专利名称：检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法
技术领域：
本发明涉及检测领域，特别涉及检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法。
背景技术：
花色苷是花色素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于黑米、紫薯、葡萄、蓝莓、甘蓝等多种天然有色蔬菜和水果的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中。由于花色苷具有抗氧化、清除自由基作用、抗炎、降血脂、心血管保护、抗肿瘤、抗衰老、抗炎、保肝等作用，因此添加花色苷的食品备受人们喜爱。国内外以花色苷为原料的保健食品和膳食补充剂已经开始上市，其健康功效明显。花色苷的抗氧化、清除自由基作用、减少血浆氧化型低密度脂蛋白(oxidized LDL)形成、抗肿瘤、心血管保护、抗衰老、抗炎、保肝等功效与花色苷的在不同组织细胞的生物利用率有关。目前关于花色苷研究主要集中在肠道吸收和血、尿中代谢物检测方面，但相关检测结果无法反映在其他靶细胞的生物利用情况。同时， 关于花色苷在不同的靶细胞的生物利用，目前没有一种方便、敏感和准确的检测方法。因此，急需一种检测花色苷的方法，用于研究花色苷的在体内靶细胞的生物利用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法， 该方法操作简单，检测时间短，可检范围宽，不需要特殊设备，即能定性还能定量分析。为实现上述目的，技术方案为
检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，包括以下步骤
a.用终浓度为I 200μ M的花色苷处理靶细胞，得处理靶细胞；
b.将步骤a所得处理靶细胞先用PBS洗涤，再用胰蛋白酶消化，计数细胞，然后破碎细胞，最后离心收集上清液，备用；
c.将步骤b所得上清液用氮气干燥，干燥后溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，测定在最大接收波长的突光 强度；
d.准确称取花色苷，溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，配置成浓度梯度的标准液，然后测定标准液在最大接收波长的荧光强度，根据标准液浓度和荧光强度绘制标准曲线；然后根据标准曲线计算步骤c所得荧光强度的花色苷浓度，用生物利用度=花色苷浓度X样品体积计算花色苷在靶细胞的生物利用度。本发明中，pH=3 3. 5的甲醇溶液的配制方法取分析纯甲醇溶液200mL，用浓度为 IM的盐酸逐滴加入，至pH计测定溶液pH=3 3. 5即得。进一步，所述步骤a是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶细胞中至花色苷终浓度为I 200 μ M，在37°C、100%饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养至少I小时。进一步，所述步骤a是用终浓度为50-200 μ M的花色苷处理靶细胞。进一步，所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化是用质量分数为O. 25% O. 5%的胰蛋白酶消化；
进一步，所述破碎细胞为在功率为IOOW的超声破碎仪中超声至少10分钟；所述离心为在温度为4°C、12000转/分钟条件下离心10分钟。进一步，所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化后，破碎细胞前还包括如下步骤，离心收集收集细胞，加入lmL，pH=3. O的甲醇溶液重悬细胞，准确收集I X IO6个细胞。进一步，所述步骤d中，所述浓度梯度的标准液是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷浓度分别为 O. I μ M, I μ M, 5 μ M, 10 μ M, 20 μ M, 40 μ M, 80 μ Μ, 160 μ M 320 μ M的标准液。进一步，所述靶细胞为血管内皮细胞，小肠上皮细胞，肝细胞或肿瘤细胞。进一步，所述花色苷为飞燕草素或矢车菊素。本方法的有益效果在于本发明公开了检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法， 利用了花色苷的自发荧光特性，运用荧光分光光度计检测花色苷在体内靶细胞的荧光强度，经过计算得出花色苷在靶细胞的生物利用率，该方法操作简单，检测时间短，检测线性范围宽，每IO6个细胞最低检测浓度低至O. Inmol,最高检测浓度达IOOnmol,结果准确性高，灵敏度高，重复性好，为进一步研究花色苷的亚细胞定位分布、生物学活性和作用机制奠定了基�。蔽梅肿有奘窝兄凭哂凶橹邢蛐缘闹瘟埔┪锾峁├砺垡谰�。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图I为本发明突光分光光度计对飞燕草素(delphinidin)的全波长扫描图。图2为本发明飞燕草素在血管内皮细胞生物利用度。图3为本发明飞燕草素在小肠上皮细胞的生物利用度。图4为本发明矢车菊素在肝细胞的生物利用度。图5为本发明飞燕草素在肿瘤细胞的生物利用度。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。本方法主要利用花色苷的自发荧光特性，运用荧光分光光度计检测花色苷在体内靶组织的生物利用度。实施例I、花色苷荧光标准曲线的建立
对花色苷单体飞燕草素(delphinidin)全波长扫描结果如图I所示，结果显示花色苷在350 500nm均有吸收，最大接收波长为379nm。将飞燕草素溶于pH=3 3. 5的甲醇溶液中，配制成浓度分别为 O. I μ M，I μ M，5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ M，80 μ Μ, 160 μ M 和 320 μ M 的标准液，利用荧光分光光度计在激发波长315nm，最大接收波长379nm条件下，分别测不同浓度飞燕草素的荧光强度，以浓度为横坐标荧光强度为纵坐标建立飞燕草素荧光标准曲线。利用SPSS13. O软件进行回归分析，回归方程为Y = 3. 203X + 9. 116，其中Y表示荧光强度，X表示飞燕草素终浓度。实施例2、荧光分光光度计测定花色苷在血管内皮细胞的生物利用度
将血管内皮细胞EA. hy926接种至活细胞培养皿，并向培养皿中加入花色苷至花色苷终浓度分别为I μ M，50 μ M，100 μ Μ, 150 μ M和200 μ Μ,然后在温度为37°C、100%饱和湿度、 CO2体积分数为5%的培养箱中培养，在I小时后取样；所取样品用冰冷的PBS洗涤两次，再用质量分数为O. 25%的胰蛋白酶消化，离心，去上清，收集细胞，加入lmL, ρΗ=3. O的甲醇溶液，重悬细胞，并利用细胞密度计数仪计数细胞密度，然后准确收集I X IO6个细胞，充氮气后，盖上EP管盖，在功率为100W的超声破碎仪中超声15分钟，破碎细胞；再在温度为4°C、 12000转/分钟条件下离心10分钟，取上清液，重复此步骤两次。将收集的上清液，以氮气干燥，加入600 μ L的ρΗ=3的甲醇溶液，用荧光分光光度计，在激发波长为315nm，飞燕草素最大接收波长为379nm处，测定花色苷荧光强度，结果如表I所示。根据飞燕草素的荧光标准曲线Y = 3. 203X + 9. 116，计算飞燕草素在血管内皮细胞的浓度，再由如下公式飞燕草素在内皮细胞的生物利用度(nmol/106个细胞)=飞燕草素在血管内皮细胞的浓度X样品体积，计算飞燕草素在内皮细胞的生物利用度，结果如图2所示。由图2可知，在处理I小时后，用浓度为50 μ M飞燕草素处理的血管内皮细胞EA. hy926，飞燕草素能够被利用，并随着飞燕草素的浓度升 高，飞燕草素的生物利用度逐渐升高。
表I、不同浓度的飞燕草素在血管内皮细胞荧光强度瓦浓度(μ M) j飞燕草素的荧光强度( ο6个细胞) _
权利要求
1.检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于，包括以下步骤a.用终浓度为I 200μ M的花色苷处理靶细胞，得处理靶细胞；b.将步骤a所得处理靶细胞先用PBS洗涤，再用胰蛋白酶消化，计数细胞，然后破碎细胞，最后离心收集上清液，备用；c.将步骤b所得上清液用氮气干燥，干燥后溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，测定在最大接收波长的突光强度；d.准确称取花色苷，溶于pH=3 3.5的甲醇溶液中，配置成浓度梯度的标准液，然后测定标准液在最大接收波长的荧光强度，根据标准液浓度和荧光强度绘制标准曲线；然后根据标准曲线计算步骤c所得荧光强度的花色苷浓度，用生物利用度=花色苷浓度X样品体积计算花色苷在靶细胞的生物利用度。
2.根据权利要求I所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述步骤a是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液中，然后加入靶细胞中至花色苷终浓度为I 200 μ M，在37°C、100%饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养至少I小时。
3.根据权利要求2所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述步骤a是用终浓度为50-200 μ M的花色苷处理靶细胞。
4.根据权利要求I所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化是用质量分数为O. 25% O. 5%的胰蛋白酶消化。
5.根据权利要求I所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述破碎细胞为在功率为100W的超声破碎仪中超声至少10分钟；所述离心为在温度为4°C、 12000转/分钟条件下离心10分钟。
6.根据权利要求I所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述步骤b中，所述胰蛋白酶消化后，还包括如下步骤，离心收集收集细胞，加入ImL, pH=3.0的甲醇溶液重悬细胞，准确收集I X IO6个细胞。
7.根据权利要求I所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述步骤d中，所述浓度梯度的标准液是将花色苷溶于pH=3的甲醇溶液，配制成花色苷浓度分别为 O. I μ M，I μ M，5 μ M，10 μ M，20 μ M，40 μ M，80 μ Μ, 160 μ M 和 320 μ M 的标准液。
8.根据权利要求1-7任一项所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述靶细胞为血管内皮细胞，小肠上皮细胞，肝细胞或肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，其特征在于所述花色苷为飞燕草素或矢车菊素。
全文摘要
本发明公开了检测花色苷在靶细胞生物利用度的方法，具体为，用终浓度为1～200μM的花色苷处理靶细胞，得处理靶细胞；将所得处理靶细胞先用PBS洗涤，再用胰蛋白酶消化，然后破碎细胞，最后离心收集上清液；将所得上清液用氮气干燥，干燥后溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，测定在最大接收波长的荧光强度；准确称取花色苷，溶于pH=3～3.5的甲醇溶液中，配置成浓度梯度的标准液，然后测定标准液在最大接收波长的荧光强度，根据标准液浓度和荧光强度绘制标准曲线；然后根据标准曲线计算靶细胞的花色苷浓度，最后计算花色苷在靶细胞的生物利用度；利用本发明公开的方法可以用于检测花色苷在靶细胞中的生物利用度，具有广泛的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102721675SQ201210165840
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者易龙, 糜漫天, 金鑫, 陈明亮 申请人:中国人民解放军第三军医大学
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