一种电化学免疫传感器及制备方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种电化学免疫传感器及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种电化学免疫传感器的制备方法，尤其涉及一种通过碳金键固定金纳米颗粒增强稳定性的电化学免疫传感器电化学免疫传感器的制备方法，属于传感器技术领域。
背景技术：
电化学免疫法由于其具有较高的灵敏度，较低的检出限以及较短的分析时间而受到广发的关注。然而制约电化学免疫传感器发展的一个重大问题就是其稳定性。由于纳米技术的迅猛发展，人们发现将纳米技术运用于电化学免疫传感器可以进一步改善其性质。其中金颗纳米粒因其具有合成简便、比表面积大和吸附能力强的优势而受到人们的格外关注。近年来随着纳米技术的发展，纳米材料由于其本身独特的物理和化学性质被广泛应用于免疫传感器的制备。而众多的纳米材料中，金颗纳米粒因其具有合成简便、比表面积大和吸附能力强的优势而受到人们的格外关注。金纳米颗粒良好的生物相容性和电子传导能力可以在电极表面提供一个温和的不受限制的微环境促进表面生物分子和电极之间的电子传递，从而使其常作为一种膜修饰材料而被用于电化学免疫传感器的构建[Xu, H. ; Hong, R. ;ffang, X. Y. ; Arvizo, R. ; You, C. C. ; Samanta, B. ; Patra, D. ; Tuominen, Μ·. T. ;Rotello, V. Μ. Adv. Mater. 2007，19，1383-1386]。然而，含有金纳米颗粒的修饰膜的长期稳定性是其进一步应用中一个亟待解决的问题。常见的固定金纳米颗粒方法有静电吸引法、包埋法以及利用化学键(S-Au、NH-Au键)的方法[1_7]。这些方法存在着以下一些缺点I)对基底物质的附着力不够(包埋法、S-AiuNH-Au键法);2)在特定的化学环境里不稳定(静电吸引法、包埋法);3)金纳米颗粒固定的多少及方向不可控(包埋法、S-AiuNH-Au键法)以及4)固定金纳米颗粒的用时太长(静电吸引法)。因此，需要找到一种新型的固定方法以解决这些问题。
[I] Wang, Y. ; Tang, Z. Y. ; Correa-Duarte, M. A. ; Liz-Marzan, L. M. ; Kotov, N. A. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2830 - 2831.
[2] Xu, H. ; Hong, R. ;ffang, X. Y. ; Arvizo, R. ; You, C. C. ; Samanta, B. ; Patra, D. ; Tuo minen, M. T. ; Rotello, V. M. Adv. Mater. 2007, 19, 1383 - 1386.
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所以，本发明的目的在于找到一种新的固定方法以解决含有金纳米颗粒修饰膜的3电化学免疫传感器的长期稳定性的问题。该方法可稳定、快速、简便的将金纳米颗粒固定到玻碳电极表面。发明内容
本发明提出了一种以碳金键固定金纳米颗粒以增强稳定性的电化学免疫传感器的制备方法。本发明的特点是该电化学免疫传感器具有良好的稳定性及重现性、较广的线性范围、较低的检出限以及简单快速的制备方法。
一种电化学免疫传感器，其特征在于，玻碳电极通过-Ph-与金纳米颗粒通过化学键固定连接在一起，在修饰有金纳米颗粒的玻碳电极上修饰有抗体，同时封端的还有牛血清蛋白。
一种电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，是通过碳金键固定金纳米颗粒增强稳定性的电化学免疫传感器的制备方法，具体包括以下步骤
(I)制备5 65nm的金纳米颗粒溶胶溶液，可参见参照文献Nature (1973，241，20)；
(2 )将对苯二胺 H2N-Ph-NH2 溶于 O. 5 5M HCl 中形成 H2N-Ph-NH2 的 HCl 溶液， H2N-Ph-NH2的浓度为flOmM，然后与浓度为flOmM NaNO2溶液混合，在冰水浴中、氮气保护下反应1(Γ20分钟，其中H2N-Ph-NH2的HCl溶液与NaNO2溶液的体积比为(5 10 ): (1(T20);将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描；此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2 ；
(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入NaNO2和HCl的混合溶液中反应15 25分钟，NaNO2和HCl的混合溶液是由浓度为IOmM的NaNO2和浓度为O. 5 5M HCl按照体积比为(f 10):(广20)混合得到的；接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/ AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-O. 8V间进行循环伏安扫描。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。
(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上一层含有抗体的磷酸盐缓冲液，其中含有抗体的磷酸盐缓冲液中抗体的浓度为O. riOmg ml/1，磷酸盐缓冲液浓度为O. Γ1Μ, pH为6. 5^7. 5 ;然后放置在4°C下孵化6 12小时；再将该电极侵入浓度为IiTlOOmg mL-1的牛血清蛋白(BSA)溶液中常温封闭f 3小时，即可制备得所需电化学免疫传感器。
上述方法所用的牛血清蛋白(牛血清白蛋白)以及抗体没有特殊的要求，均可经过市售的得到。
上述步骤(2)和(3)的循环伏安扫描是常规的，一般为广20圈，扫速为5(T200mV s_\优选5圈，扫速为IOOmV S—1。
将上述得到的电化学免疫传感器作为工作电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在PB-[Fe (CN)6]4_/3_ (O. Γ1Μ pH 6. 5 7. 5的PB溶液含有浓度为 5^50mM[Fe (CN) 形成的溶液)电解液中对抗原进行电化学检测。
上述的电化学检测手段为差分脉冲伏安法。
本发明的创新点在于通过两次叠氮化反应将金纳米颗粒固定在玻碳电极上。先通过一端的叠氮化反应将H2N-Ph-NH2修饰到玻碳电极上，由于两者之间是依靠碳碳键，所以连接很稳定。然后将H2N-Ph-NH2另一端剩余的氨基与金颗粒也进行叠氮化反应，这样金纳米颗粒就通过碳金键固定在玻碳电极上。数据显示S-Au键和NH-Au键的键能分别为 154. 4kJ πιοΓ1和153. 6kJ πιοΓ1,远远小于碳金键的键能(317. IkJ πιοΓ1)。因此碳金键的使用增强了含有金纳米颗粒的修饰膜的稳定性，在此基础上制备的电化学免疫传感器具有较长的使用寿命。
本发明的优点1) 一种简单快速的将金纳米颗粒牢固修饰在玻碳电极上的方法;2)在用以该方法固定的含有金颗粒的修饰膜构建电化学免疫传感器后，能显著提高传感器的稳定性。
本发明的目的在于解决长期存在于电化学免疫传感器中的修饰膜稳定性的问题，该问题的解决可以进一步促进电化学免疫技术的临床应用。本发明提出的固定含有金纳米颗粒的修饰膜的方法具有稳定性强、简单快速、重现性好以及易于操作等有点。本发明制备电化学免疫传感器具有良好的稳定性及重现性、较广的线性范围和较低的检出限。
本发明利用碳金键将金纳米颗粒固定到玻碳电极表面从而增强了该修饰膜的稳定性。在此基础上制备了用于检测抗原的电化学免疫传感器。该电化学免疫传感器有良好的稳定性及重现性、较广的线性范围、较低的检出限。这种电化学免疫传感器的制备方法可以广泛应用于其他生物分子的检测。

图I电化学免疫传感器制备示意图2实施例I所得免疫球蛋白G电化学检测的曲线图3实施例2癌胚抗原电化学检测的曲线图4实施例3甲胎蛋白电化学检测的曲线图5实施例4前列腺特异抗原抗原电化学检测的曲线图。
具体实施方式
实施例I :通过碳金键固定5nm金纳米颗粒制备成的免疫球蛋白G(IgG)电化学免疫传感器
(I)参照文献Nature (1973，241，20)的办法制备5nm的金纳米颗粒溶胶溶液；
(2)取 5mL H2N-Ph-NH2 (ImM,溶于 O. 5M HCl)与 IOmL NaNO2 (ImM)混合，在冰水浴中、氮气保护下反应15分钟。将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾Ag/ AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描(I圈，扫速为50mV s—1)。此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2。
(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入ImL NaNO2(ImM)和2mL HCl (O. 5M)的混合液中，反应15分钟。接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在0.6到-O. 8V间进行循环伏安扫描(I圈，扫速为50mV s—1)。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。
(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上anti-IgG (O. Img ml/1，溶于O. IM pH 6. 5的PB溶液，其中anti-IgG购自西安成文生物科技有限公司)，放置在4°C下孵化6小时。再将该电极侵入IOmgmr1BSA(BSA购自北京欣经科生物技术有限公司)溶液中常温封闭I小时。即可制备得所需电化学免疫传感器。
将步骤(4)中得到的电化学免疫传感器作为工作电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在PB-[Fe(CN)6]4_/3_电解液中对免疫球蛋白G进行电化学检测。
上述电化学检测手段为差分脉冲伏安法。其检测的校正曲线见附图2。该电化学免疫传感器的线性范围是IOfg IOOng ml/1，最低检出限达SfgmL'
实施例2 :通过碳金键固定15nm金纳米颗粒制备成的癌胚抗原(CEA)电化学免疫传感器
(I)参照文献Nature (1973，241，20)的办法制备15nm的金纳米颗粒溶胶溶液；
(2)取 6mL H2N-Ph-NH2 (5mM，溶于 0.5M HCl)与 IOmL NaNO2 (5mM)混合，在冰水浴中、氮气保护下反应15分钟。将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾 Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描(5圈，扫速为 IOOmV S—1)。此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2。
(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入4mL NaNO2 (5mM)和8mL HCl (2. 5M)的混合液中，反应20分钟。接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-O. 8V间进行循环伏安扫描(5圈，扫速为IOOmV S—1)。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。
(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上癌胚抗体 (O. 2mg ml/1，溶于O. IM pH 7. 3的PB溶液，癌胚抗体购自北京博奥森生物技术有限公司)，放置在4°C下孵化8小时。再将该电极侵入BSA(50mg mL—1)溶液中常温封闭2小时。即可制备得所需电化学免疫传感器。
将步骤(4)中得到的电化学免疫传感器作为工作电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在PB-[Fe(CN)6]4_/3_电解液中对癌胚抗原进行电化学检测。
上述电化学检测手段为差分脉冲伏安法。其检测的校正曲线见附图3。该电化学免疫传感器的线性范围是IOfg IOOng ml/1，最低检出限达SfgmL'
实施例3 :通过碳金键固定45nm金纳米颗粒制备成的甲胎蛋白(AFP)电化学免疫传感器
(I)参照文献Nature (1973，241，20)的办法制备45nm的金纳米颗粒溶胶溶液；
(2)取 IOmL H2N-Ph-NH2 (10mM，溶于 5M HCl)与 20mL NaNO2(IOmM)混合，在冰水浴中、氮气保护下反应20分钟。将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾Ag/ AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描(10圈，扫速为 150mV s—1)。此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2。
(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入IOmL NaNO2 (IOmM)和20mL HCl (5M)的混合液中，反应25分钟。接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-O. 8V间进行循环伏安扫描(10圈，扫速为150mV s—1)。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。
(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上甲胎蛋白抗体(lmg ml/1，溶于IM pH 7. 5的PB溶液，甲胎蛋白抗体购自上海领潮生物科技有限公司)，放置在4°C下孵化12小时。再将该电极侵入BSA(IOOmg mL—1)溶液中常温封闭3小时。即可制备得所需电化学免疫传感器。
将步骤(4)中得到的电化学免疫传感器作为工作电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在PB-[Fe(CN)6]4_/3_电解液中对甲胎蛋白进行电化学检测。
上述电化学检测手段为差分脉冲伏安法。其检测的校正曲线见附图4。该电化学免疫传感器的线性范围是IOfg IOOng mr1，最低检出限达SfgmL'
实施例4 :通过碳金键固定65nm金纳米颗粒制备成的前列腺特异抗原(PSA)电化学免疫传感器
(I)参照文献Nature (1973，241，20)的办法制备65nm的金纳米颗粒溶胶溶液；
(2)取 6mL H2N-Ph-NH2 (ImM,溶于 O. 5M HCl)与 IOmL NaNO2 (ImM)混合，在冰水浴中、氮气保护下反应15分钟。将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾Ag/ AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描(20圈，扫速为 200mV s—1)。此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2。
(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入4mL NaNO2(ImM)和8mL HCl (O. 5M)的混合液中，反应20分钟。接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-O. 8V间进行循环伏安扫描(20圈，扫速为200mV s—1)。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。
(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上前列腺特异抗体(lmg ml/1，溶于O. IM pH 7. 3的PB溶液，前列腺特异抗体购自北京博奥森生物技术有限公司)，放置在4°C下孵化10小时。再将该电极侵入BSA(50mg mL—1)溶液中常温封闭I小时。即可制备得所需电化学免疫传感器。
将步骤(4)中得到的电化学免疫传感器作为工作电极，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在PB-[Fe(CN)6]4_/3_电解液中对前列腺特异抗原进行电化学检测。
上述电化学检测手段为差分脉冲伏安法。其检测的校正曲线见附图5。该电化学免疫传感器的线性范围是IOfg IOOng mr1，最低检出限达AfgmL'
权利要求
1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，玻碳电极通过-Ph-与金纳米颗粒通过化学键固定连接在一起，在修饰有金纳米颗粒的玻碳电极上修饰有抗体，同时封端的还有牛血清蛋白。
2.一种电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，是通过碳金键固定金纳米颗粒增强稳定性的电化学免疫传感器的制备方法，具体包括以下步骤(1)制备5飞5nm的金纳米颗粒溶胶溶液；(2)将对苯二胺H2N-Ph-NH2 溶于 O. 5 5M HCl 中形成 H2N-Ph-NH2 的 HCl 溶液，H2N-Ph-NH2的浓度为flOmM，然后与浓度为flOmM NaNO2溶液混合，在冰水浴中、氮气保护下反应10^20分钟，其中H2N-Ph-NH2的HCl溶液与NaNO2溶液的体积比为(5 10): (10 20);将打磨干净的玻碳电极放入该混合液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-I. OV间进行循环伏安扫描；此时玻碳电极表面通过碳碳键修饰上了 -Ph-NH2 ；(3)将步骤(2)中得到的玻碳电极浸入NaNO2和HCl的混合溶液中反应15 25分钟，NaNO2和HCl的混合溶液是由浓度为IOmM的NaNO2和浓度为O. 5 5M HCl按照体积比为(Γ10) ( Γ20)混合得到的；接着将该电极放入金纳米颗粒溶液中，以饱和氯化钾Ag/AgCl为参比电极、钼电极为对电极，在O. 6到-O. 8V间进行循环伏安扫描。此时金纳米颗粒就通过碳金键固定在了玻碳电极表面。(4)在步骤(3)中得到的已经修饰了金纳米颗粒的玻碳电极上滴涂上一层含有抗体的磷酸盐缓冲液，其中含有抗体的磷酸盐缓冲液中抗体的浓度为O. riOmg ml/1，磷酸盐缓冲液浓度为O. Γ1Μ, pH为6. 5^7. 5 ;然后放置在4°C下孵化6 12小时；再将该电极侵入浓度为KTlOOmg ml/1的牛血清蛋白(BSA)溶液中常温封闭f 3小时。
全文摘要
一种电化学免疫传感器及制备方法，属于传感器技术领域。玻碳电极通过-Ph-与金纳米颗粒固定连接，在其上修饰有抗体，同时封端的还有牛血清蛋白。首先制备金纳米颗粒溶胶溶液，将H2N-Ph-NH2的HCl溶液和NaNO2溶液混合反应；将玻碳电极放入该混合液中，进行循环伏安扫描，修饰上-Ph-NH2；然后浸入NaNO2和HCl的混合液中，接着放入金纳米颗粒溶液中，再进行循环伏安扫描，修饰上金纳米颗粒；在其上滴涂含有抗体的磷酸盐缓冲液4℃下孵化，最后侵入牛血清蛋白溶液中常温封闭。本发明电化学免疫传感器具有良好的稳定性及重现性、较广的线性范围、较低的检出限以及简单快速的制备方法。
文档编号G01N27/48GK102928497SQ20121040132
公开日2013年2月13日申请日期2012年10月19日优先权日2012年10月19日
发明者马占芳, 孙晓斌申请人:首都师范大学

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一种电化学免疫传感器及制备方法