锅底料中多种合成色素的同时测定方法，其特征是步骤4)中所述梯度洗脱的洗脱程序如下 时间/min 甲醇/% O. 01mol/L磷酸盐缓冲液/% O1090 14100O 30100O。
3.根据权利要求I所述火锅底料中多种合成色素的同时测定方法，其特征是步骤3)中所述过滤膜为O. 45 mm亲水性聚醚砜膜。
4.根据权利要求I所述火锅底料中多种合成色素的同时测定方法，其特征是步骤4)中所述色谱柱规格为250 mmX4. 6 mm, 5 μ m。
全文摘要
本发明公开了一种火锅底料中多种合成色素的同时测定方法。该方法包括火锅底料中新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、赤藓红、日落黄、酸性红G、酸性大红GR、罗丹明B、对位红、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ、苏丹橙G和苏丹红7B等多种合成色素的提取、浓缩、净化和同时检测方法。本发明提供的火锅底料中多种合成色素的同时测定方法具有步骤简便、准确度和精密度高的优点。
文档编号G01N30/88GK102636592SQ201210143699
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者唐柏彬, 张进忠, 张雷, 李应国, 李贤良, 王国民, 郑小玲, 郗存显 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
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