专利名称：人rtn4b蛋白和编码序列,及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人RTN4B的cDNA序列，该蛋白是人RTN家族的成员RTN4的一个异构体。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和多肽的应用，尤其在检测肝癌的方法和试剂盒。
RTN家族是一个近年来所发现的新的基因家族。其中神经内分泌特异性蛋白NSP(neuroendocrine-specific protein)后被统一命名为RTN1，是该家族的第一个成员。RTN1具有3个转录本，分别长3.4Kb,2.3Kb和1.8Kb。其相应的cDNA NSPA、NSPB、NSPC(分别编码长度为776、356、208个氨基酸的蛋白质)已相继被分离出。同样的，RTN1基因的基因组结构也被阐明。三个RTN1/NSP蛋白质异构体拥有各自独有的氨基末端，但有相同的羧基末端。实验已证明这三种转录本的存在可能不是由于外显子的变异剪接所造成的，而是因为存在着多个启动子。RTN1/NSP的共同羧基末端带有2个穿膜结构域，实验表明它们在联系蛋白和内质网中扮演着重要的角色。
根据NSP基因组序列、cDNA序列和核酸序列数据库比较，发现了另外三个人RTN家族成员(NSP类基因Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。其中两个(NSP-like基因Ⅰ,Ⅱ)相继被克隆，并被命名为RTN2和RTN3。RTN2同样有三个C-末端相同的异构体。但RTN3至今没有发现变异剪接本。值得注意的是，RTN2和RTN3的C-末端也发现了两个独立的穿膜区域，这被认为与内质网的联系相关。
至今，RTN家族的功能仍不十分清晰。但有报道发现RTN1/NSP异构体可作为区别小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(non-SCLC)的独立标志物。NSPA在SCLC肿瘤细胞中存在，而non-SCLC肿瘤中不存在。通过以NSP异构体为标志物，还可区别一般non-SCLC肿瘤和有神经内分泌分化的non-SCLC。
RTN4是人RTN家族中新近发现的又一个成员。它类似于RTN1和RTN2，同样有C-末端相同的三个异构体(即RTN4A,4B,4C)。RTN4异构体与RTN1/NSP,RTN2,RTN3异构体一样有着共同的C-末端，并且四者的C-末端都有高度同源性。这预示着它如RTN1一样，在联系蛋白与内质网中扮演了重要的角色。RTN4与人其他RTN的N-端无明显的同源性(＜40％)，但是这些区域具有与RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，这一区域发现富含碱性氨基酸残基，脯氨酸和丝氨酸。此外，在这些区域中还发现了大量的蛋白磷酸化位点。并且有报道发现体内RTN1A和RTN1B确实是被磷酸化的。RTN4A,4B,4C的理论等电点分别是4.43，4.71和9.32，这与RTN1,RTN2预计的等电点基本相似。RH定位实验揭示RTN4位于标记物D2S1786和D2S2002之间，距离D2S1786有72.9cR值。
肝癌是一种严重威胁人类健康和寿命的疾病。然而，目前还缺乏有效、简便的检测肝癌的方法和试剂盒本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码人RTN家族的成员RTN4的一个异构体，本发明的RTN4的异构体被命名为人RTN4B。
本发明的另一个目的是提供一种新的人的RTN家族成员，该蛋白被命名为人RTN4B蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的RTN4B多肽的方法。
本发明还提供了这种人的RTN4核酸序列和多肽的应用，尤其在肝癌检测方面的应用。
本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO:4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人RTN4B蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO:4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人RTN4B蛋白活性的多肽的方法，该方法包括
(a)将编码具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人RTN4B蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人RTN4B蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人RTN4B蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人RTN4B蛋白活性的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种检测肝细胞是否发生癌变的方法，该方法包括检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白就表明该肝细胞发生了癌变。在一个实施例中，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B蛋白，它包括步骤将肝癌细胞样品与抗RTN4B的特异性抗体接触；检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示该肝细胞发生了癌变。
在另一实施例中，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本，它包括步骤用RTN4B特异性引物，用RT-PCR法扩增该肝细胞的mRNA；检测是否有预计RTN4B扩增产物，存在扩增产物就表示该肝细胞发生了癌变。
在另一实施例中，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本，它包括步骤用RTN4B特异性探针，与该肝细胞的cDNA样品杂交；检测是否有杂交产物，存在杂交产物就表示该肝细胞发生了癌变。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有(1)特异性扩增人RTN4B的引物对，(2)任选的逆转录mRNA所需的试剂。另一种检测肝癌的试剂盒，含有针对人RTN4B的特异性的抗体。另一种检测肝癌的试剂盒，含有可特异性地与人RTN4B的mRNA杂交的探针。
在本发明的分离出的人RTN4B多核苷酸全长为781个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO:3，其中开放读框位于5-1126位核苷酸。编码的人RTN4B蛋白全长为373个氨基酸，序列见SEQ ID NO:4。通过研究，本发明的发明人意外地发现，RTN4B蛋白在正常的肝细胞中是不表达的，但是在癌变的肝细胞中RTN4B却表达。在此发现的基础上，本发明人完成了本发明。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人RTN4B蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3中5-1126位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO:3序列的编码框5-1126位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO:3中5-1126位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO:4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人RTN4B相同功能的蛋白的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5＇和/或3＇端添加数个核苷酸。本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人RTN4B蛋白多肽”指具有人RTN4B蛋白活性的SEQ IDNO:4序列的多肽。该术语还包括具有与人RTN4B相同功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人RTN4B蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人RTN4B DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人RTN4B多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人RTN4B多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人RTN4B多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人RTN4B多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人RTN4B蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人RTN4B多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“人RTN4B保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明还包括人RTN4B多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人RTN4B的表达。例如用于抑制肝癌细胞中RTN4B的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人RTN4B多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人RTN4B的核酸分子。
本发明还包括检测人RTN4B核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人RTN4B多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
由于在肝细胞中，RTN4B的表达是肝细胞发生癌变的标志，因此可以通过检测肝细胞中是否有RTN4B的转录本或RTN4B蛋白来确定肝细胞是否发生了癌变。
在知晓了某基因与某疾病的相关性，本领域有许多现有的检测技术可供使用，不同点仅在于所用的引物和/或探针具有衍生自RTN4B的核苷酸序列，或者所用的抗体是对RTN4B蛋白特异性的抗体。
作为例举，一种检测肝细胞是否发生癌变的方法，包括检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白就表明该肝细胞发生了癌变。具体地，(1)当通过检测肝细胞中是否存在RTN4B蛋白，通常包括步骤将肝癌细胞样品与抗RTN4B的特异性抗体接触；检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示该肝细胞发生了癌变。(2)当通过检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本时，它通常包括步骤用RTN4B特异性引物，用RT-PCR法扩增该肝细胞的mRNA；检测是否有预计RTN4B扩增产物，存在扩增产物就表示该肝细胞发生了癌变(PCR扩增法)。或者，它包括步骤用RTN4B特异性探针，与该肝细胞的cDNA样品杂交，检测是否有杂交产物，存在杂交产物就表示该肝细胞发生了癌变(杂交法)。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人RTN4B DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人RTN4B基因产物或片段。较佳地，指那些能与人RTN4B基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人RTN4B蛋白的分子，也包括那些并不影响人RTN4B蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人RTN4B基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人RTN4B基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人RTN4B或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495,1975；Kohler等人，Eur.J.Immuno1.6:511,1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人RTN4B功能的抗体以及不影响人RTN4B功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人RTN4B基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人RTN4B基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人RTN4B核苷酸全长序列或其片段通�？梢杂肞CR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明蛋白的片段除了可用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co.,San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85:2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City,CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人,Human Chromosomes:A Manual ofBasic Techniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。
接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RTN4B发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人RTN4B蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人RTN4B蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的人RTN4B蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
在本发明中，人RTN4B的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人体肝组织的cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物—A:5＇-AGCCATGGAAGACCTGGACCAG-3＇为正向引物，寡核苷酸B:5＇-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCTGAC-3′为反向引物，进行PCR，顺利有效扩增约1400bp片段。再设计双向引物，扩增测序，我们获得了一个1216bp长度的cDNA顺序，见SEQID NO:3的全长cDNA序列。
实验证明，RTN4B基因的转录本只在肝癌组织中被检测到，而在癌旁组织中无表达。这说明了RTN4B是一种肝癌组织中特异表达的基因，从而为检测人肝是否发生癌变提供了一种可行而有效的标志物。
此外，由于本发明的人RTN4B具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
在附图中，
图1为本发明的人RTN4与RTN2、RTN3、NSP蛋白的C末端的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸用黑色阴影标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人RTN4B的cDNA序列的克隆和测定1．引物扩增以人体肝组织的cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物—A:5′-AGCCATGGAAGACCTGGACCAG-3′(SEQ ID NO:1)为正向引物，寡核苷酸B:5′-GTCAAGGTTCGTTCTTCCCTGAC-3′(SEQ ID NO:2)为反向引物，进行PCR，顺利有效扩增约1400bp片段。
2．PCR产物的测序将上述PCR扩增产物AB与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1216bp，详细序列见SEQID NO:3，其中开放读框位于5-1126位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人RTN4B的氨基酸序列，共373个氨基酸残基，其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:4)。
MEDLDQSPLV SSSDSPPRPQ PAFKYQFVRE PEDEEEEEEE EEEDEDEDLE 50ELEVLERKPA AGLSAAPVPT APAAGAPLMD FGNDFVPPAP RGPLPAAPPV 100APERQPSQDP SPVSSTVPAP SPLSAAAVSP SKLPEDDEPP ARPPPPPPAS 150VSPQAEPVWT PPAPAPAAPP STPAAPKRRG SSGSVVVDLL YWRDIKKTGV 200VFGASLFLLL SLTVFSIVSV TAYIALALLS VTISFRIYKG VIQAIQKSDE 250GHPFRAYLES EVAISEELVQ KYSNSALGHV NCTIKELRRL FLVDDLVDSL 300KFAVLMWVFT YVGALFNGLT LLILALISLF SVPVIYERHQ AQIDHYLGLA 350NKNVKDAMAK IQAKIPGLKR KAE 373373个氨基酸(不包括终止密码子)实施例2同源比较用本发明的人RTN4B的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，同源蛋白比较支持序列比较的正确，在氨基酸水平上RTN4B推导蛋白的C-末端与NSPC,RTN2,RTN3均有较高的同源性，其186-373氨基酸与NSPC,RTN2,RTN3等同一率分别达到66％,50％和60％，相似率分别达82％,70％和80％(图1)。同时在PRODOM软件分析后，在RTN4B的C-末端还发现两个独立的穿膜区域，分别是119-235位氨基酸GVVFGASLFLLLSLTVFSIVSVTAYIALALLSVTISF，和302-336位氨基酸FAVLMWVFTYVGALFNGLTLLILALISLFSVPVIY，表明该蛋白在联系蛋白和内质网中扮演着重要的角色。这种特性在RTN家族其他成员中也存在。但RTN4B与人其他RTN的N-端无明显的同源性(＜40％)。但是这些区域具有与RTN1和RTN2相似的一些特性，例如，这一区域发现富含碱性氨基酸残基，脯氨酸和丝氨酸。此外，在这些区域中还发现了大量的蛋白磷酸化位点。
本发明的人RTN4B除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人RTN4B还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人RTN4B的N端与鼠的RTN4B的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
本发明的人RTN4B还可用于筛选抑制本发明蛋白活性的拮抗剂、或增强本发明蛋白活性的激动剂等。
针对本发明人RTN4B的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人RTN4B核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人RTN4B的表达水平或者抑制人RTN4B的过度表达。本发明的人RTN4B蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人RTN4B缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人RTN4在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人RTN4B的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人RTN4B cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-GACTGGATCCATGGAAGACCTGGACCAGT-3′(SEQ ID NO:5)，该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人RTN4B编码序列的19个核苷酸；3＇端引物序列为5＇-TTGGAAGCTT TCATTCAGCTTTGCGCTTC-3＇(SEQ ID NO:6)，该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人RTN4B的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHⅠ和HindⅢ消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4,其表达lacⅠ阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人RTN4B的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g,20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人RTN4B。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人RTN4B。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小(Mr)约为40318。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO:4的序列一致。
实施例4人RTN4B在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人RTN4B的cDNA序列用对应于该DNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人RTN4B cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5＇寡核苷酸引物序列为5＇-TCAGAAGCTT ATGGAAGACCTGGACCAGT-3＇(SEQ ID NO:7)该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人RTN4B编码序列的19个核苷酸；3＇端引物序列为5＇-TTGGGGATCC TCATTCAGCTTTGCGCTTC-3＇(SEQ ID NO:8)该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人RTN4B的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人RTN4B的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛�。占赴跋赴锨宀舛ū泶锏鞍酌富盍�。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris.HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris.HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris.HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小(Mr)约为40318。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO:4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人RTN4B基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。
实施例6RTN4B在正常人组织中的表达谱分析多种组织Northern(MTNTM)印迹膜(16种组织)购自Clontech公司，以引物A1(5＇-CGAACCTTGACGTTGCAGTGCAG-3′)和A2(5＇-GAAAACAGATGGTAGTGCTCCTAG-3＇)从人骨骼肌cDNA文库(Clontech)中扩增得到618bp的片段，以此片段为探针，用α-32p-dATP(DuPont公司)对其进行随机引物标记，条件为37℃1小时，具体操作见MegaprimeDNA标记系统说明书(Amersham)。Northern杂交按用户手册操作。主要步骤如下(1)配制MTN杂交液(终浓度如下5XSSPE,10Xdenhardt′s,100μg/mlCTDNA,50％甲酰胺，2％SDS),68℃预热杂交液，彻底溶解沉淀物。(2)烫膜，倒入少许烧开的0.05％SDS溶液于膜上，震荡、冷却后测信号(3)将尼龙膜放在杂交管中，加入预杂交液，42℃预杂交12小时(4)变性后探针加入杂交管中，42℃杂交24小时(5)洗膜，42℃，用2XSSC,0.05％SDS溶液洗两次，每次20分钟(6)用X光片进行放射自显影。
结果16种组织的Northern杂交结果显示出三条杂交带，长分别为5.0kb,2.5kb和1.8kb，对应与分别是RTN4A,RTN4B和RTN4C。RTN4B基因为广谱表达的转录本，在胸腺、前列腺、胎盘、卵巢、小肠、大肠、外周血白细胞、胎盘、肺、骨骼肌、肾及等15种组织中均有表达，表达量稍有差异。值得注意的是，RTN4B在肝组织中未见有表达。
RTN4A的表达非常有限，只在脑中被检测到，在睾丸中表达极低。
RTN4C在16种组织中的4种中有表达，分别是脑、肝、骨骼肌和肾，表达量在骨骼肌中最高，肝中最少。
实施例7RTN4B在肿瘤细胞株中的表达情况分析(1)．选取13种人肿瘤细胞株，分别是
A375(细胞色素瘤细胞)，BEL7402(肝癌细胞)，CNE(鼻咽癌细胞)，DAMI(单核细胞)，HEPB3(肝癌细胞)，K562(红白血病细胞)，L-02(变异肝细胞)，SH-77(小细胞肺癌细胞)，LTEPA2(肺腺癌细胞)，NCIH446(小细胞肺癌细胞)，NCIH460(大细胞肺癌细胞)，RAJI(淋巴癌细胞)，T24(膀胱癌细胞)培养细胞在含10％小牛血清和5％CO2的培养液中，37℃培养(培养液RPMI1640(LifeTechnologies)配方如下25mM HEPES,2mM L-glutamine,16mM NaHCO3),培养至汇片80％时传代。
(2)抽提RNA方法如下(采用LIFE TECHNOLOGIES公司的TRIZOL试剂)细胞株匀化加1mlTRIZOL试剂(每10cm2培养皿面积加1mlTRIZOL)在培养皿中直接溶解细胞株。
分相20℃培养匀化好的样品5分钟。每1ml的TRIZOL试剂加入0.2ml的氯仿，震荡且温浴2至3分钟，后在2-8℃，少于10,000xg离心15分钟。RNA此时位于水相。
RNA沉淀转移水相至一新管，通过混合异丙醇(每1ml的TRIZOl用0.5ml)使RNA从水相中沉淀下来，再在15-30℃温浴10分钟，后在2-8℃，少于10,000xg离心10分钟。RNA沉淀于管底。
洗涤RNA用75％的乙醇(每1mlTROZOL至少加1ml的乙醇)洗涤一次，混合后在2-8℃，少于7,500xg离心5分钟。
重新溶解RNA空气干燥RNA，用0.5％SDS溶液溶解RNA，然后在55-60℃温浴10分钟。
(3)Northern杂交方法与探针与实施例6一样。
13种肿瘤细胞株的Northern杂交结果显示RTN4B基因为在各种癌细胞株中的广谱表达基因，在细胞色素瘤、肝癌、鼻咽癌、单核细胞、红白血病、变异肝、小细胞肺癌、肺腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴癌、膀胱癌等13种细胞株中均有表达，表达量稍有差异。但比较在人正常组织和肿瘤细胞株中RTN4B的表达情况，可见明显的差异。在正常人的肝中只检测到1.8kb的转录本，而在BEL7402和L-02细胞株中同时检测到1.8和2.5kb的转录本，在HepG2中只检测到2.5kb的片段。
实施例8RTN4B在肝癌组织和癌旁组织中的表达分析组织总RNA的抽提匀化组织每50-100mg组织加1ml TRIZOL试剂，用玻璃匀浆器匀化组织。
以下方法和步骤与实施例7中抽提RNA相同。
Northern杂交方法与探针与实施例6一样。不同点仅在于其组织的种类及其RNA的抽提过程与实施例6不同。
结果肝癌组织和癌旁组织的Northern杂交结果显示RTN4B基因的转录本只在肝癌组织中被检测到，而在癌旁组织中无表达。这说明了RTN4B是一种肝癌组织中特异表达的基因，从而为检测人肝是否发生癌变提供了一种可行而有效的标志物。
实施例9试剂盒的制备试剂盒1它含有(1)特异性扩增人RTN4B的引物对，和使用说明。该试剂盒还可含有或不含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自SEQ ID NO:3的序列，长度为15-35。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有RTN4B的核酸序列。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。
此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于RTN4B的基因组序列将不产生扩增产物。
试剂盒2该试剂盒含有针对人RTN4B的特异性的抗体(例如实施例5中制备的多克隆抗体，或者用标准的杂交瘤技术产生的抗RTN4B的单克隆抗体)，和使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在RTN4B蛋白。先通过特异性免疫反应形成免疫复合物，然后用常规技术检测免疫复合物。
试剂盒3该试剂盒含有可特异性地与人RTN4B的mRNA杂交的探针。它还可含有或不含有杂交缓冲液。该试剂盒通过核酸分子与RTN4B特异性探针之间的杂交反应来检测样品中是否存在RTN4B的核酸分子。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ⅱ)发明名称人RTN4B蛋白和编码序列，及其制法和用途(ⅲ)序列数目8(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:AGCCATGGAA GACCTGGACC AG 22(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅱ)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2GTCAAGGTTC GTTCTTCCCT GAC 23(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1216bp(B)类型核酸(C)链性单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3AGCCATGGAA GACCTGGACC AGTCTCCTCT GGTCTCGTCC TCGGACAGCC CACCCCGGCC 60GCAGCCCGCG TTCAAGTACC AGTTCGTGAG GGAGCCCGAG GACGAGGAGG AAGAAGAGGA 120GGAGGAAGAG GAGGACGAGG ACGAAGACCT GGAGGAGCTG GAGGTGCTGG AGAGGAAGCC 180CGCCGCCGGG CTGTCCGCGG CCCCAGTGCC CACCGCCCCT GCCGCCGGCG CGCCCCTGAT 240GGACTTCGGA AATGACTTCG TGCCGCCGGC GCCCCGGGGA CCCCTGCCGG CCGCTCCCCC 300CGTCGCCCCG GAGCGGCAGC CGTCTTGGGA CCCGAGCCCG GTGTCGTCGA CCGTGCCCGC 360GCCATCCCCG CTGTCTGCTG CCGCAGTCTC GCCCTCCAAG CTCCCTGAGG ACGACGAGCC 420TCCGGCCCGG CCTCCCCCTC CTCCCCCGGC CAGCGTGAGC CCCCAGGCAG AGCCCGTGTG 480GACCCCGCCA GCCCCGGCTC CCGCCGCGCC CCCCTCCACC CCGGCCGCGC CCAAGCGCAG 540GGGCTCCTCG GGCTCAGTGG TTGTTGACCT CCTGTACTGG AGAGACATTA AGAAGACTGG 600AGTGGTGTTT GGTGCCAGCC TATTCCTGCT GCTTTCATTG ACAGTATTCA GCATTGTGAG 660CGTAACAGCC TACATTGCCT TGGCCCTGCT CTCTGTGACC ATCAGCTTTA GGATATACAA 720GGGTGTGATC CAAGCTATCC AGAAATCAGA TGAAGGCCAC CCATTCAGGG CATATCTGGA 780ATCTGAAGTT GCTATATCTG AGGAGTTGGT TCAGAAGTAC AGTAATTCTG CTCTTGGTCA 840TGTGAACTGC ACGATAAAGG AACTCAGGCG CCTCTTCTTA GTTGATGATT TAGTTGATTC 900TCTGAAGTTT GCAGTGTTGA TGTGGGTATT TACCTATGTT GGTGCCTTGT TTAATGGTCT 960GACACTACTG ATTTTGGCTC TCATTTCACT CTTCAGTGTT CCTGTTATTT ATGAACGGCA 1020TCAGGCACAG ATAGATCATT ATCTAGGACT TGCAAATAAG AATGTTAAAG ATGCTATGGC 1080TAAAATCCAA GCAAAAATCC CTGGATTGAA GCGCAAAGCT GAATGAAAAC GCCCAAAATA 1140ATTAGTAGGA GTTCATCTTT AAAGGGGATA TTCATTTGAT TATACGGGGG AGGGTCAGGG 1200AAGAACGAAC CTTGAC 1216(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度373个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser 15Pro Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu 30Pro Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 45Asp Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala 60Ala Gly Leu Ser Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly 75Ala Pro Leu Met Asp Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro 90Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln 105Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro 120Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu 135Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser 150Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr Pro Pro Ala Pro Ala 165Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly 180Ser Ser Gly Ser Val Val Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile 195Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu 210Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala 225Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile Tyr Lys Gly 240Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg 255Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln 270Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys 285Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu 300Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu 315Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe 330Ser Val Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His 345Tyr Leu Gly Leu Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys 360Ile Gln Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu 373(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GACTGGATCC ATGGAAGACC TGGACCAGT 29(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TTGGAAGCTT TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7TCAGAAGCTT ATGGAAGACC TGGACCAGT 29(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8TTGGGGATCC TCATTCAGCT TTGCGCTTC 29
权利要求
1．一种检测肝细胞是否发生癌变的方法，其特征在于，该方法包括检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白，存在RTN4B的转录本或RTN4B蛋白就表明该肝细胞发生了癌变。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B蛋白，它包括步骤将肝癌细胞样品与抗RTN4B的特异性抗体接触；检测是否形成了免疫复合物，形成免疫复合物就表示该肝细胞发生了癌变。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本，它包括步骤用RTN4B特异性引物，用RT-PCR法扩增该肝细胞的mRNA，检测是否有预计RTN4B扩增产物，存在扩增产物就表示该肝细胞发生了癌变。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法是通过检测肝细胞中是否存在RTN4B的转录本，它包括步骤用RTN4B特异性探针，与该肝细胞的cDNA样品杂交，检测是否有杂交产物，存在杂交产物就表示该肝细胞发生了癌变。
5．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码一多肽，该多肽具有SEQ IDNO:4所示的序列。
6．一种分离的人RTN4B蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
7．一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
8．一种用权利要求7所述载体转化的宿主细胞。
9．一种产生具有人RTN4B蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人RTN4B蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人RTN4B蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO:3中从核苷酸5-1126位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人RTN4B蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人RTN4B蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人RTN4B蛋白活性的多肽。
10．一种能与权利要求2所述的人RTN4B蛋白多肽特异性结合的抗体。
11．一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
12．一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
13．一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有(1)特异性扩增人RTN4B的引物对，(2)任选的逆转录mRNA的试剂。
14．一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有针对人RTN4B的特异性的抗体。
15．一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有可特异性地与人RTN4B的mRNA杂交的探针。
全文摘要
本发明提供了人RTN4B的cDNA序列,该蛋白是人RTN家族的成员RTN4的一个异构体。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,所述多核苷酸和所述多肽的生产方法,以及这些多核苷酸和多肽的应用,尤其在检测肝癌的方法和试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1311439SQ0011179
公开日2001年9月5日 申请日期2000年3月2日 优先权日2000年3月2日
发明者余龙, 傅强, 赵勇, 赵寿元 申请人:复旦大学
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
